基于網絡藥理學和實驗驗證探究大黃致肝毒性作用機制＊

王洪鑫，張石宇，2，金 陽，曹陶濤，秦 琴，劉 文，＊＊

（1.貴州中醫藥大學藥學院 貴陽 550025；2.貴州中醫藥大學第一附屬醫院 貴陽 550001；3.貴州醫科大學貴州省藥物制劑重點實驗室 貴陽 550004；4.貴州醫科大學藥學院 貴陽 550025）

中藥大黃源于蓼科植物掌葉大黃（Rheum palmatum L.）、唐古特大黃（Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.）或藥用大黃（Rheum officinale Baill.）的干燥根及根莖。大黃具“將軍”之稱，始載于《神農本草經》，具有瀉下攻積，清熱瀉火，涼血解毒，逐瘀通經，利濕退黃之功效，用于實熱積滯便秘，血熱吐衄，目赤咽腫，癰腫疔瘡，腸癰腹痛，瘀血經閉，產后瘀阻，跌打損傷，濕熱痢疾，黃疸尿赤，淋證，水腫；外用還可治燒燙傷[1]。除傳統功效外，現代藥理學研究表明大黃還具有廣泛的抗腫瘤、抗菌抗炎與調節免疫系統等作用[2-5]。

隨著大黃在臨床上使用越來越廣泛，使得誤用和濫用情況屢見不鮮，尤其是長期或大量使用大黃導致的不良反應較為嚴重。隨著其不良反應事件的增多，大黃越來越受到國內外的關注。一項針對187例中草藥相關肝損傷（Herb induced liver injury，HILI）的前瞻性研究報道稱，在導致HILI的中藥湯劑及中成藥組方中，大黃排在第3位[6]。有學者對香港瑪麗皇后醫院的45名慢性乙型肝炎患者進行入院前瞻性用藥調查，發現其中7名患者的肝功能障礙是由于對大黃等肝毒性中藥使用不當造成的[7]。還有研究顯示，使用較小劑量的大黃可對肝損傷的大鼠起到治療作用，且治療效果隨著劑量的增加而降低[8]；若大黃使用劑量過大，則會對正常大鼠的肝臟造成損傷，且大黃肝毒性和大鼠年齡呈正相關[9]。此外，有研究表明大黃中的部分蒽醌類物質能夠通過損害線粒體功能[10]、抑制谷胱甘肽合成[11]以及影響脂肪酸代謝[12]從而導致肝臟毒性。

目前，網絡藥理學不僅用于藥物和中藥活性化合物發現、整體作用機制闡釋、藥物組合和方劑配伍規律解析等，在預測中藥毒性成分與闡明毒理機制方面也被廣泛應用。孫思彤等[13]應用網絡藥理學及分子對接技術確定補骨脂中的補骨脂素、補骨脂異黃酮等顯著毒性成分通過作用于AKT1、mTOR、SRC、Bcl-2 等主要靶點參與調節PI3K-Akt-mTOR、MAPK、VEGF 等信號通路致肝毒性作用。傅甜等[14]應用網絡藥理學及分子對接技術探明雷公藤腎上腺功能減退的毒理作用，可能通過雷公藤毒性化合物作用于133 個核心靶點與107 條信號通路而產生。余雪純等[15]采用網絡藥理學方法和分子對接技術得到黃藥子中8-表黃獨素E 乙酸酯和黃獨素B 與蛋白相互作用（PPI）網絡中度值最高的靶點雌激素受體1（ESR1）均具有較好的結合力。曹站霞等[16]應用網絡藥理學和細胞實驗探討補骨脂致肝毒性機制，結果發現補骨脂主要成分可抑制MAPK1、PIK3CA、AKT1 和JAK2 的mRNA 的表達，引起肝臟的損傷?；诖?，本文通過網絡藥理學[17-18]分析及實驗驗證對大黃致肝毒性的機制進行初步探討，以期為臨床安全有效使用大黃提供參考。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學分析

文中所用數據庫可見表1。

表1 文中所用數據庫

1.1.1 大黃潛在毒性成分預測及靶點獲取

應用TCMSP 平臺[19]，獲取大黃化學成分信息，并依據Lipinski 五原則[20]，即分子量（MW）小于500，氫鍵供體數目（Hdonor）小于5，氫鍵受體數目（Hacceptor）小于10，脂水分配系數（AlogP）小于5以及口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30% 和類藥性（Drug likeness，DL）≥0.18 作為指標參數進行篩選，再通過CTD 數據庫檢索其毒理學信息，篩選得到大黃潛在致毒成分。

應用TCMSP 平臺可獲取部分靶點信息，將所得信息輸入UniProt數據庫進行基因名稱簡化修正。此外，利用TCMIP 數據庫也可得到部分成分對應的靶點信息。最后，基于PubChem 數據庫，獲取成分對應的SMILES 號，鍵入SwissTargetPrediction 平臺[21]，選擇物種屬性“Homo sapiens”，預測其靶點，剔除Probability<0 的靶點。將上述三個數據庫得到的靶點信息去重整理，得到大黃潛在毒性成分靶點。

1.1.2 大黃致肝毒性靶點預測

以“liver injury”、“hepatotoxicity”為關鍵詞，通過CTD 數據庫、DisGeNET 數據庫[22]以及GeneCards 數據庫查找疾病相關基因靶點，其中CTD 數據庫結果保留推理分數（Inference score）>200 的靶點，GeneCards 數據庫結果保留相關系數（Relevance score）>7 的靶點。將上述3 個數據庫得到的靶點信息去重整理，得到疾病相關基因靶點。將整理得到的成分靶點和肝毒性靶點導入微生信平臺制作韋恩圖，進行可視化處理，得到交集靶點即為大黃致肝毒性靶點。

1.1.3 蛋白質相互作用（Protein-protein interaction，PPI）網絡的構建

將大黃致肝毒性靶點導入STRING 平臺，限定物種為人源，設置最低互作分數為0.900，隱藏離散節點，獲取靶點互作情況。利用Cytoscape 3.9.1 軟件中的CytoNCA 插件進行拓撲分析，以大于介數中心性（Betweenness centrality，BC）、緊密中心性（Closeness centrality，CC）中位數和度值（Degree）均數為標準進行靶點篩選，得到核心靶點。

1.1.4 GO與KEGG富集分析分析

將大黃致肝毒性靶點導入DAVID 數據庫[23]，選擇標識符為OFFICAL-GENE-SYMBOL，物種限定為人源，列表類型選擇為基因列表，保存GO 類目下的BP、CC、MF 數據和KEGG 數據，設定閾值P<0.01，按P值排序，利用微生信平臺制作對應的富集氣泡圖。

1.1.5 構建“成分-靶點-通路”網絡

將得到的潛在致毒成分、PPI 互作得到的核心靶點與篩選出的前15 條信號通路及其相關靶點導入Cytoscape 3.9.1，構建“成分-靶點-通路”網絡圖。

1.2 實驗驗證

1.2.1 實驗材料

SPF 級KM 小鼠，體質量18-22 g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司（許可證號：SCXK（京）2019-0010）。

大黃酸（Rhein，RH）、磺胺苯吡唑（Sulfamethazole，SFP）、1-氨基苯并三唑（1-Aminobenzotriazole，ABT）購自美國Ark 公司；利福平（Rifampicin，RFP）購自Innochem 公司；DMEM 高糖培養基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶購自Gibco 公司；鼠尾膠原蛋白Ⅰ型、HEPES、EDTA、Percoll 青霉素-鏈霉素、0.4%臺盼藍溶液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、快速封閉液、一抗稀釋液、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒購自Solarbio 公司；膠原酶Ⅳ購自美國Sigma 公司；CCK-8 購自日本同仁化學研究所；高靈敏度化學發光檢測試劑盒、預染蛋白質marker 購自美國Thermo 公司；β-actin 抗體、γ-H2AX抗體、PARP-1抗體購自英國Abcam公司；一抗稀釋液、苯甲基磺酰氟（PMSF）蛋白上樣緩沖液、快速封閉液裂解液、PVDF 膜購自碧云天生物技術研究所。實驗用水為超純水，其他試劑均為分析純。

Nikon 倒置顯微鏡、TS100 倒置顯微鏡（Nikon 公司），CO2 細胞培養箱、Modle680 酶標儀、超低溫冰箱、Fresco17 冷凍離心機（Thermo Fisher Scientific 公司），HHS11-4 電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實驗設備有限公司），SP-MiniPump 型蠕動泵（保定申辰泵業有限公司），低速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠），超凈臺（江蘇蘇凈集團有限公司），EL204型電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司），數顯立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海精宏實驗設備有限公司），超純水機（四川沃特爾科技發展有限公司）。

1.2.2 實驗方法

（1）小鼠原代肝細胞的分離：依照經典的Seglen門靜脈兩步灌注法分離小鼠原代肝細胞，在此基礎上進行創新，采用Percoll單密度梯度離心法純化肝細胞[24]。小鼠術前12 h 禁食不禁水，麻醉小鼠，用75%乙醇胸腹部消毒后固定于手術臺上，上腹部開腹，將腸胃移向右側，露出肝門靜脈，插入留置針，打開泵灌注，調節流速為4 mL·min-1，當肝變黃時，切開下腔靜脈，直至整個肝變黃，且所沖出的溶液澄清時關泵，換后灌流液，繼續以4 mL·min-1的流速進行灌流，并反復按壓下腔靜脈使肝臟膨脹，最后灌至肝臟表面出現裂隙，肝臟柔軟易碎，壓之凹陷不易恢復時關泵，將肝臟完整取下，放在裝有DMEM 的培養皿中，轉移至無菌超凈臺。將細胞輕輕刮下，轉移懸液至200 目的篩網中過濾，充分混勻后轉移至15 mL 的離心管中，2000 r·min-1離心3 min，棄上清，加入35%細胞分離液，二次離心，即得小鼠原代肝細胞。向細胞沉淀中加入5 mL含1%雙抗、10% FBS 的DMEM 完全培養基計數；同時將0.4%臺盼藍溶液與細胞懸液以1∶9 比例混勻（終濃度為0.04%），染色3 min，計算細胞存活率。再將細胞懸液按照一定比例稀釋，以1.8×104個每孔的密度接種至0.012 mg·mL-1鼠尾膠原蛋白Ⅰ型包被的96 孔板，在37℃、5% CO2恒溫培養箱中培養12 h。

（2）光學顯微鏡觀察細胞形態：將小鼠原代肝細胞懸液以4×105的密度接種于6 孔板，在37℃和5%CO2的恒溫培養箱中培養12 h，加入按照梯度稀釋法配制的含有0，50，100，200 μmol·L-1RH 的培養液，培養24 h，棄去培養基，用PBS 清洗細胞，加入適量PBS，在光鏡下觀察細胞形態并拍照。

（3）CCK-8 細胞毒性分析實驗：加入按照梯度稀釋法配制的含有0、12.5、25、50、100、150、200 μmol·L-1RH 的培養基，每組5 個復孔，于細胞培養箱中分別培養6 h、12 h、24 h、48 h 后，棄去孔中原有培養基，加入含10% CCK-8的細胞培養基100 μL，在培養箱中培養2 h，酶標儀檢測450 nm 波長的OD 值。重復3 次，計算各劑量組的平均值和標準差。細胞存活率（%）=[(As-Ab]/(Ac-Ab)]×100%。其中：As：實驗孔（含有細胞的培養基、CCK-8、藥物），Ac：對照孔（含有細胞的培養基、CCK-8、沒有藥物），Ab：空白孔（不含細胞和藥物的培養基、CCK-8）

（4）CYP2C9 抑制實驗：將小鼠原代肝細胞接種至細胞培養板中，在恒溫培養箱中進行培養，約4 h 后換液，再繼續培養12 h，用PBS 溶液清洗細胞表面兩次，然后設置分組：空白溶劑組，ABT 200 μmol·L-1+RH（0-200 μmol·L-1）組，SFP 20 μmol·L-1+RH（0-200 μmol·L-1）組，每組5 個復孔。在給予細胞RH 前，先用對應抑制劑預處理細胞2 h，給藥后培養24h。CCK-8 檢測細胞存活率，具體操作同上。

（5）CYP2C9 誘導實驗：將小鼠原代肝細胞接種至細胞培養板中，在恒溫培養箱中進行培養，約4 h 后換液，再繼續培養12 h，用PBS 溶液清洗細胞表面兩次，加入RFP 20 μmol·L-1，誘導72 h，期間每24 h 進行換液，誘導結束后，加入培養基稀釋的RH（0-200 μmol·L-1），每組5 個復孔，繼續培養24 h。CCK-8 檢測細胞存活率，具體操作同上。

（6）Western blot 檢測PARP-1、γ-H2AX 蛋白表達水平：用不同濃度的RH 處理后再培養24 h，加入Ripa裂解細胞，離心取上清，采用BCA 試劑盒進行蛋白質定量。已知濃度蛋白以1∶4的比例與蛋白上樣緩沖液完全混合，100℃條件下10 min使蛋白失活。冷卻后進行恒壓電泳（低電壓80 V，20 min；高電壓120 V，90 min），轉膜（恒壓25 V，30 min），封閉1h。于4℃下用適量一抗（γ-H2AX：1∶1000、PARP-1∶1∶1000、β-actin∶1∶5000）孵育過夜，二抗（1∶1000）室溫孵育1 h，加入ECL 化學發光溶液，曝光，固定顯影，掃描拍照保存。利用Quantity-one 凝膠成像分析軟件對蛋白質的灰度值進行分析，結果用目標蛋白與內參蛋白灰度值之比表示。

1.3 統計學分析

采用SPSS 23.0 軟件統計學分析。計量資料以平均值±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 網絡藥理學分析結果

2.1.1 大黃潛在毒性成分預測及靶點獲取

參照Lipinski 五原則、OB≥30%和DL≥0.18 為標準，結合CTD 數據庫檢索成分毒理學信息，篩選得到大黃潛在致毒成分為大黃酸（rhein）、蘆薈大黃素（aloe-emodin）、(-)-兒茶素水合物[(-)-catechin]，經過去重整理后得到對應成分靶點106個。成分基本信息見表2。

表2 大黃潛在致毒成分

2.1.2 大黃致肝毒性靶點預測

經過去重整理得到疾病相關靶點3063個，與成分靶點取交集，得到大黃致肝毒性靶點71 個。利用Venny 2.1.0 平臺制作韋恩圖，進行可視化處理，結果見圖1。

圖1 成分靶點與肝毒性靶點韋恩圖

2.1.3 PPI網絡的構建

為了獲得潛在靶點交互作用的信息，將71個潛在靶點上傳到STRING 平臺，獲得靶點蛋白之間的相互作用網絡圖，見圖2。靶蛋白用節點（node）表示，節點之間用邊（edge）表示，共有7個節點和570條邊。將結果的TSV 文件導入Cytoscape 3.9.1 進行可視化和拓撲分析，以大于BC、CC 中位數和D 值均數為標準進行靶點篩選，得到核心靶點17個，按照度值大小排序，結果見表3。這17個核心靶點可能在大黃導致肝損傷過程中發揮著重要的作用。

圖2 交集靶點PPI互作圖

表3 核心靶點蛋白拓撲參數信息

2.1.4 GO與KEGG富集分析

經P<0.01 篩選后，得到233 條GO 結果，其中生物過程（Biological process，BP）162 條、細胞組成（Cellular component，CC）19 條、分子功能（Molecular function，MF）52 條，分別選取前10 條進行可視化處理，結果見圖3。BP 主要涉及正向細胞凋亡調控、外源代謝過程以及雌二醇響應過程等；CC 主要涉及細胞質、細胞質基質以及線粒體等；MF 主要涉及酶結合、芳香化酶活性以及血紅素結合等。經P<0.01 篩選后，得到34 條通路結果，前15 名結果見圖4。其中包括化學物質致癌作用-DNA 加合物通路（Chemical carcinogenesis-DNA adducts）、P450 酶藥物代謝通路（Drug metabolism-cytochrome P450）、癌癥通路（Pathways in cancer）、P450 酶外源性物質代謝通路（Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450）以及細胞凋亡通路（Apoptosis）等?？紤]到癌癥通路與肝毒性聯系不大，將其排除，前5 通路中其余4 條都與CYP450 酶相關，結合PPI 蛋白互作得到的核心靶點結果，排名靠前的與CYP450酶相關的只有CYP2C9酶，便將其作為后續實驗驗證對象。此外，KEGG 結果提示大黃致肝毒性與細胞DNA損傷以及細胞凋亡密切相關，后續選擇此機制進行實驗驗證。

圖3 GO通路富集分析

圖4 KEGG通路富集分析

2.1.5 構建“成分-靶點-通路”網絡

“成分-靶點-通路”網絡見圖5，該網絡中有58 個節點，129 條邊。按度值對涉及到的三個潛在毒性成分進行排序，結果：rhein（RH）11.0>aloe-emodin（AE）5.0>(-)-catechin 1.0(CA)。結合文獻調研與前期實驗工作基礎，選擇RH作為后續實驗驗證成分。

圖5 “成分-靶點-通路”網絡

2.2 實驗驗證結果

2.2.1 RH對細胞形態的影響

通過光學顯微鏡觀察到未經RH 處理的小鼠原代肝細胞形態呈不規則多邊形，為典型的肝細胞形態，而用不同濃度的RH 處理24 h后，細胞形態會隨著RH濃度的增加，逐漸出現皺縮、變圓，甚至在處理濃度為200 μmol·L-1時大部分從底壁脫落，說明RH 引起的細胞形態變化具有濃度效應關系。具體結果見圖6。

圖6 RH對小鼠原代肝細胞形態的影響

2.2.2 CCK-8分析細胞毒性結果

結果表明，經不同濃度的RH 處理6-48 h后，原代肝細胞活力具有顯著性差異：與空白組相比，隨著藥物濃度的增加，細胞活力明顯降低；隨著藥物作用時間的延長，RH 對細胞抑制作用更為明顯。以上結果提示RH 的作用具有劑量與時間依賴性。具體結果見圖7。

圖7 不同濃度RH作用小鼠原代肝細胞不同時間后細胞活力變化

2.2.3 CYP2C9抑制實驗結果

實驗結果表明，抑制CYP2C9酶可以抑制RH對小鼠原代肝細胞的毒性，與對照組相比，RH對細胞活力的抑制呈劑量依賴性，而ABT和SFP可減弱這種毒性效應。當暴露于不同濃度的RH時，與無ABT和SFP的處理組相比，ABT和SFP分別使細胞活力顯著增長了3.52%-32.56%和2.26%-27.52%，其中CYP450廣譜抑制劑ABT抑制效果比CYP2C9專屬抑制劑SFP強。具體結果見圖8。

圖8 RH對小鼠原代肝細胞的毒性

2.2.4 CYP2C9誘導實驗結果

通過RFP 誘導CYP2C9，可增加RH 對小鼠原代肝細胞的毒性。在25-100 μmol·L-1RH 處理的情況下，與不含RFP 的孵育組相比，20 μmol·L-1RFP 的引入導致了細胞活力顯著下降（下降2.01%-17.24%）。具體結果見圖9。

圖9 RH對小鼠原代肝細胞的毒性

2.2.5 RH誘導小鼠原代肝細胞DNA損傷與凋亡

實驗結果表明隨RH 濃度的升高，PARP-1 和γ-H2AX 表達呈濃度依賴性，提示RH 能夠誘導小鼠原代肝細胞DNA 損傷，促使細胞凋亡。具體結果見圖10。

圖10 γ-H2AX和PARP-1蛋白水平隨RH濃度的變化

3 討論

大黃多樣的藥理作用與其所含有的多樣的化合物密切相關，迄今為止，已從18 種大黃屬植物中分離得到約200 個具有6 種不同類型骨架的化合物，包括蒽醌類、蒽酮類、二苯乙烯類、黃酮類、?；咸烟擒疹惡瓦拎?，這些化合物具有廣泛的藥理活性，包括瀉下、利尿、抗癌、保肝、抗炎以及鎮痛等作用[25]。然而，近年來其毒理作用研究報道也逐漸增多。鄧諾[26]通過研究發現大黃和大黃蒽醌高劑量均可下調腎臟組織的Clusterin mRNA 表達，這可能會抑制機體的抗凋亡能力和降低對腎臟的保護作用，從而使得腎臟損傷風險增大；同時大黃蒽醌高劑量可降低腎臟組織的OAT1 和OAT3 mRNA 表達，降低PAH 的清除率，這提示大黃蒽醌高劑量可能會抑制有機陰離子轉運子的功能，從而導致有害的物質在腎臟中蓄積，發生腎毒性反應。王敏等[27]通過實驗研究發現，生大黃的鞣質、總蒽醌及游離蒽醌含量分別為3.59%、1.96% 和1.03%，而經過炮制后的熟大黃鞣質、總蒽醌及游離蒽醌含量分別為0.33%、1.86%和1.27%，與對照組比較，生大黃呈現不同程度的肝臟變性，而相同濃度下的熟大黃給藥組，僅在高濃度條件下呈現輕微的肝臟變性。這提示生大黃肝毒性可能與鞣質以及蒽醌類物質相關。

RH 作為大黃中主要的蒽醌類成分之一，具有廣泛的藥理作用與毒理作用。RH 可增強亞胺培南-西司他丁對金黃色葡萄球菌誘導的膿毒癥小鼠的抗菌活性，其機制是通過抑制OATs 減少了亞胺培南的腎臟清除[28]。此外，經RH 預處理可改善膿毒癥小鼠整體代謝狀況，改善ALI，并通過調節代謝和抑制膿毒癥肺損傷早期過度炎癥反應，調節巨噬細胞過度活化[29]。與此同時，大黃酸的毒理作用也不應忽視。有學者研究發現長期使用大黃可導致細菌耐藥、結腸結構的炎癥改變、潰瘍性結腸炎形成以及RH 在結腸的蓄積，而RH 蓄積可誘導細胞凋亡和自噬，這可能與結腸毒性包括潰瘍性結腸炎形成有關[30]。經RH 處理的大鼠心肌細胞會出現萎縮、變圓、管壁脫落現象，同時可誘導大鼠心肌細胞S 期阻滯，抑制細胞增殖從而表現出心臟毒性[31]。

細胞色素P450 酶是以硫醇鹽和血紅素為活性中心，能夠利用分子氧對底物進行立體和區域選擇性氧化的一種氧化還原酶，其包含的主要蛋白質為含鐵的血紅蛋白和黃素蛋白[32]。其基本的氧化過程為，將電子從NADPH 轉移到CYP 底物復合物中，底物與CYP的結合位點緊鄰血紅素-鐵復合物。鐵最初為Fe3+，通過細胞色素P450 酶從NADPH 轉移一個電子，將血紅素鐵從三價態還原為亞鐵態，同時一個氧原子被插入底物中，另一個氧原子形成H2O[33]。有研究報道，RH可通過CYP2C9 代謝活化，從而產生更強的毒性。研究表明，RH（50 μmol·L-1）通過產生活性氧（ROS）、增加細胞內Ca2+、降低線粒體膜電位和耗竭細胞內谷胱甘肽（GSH）含量，最終導致大鼠原代肝細胞凋亡，且100 nmol·L-1的環孢素A 可有效緩解這種凋亡作用[34]。而Koramagazi 等[35]通過膜聯蛋白-V/PI 雙染色分析和Hoechst 33258 染色發現RH 可引發原代人肝HL-7702細胞凋亡，使用鈣蛋白酶抑制劑I 預處理可有效降低其對細胞凋亡誘導和JNK 激活的影響，提示RH 通過內質網應激和提高細胞內鈣水平誘導HL-7702 細胞凋亡。Xu等[36]在給予RH 的大鼠尿液和膽汁中檢測到1 個單羥基化代謝產物，同樣地，在RH 暴露后的大鼠和人肝微粒體孵育產物中也觀察到對應的代謝產物，實驗發現RH 在胞漿GSTs 存在的情況下可與GSH 結合反應，且CYP 2C9 是負責RH 代謝活化的主要酶，這與本研究結論一致。

DNA 作為遺傳信息的載體，其中任何位置出現損傷，都可能會引起遺傳信息的突變。DNA 的損傷大致可分為單個堿基突變和結構扭曲兩個大類。H2AX 組蛋白是染色體核小體組蛋白核心成員之一，當DNA 雙鏈損傷（DSBs）時，組蛋白H2AX 的第139 位絲氨酸磷酸化形成γ-H2AX 簇集，因此對γ-H2AX 蛋白的定量可以反應DSBs的發生程度[37]。當然，生物也進化出一系列修復基因的方法，其中DNA損傷的識別主要由聚腺苷酸核糖轉移酶（PARPs）家族酶來完成，同時還參與了多種細胞活動，包括DNA修復、轉錄、染色體結構調節、能量代謝和細胞內信息傳遞等。當DNA損傷激活PARP 后，PARP 可通過自身修復作用，形成DNA 損傷激發的PARP活性循環，不過PARP過渡的活化也會引起細胞能量耗盡而死亡。PARP-1 作為PARP 酶家族的最重要的成員，至少占據了細胞PARP 酶總活性的80%以上，且PARP-1參與了細胞凋亡的過程，然后在Caspases 依賴的凋亡途徑中被激活，因此PARP-1在細胞凋亡中顯得尤為重要。因此選擇對PARP-1、γ-H2AX進行了Western blot驗證。

參照《網絡藥理學評價方法指南》[38]，結合《網絡藥理學評價方法指南》解讀[39]兩篇文章，本文收集了肝毒性疾病表型數據與大黃化學成分數據，得到疾病表型-靶點數據與藥物-靶點數據，構建了疾病表型-標靶-藥物網絡，并對網絡進行了可視化分析，功能富集分析，確定了活性成分RH，關鍵靶點CYP2C9 以及關鍵通路細胞凋亡，最后通過細胞實驗進行驗證，符合《網絡藥理學評價方法指南》的要求。然而此文也有缺點，首先是驗證實驗僅有細胞實驗，實驗證據不夠充分。此外，文中TCMSP 等數據庫數據來源主要是從科學文獻和公開數據庫中提取的。這些數據經過了嚴格的篩選和驗證，包括驗證化合物的結構、活性和藥物相互作用的真實性等。因此，來源數據具有較高的準確性和查全性。然而，依賴于文獻的數據仍然會受到文獻本身的限制，如實驗條件的不一致、樣本量等問題，加之中藥的復雜性和多樣性，TCMSP 等數據庫可能無法包含所有中藥活性成分和相關的靶點信息，這可能會對結果產生一定的影響。藥物與靶標之間的相互作用涉及多個層次和復雜性，網絡藥理學也無法完全捕捉所有相互作用的細節和動態過程，也忽視了藥物在整個生物系統中的其他非特定作用和相互影響，不能全面評估藥物的整體效應。本文通過網絡藥理學研究發現RH 導致肝毒性與CYP450 酶密切相關，文中選擇排名靠前的CYP2C9作實驗驗證，表明其是大黃導致肝毒性的原因之一。然而實驗結果表明當暴露于不同濃度的RH 時，CYP450 廣譜抑制劑ABT 抑制效果比CYP2C9 專屬抑制劑SFP 強，導致這一現象的原因可能是能夠誘導RH 代謝活化的CYP450 酶不僅僅只有CYP2C9，可能還存在其它酶系，后續考慮對這一部分內容進行挖掘。

綜上所述，本文應用網絡藥理學初步篩選大黃潛在致肝毒性機制，得到大黃潛在活性毒性成分RH，尋找到核心靶點17 個，綜合分析之下選擇CYP2C9 作為驗證靶點，通過原代肝細胞實驗以及Western blot實驗對網絡藥理學預測出的通路信息進行驗證。結果證明大黃中RH 能夠顯著抑制小鼠原代肝細胞活力，其對小鼠原代肝細胞的毒性可能是CYP2C9 對RH 代謝活化所致；RH 可激活PARP-1，使H2AX 磷酸化，誘導小鼠原代肝細胞DNA 損傷，從而導致細胞凋亡，誘導肝臟毒性。