膿毒癥相關肺損傷中內質網應激誘導的鐵死亡機制研究

金子琦,唐 波,吳章宏,肖 寶,劉 斌,鐘 揚,胡 霞

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是一種復雜的病理生理綜合征,發病率高,但其發病機制仍有待探討[1]。鐵死亡是一種獨特的鐵依賴形式的程序性細胞死亡,其生化特征主要包括細胞內鐵的積聚和大量脂質過氧化[2]。目前,鐵死亡被認為是參與脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)誘導的急性肺損傷(acute lung injury,ALI)的重要因素,用鐵抑制素-1(ferrostatin-1,Fer-1)抑制鐵死亡可顯著緩解ALI[3]。因此,阻斷鐵死亡可能作為ARDS的一個新的治療靶點。研究[4]表明,鐵死亡受內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERs)的調節,如蛋白激酶RNA樣ER激酶(protein kinase RNA-like-ER kinase,PERK)-激活轉錄因子 4(activating transcription factor 4,ATF4)途徑參與介導鐵死亡。在ERs情況下,內質網形狀和功能通過內質網部分的選擇性自噬得到良好維持[5]。內質網自噬由各種受體介導;其中,序列相似性家族134成員B(family with sequence similarity 134 member B,FAM134B)是在哺乳動物細胞中發現的第一個自噬體受體,其能靶向自噬體中的片段化內質網膜,用于溶酶體降解[6]。最近研究[7]顯示FAM134B介導的內質網自噬保護膿毒癥誘導的小鼠心肌損傷。此外,FAM134B介導的內質網自噬參與激活肝細胞癌鐵死亡[8]。該研究通過探討FAM134B介導的ER自噬和鐵死亡之間的相互作用,旨在揭示ERs相關鐵死亡在ARDS肺損傷中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞 小鼠肺泡上皮細胞(alveol epithelial cells,AECs)系MLE12細胞購自美國模式培養物集存庫。

1.1.2實驗動物 40只SPF級成年雄性C57BL/6J小鼠(6周齡,22～24 g)購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。所有小鼠飼養在濕度為50%～60%、溫度為24～26 ℃且光照/黑暗周期為12 h的受控環境中。

1.1.3主要材料 CCK-8試劑盒(貨號:CA1215-100T)、二甲苯(貨號:DM0105)、蘇木精和曙紅(貨號:G1120)、Triton X-100(貨號:P1080)和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)(貨號:D8370)購自北京Solarbio公司,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(貨號:L-2880)、脂質過氧化丙二醛(malondialdehyde,MDA)分析試劑盒(貨號:MAK085)購自美國Sigma公司,鐵分析試劑盒(貨號:D153-6)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)試劑盒(貨號:A006-2)購自南京建成生物工程研究所,抗谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)(貨號:CL594-67763)、β-肌動蛋白(貨號:bsm-33036M)、環加氧酶2(prostaglandin endoperoxide synthase 2,PTGS2)(貨號:66351-1-Ig)、葡萄糖調節蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)(貨號:66574-1-Ig)、ATF4(貨號:60035-1-Ig)、CCAAT增強子結合蛋白同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)(貨號:66741-1-Ig)、FAM134B(貨號:21537-1-AP)、Alexa Fluor 568偶聯的次級抗體(貨號:A20185)購自美國Proteintech公司,DAPI(貨號:H-1200)購自美國Vector Laboratory公司,組織蛋白提取物緩沖液(貨號:89900)、BCA蛋白測定試劑盒(貨號:23227)購自美國Thermo Fisher公司,4-羥基壬烯醛(4-HNE)(貨號:GP2035)、山羊抗兔IgG二抗(貨號:GB25303)、兔抗小鼠IgG二抗(貨號:GB23303)購自武漢Servicebio公司。Vector、FAM134B過表達質粒(貨號:D02008、M-21542)購自上海吉瑪制藥技術有限公司。

1.1.4主要儀器 DM2000熒光顯微鏡購自德國Leica公司,Tanon V8快速蛋白質印跡系統購自上海Tanon公司。

1.2 方法

1.2.1細胞分組與處理 MLE12細胞在37 ℃下在含有2%新生小牛血清的DMEM/F12培養基中培養。當細胞達到細胞培養瓶體積的80%～90%時,在6孔板中培養細胞。用LPS(0、1、2、5 μg/ml)處理細胞24 h以確定LPS對MLE12氧化應激和Fe2+水平的影響。為了驗證鐵死亡在LPS誘導的細胞死亡中的作用,將細胞分為對照(Con)組、鐵死亡特異性抑制劑(Fer-1)組、LPS組和LPS+Fer-1組;LPS+Fer-1組在LPS處理前6 h,用10 μmol/L Fer-1預處理,隨后將細胞暴露于5 μg/ml LPS (預實驗確定的在24 h誘導幾乎一半的MLE12細胞活力降低的濃度)24 h,Con組用融媒DMSO處理24 h,Fer-1組用10 μmol/L Fer-1預處理6 h,隨后用DMSO處理24 h,LPS組將細胞暴露于5 μg/ml LPS 24 h;為了研究ER自噬在LPS引起的細胞鐵死亡中的作用,將細胞分為Con+載體(Vector)組、Con+FAM134B組、LPS+Vector組、LPS+FAM134B組,細胞用Vector或FAM134B過表達質粒轉染48 h后,暴露或不暴露于5 μg/ml LPS 24 h。

1.2.2CCK-8法測定細胞活力 采用CCK-8試劑盒說明書檢測所有組MLE12細胞活力。

1.2.3鐵含量測定 使用按照鐵分析試劑盒說明書測量不同濃度(0、1、2、5 μg/ml)LPS處理組和Con組、Fer-1組、LPS組和LPS+Fer-1組細胞的鐵濃度。將MLE12細胞(2×106個細胞)在6倍體積鐵分析緩沖液中快速勻漿,加入相關試劑。最后,在593 nm處測量吸光度,并使用標準曲線計算鐵濃度。

1.2.4實驗動物分組和處理 將40只小鼠隨機分成Con+Vector組、Con+FAM134B組、LPS+Vector組、LPS+FAM134B組,每組10只;LPS+Vector組、LPS+FAM134B組小鼠用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)進行麻醉,腹腔注射30 mg/kg LPS誘導膿毒癥[9]。Con+Vector組、Con+FAM134B組小鼠腹腔注射相同劑量的PBS,Con+FAM134B組和LPS+FAM134B組小鼠在腹腔注射LPS前3天,用經鼻滴注的方法將基于腺相關病毒(adeno-associated virus,AAV)的FAM134B過表達質粒(1×1012vg/ml,60 μl)對小鼠進行干預,用于特異性表達FAM134B,腹腔注射LPS 12 h后處死小鼠。

1.2.5HE染色和免疫組化染色 將小鼠的整個左肺固定在4%多聚甲醛中,石蠟包埋,并切成4 μm的切片。然后將切片進行HE染色、4-羥基壬烯醛(4-Hydroxynonenal,4-HNE)免疫組化染色和GPX4免疫熒光分析。對于HE染色,將切片用蘇木精和曙紅染色,并固定在載玻片上,通過顯微鏡觀察。對于免疫組化染色,組織切片首先在60 ℃下烘烤2 h,然后用二甲苯脫蠟,并通過乙醇梯度再水合。然后在枸櫞酸鹽緩沖液中于95 ℃加熱30 min并冷卻至室溫,對載玻片進行抗原修復,阻斷內源性過氧化物酶活性和血清封閉后,將切片與抗4-HNE單克隆抗體(1∶50)4 ℃孵育過夜,隨后,將切片與生物素化連接的第二抗體在37 ℃孵育1 h,然后用DAB顯色溶液進行DAB顯色反應,細胞核復染和脫水后,用倒置顯微鏡拍攝組織切片圖像。

1.2.6免疫熒光染色 切片用10%山羊血清和0.1% Triton X-100 37 ℃封閉1 h,然后加入抗GPX4(1∶100)初級抗體,4 ℃孵育過夜,然后將切片與Alexa Fluor 568偶聯的次級抗體在37 ℃孵育1 h,用DAPI對細胞核進行染色。在熒光顯微鏡下觀察并拍攝圖像。

1.2.7Fe2+水平、MDA和GSH測定 收集肺組織(10 mg)或MLE12細胞(1×106個細胞),并使用Fe2+、脂質過氧化MDA分析試劑盒和GSH試劑盒測量MDA、GSH含量。

1.2.8蛋白質印跡法 采用組織蛋白提取物緩沖液制備小鼠肺組織及所有組的細胞的總蛋白,并使用BCA蛋白測定試劑盒進行定量。根據蛋白質分子大小使用10%或15% SDS-PAGE分離目標蛋白質,然后將蛋白質結合到PVDF膜上,隨后用5%脫脂乳封閉3 h。此外,根據制造商提供的參考濃度,將PVDF膜與特異性一抗β-肌動蛋白(1∶2 000)、PTGS2(1∶800)、GPX4(1∶1 000)、GRP78(1∶1 200)、ATF4(1∶1 000)、CHOP(1∶1 000)和FAM134B(1∶1 000)在4 ℃孵育過夜,TBST洗滌3次后,PVDF膜與山羊抗兔或兔抗小鼠IgG二抗(1∶20 000)在室溫下孵育2 h。最后,使用ECL蛋白印跡檢測系統測定鐵死亡標記物PTGS2和GPX4、ERs標志物GRP78、ATF4和CHOP以及介導內質網自噬的主要受體之一的FAM134B的蛋白水平。

2 結果

2.1 LPS對 MLE12細胞活力、鐵死亡、氧化應激和Fe2+水平的影響CCK-8實驗檢測結果顯示,LPS處理以劑量依賴性降低MLE12細胞活力(F=23.54,P<0.001),并且當LPS的濃度為5 μg/ml時,MLE12細胞活力下降至52%(圖1)。LPS處理以劑量依賴性增加PTGS2和降低GPX4水平(F=21.77、28.72,均P<0.001)(圖2),表明LPS暴露導致細胞鐵死亡。此外,LPS處理還導致MLE12細胞中MDA、Fe2+的劑量依賴性增加(F=12.19、10.96,均P<0.001)(圖3A、B),表明LPS暴露導致細胞內大量脂質過氧化和鐵的積聚。此外,LPS處理以劑量依賴的方式降低了MLE12細胞中的GSH水平(F=18.64,P<0.001)(圖3C),表明LPS處理使MLE12細胞抗氧化系統受損。

圖1 不同濃度LPS對MLE12細胞活力的影響

圖2 蛋白質印跡分析檢測不同濃度LPS對MLE12細胞鐵死亡的影響

圖3 不同濃度LPS處理MLE12細胞中丙二醛、Fe2+含量和相對谷胱甘肽的比較

2.2 Fer-1減輕LPS誘導的MLE12細胞活力降低、鐵死亡、氧化應激和Fe2+水平的增加如圖4-6所示,與Con組相比,LPS組活力降低降低(t=4.28,P<0.001),PTGS2蛋白水平、MDA和Fe2+水平增加(t=12.03、5.52、8.17,均P<0.001),GPX4蛋白和GSH水平降低(t=4.60、4.98,P<0.001);與LPS組相比,LPS+Fer-1組細胞活力增加(t=3.51,P=0.005),PTGS2蛋白水平、MDA和Fe2+水平降低(t=6.90、3.07、3.50,均P<0.05),GPX4蛋白和GSH水平增加(t=3.39、3.45,P=0.008、0.006)。提示Fer-1能夠減輕LPS誘導的MLE12細胞活力降低、鐵死亡、氧化應激和Fe2+水平的增加。

圖4 Fer-1對LPS誘導的MLE12細胞活力降低的影響

圖5 Fer-1對LPS誘導的MLE12細胞鐵死亡的影響

圖6 Fer-1對LPS誘導的MLE12細胞氧化應激和Fe2+水平增加的影響

2.3 FAM134B通過抑制ERs改善LPS誘導的細胞活力降低、鐵死亡和氧化應激增加LPS處理以劑量依賴性增加MLE12細胞中GRP78、ATF4和CHOP水平(F=11.63、24.92、10.10,均P<0.001),降低FAM134B水平(F=19.72,P<0.001)(圖7)。表明LPS誘導MLE12細胞ERs并抑制內質網自噬。與LPS+Vector組相比,LPS+FAM134B組細胞中ATF4、CHOP和PTGS2蛋白水平降低(t=6.50、5.83、5.38,P<0.001),GPX4和FAM134B蛋白水平增加(t=6.22、6.65,P<0.001),細胞活力增加(t=3.526,P=0.004)(圖8-10)。同時,LPS+FAM134B組細胞的MDA水平低于LPS+Vector組(t=3.11,P=0.021),和GSH水平高于LPS+Vector組(t=3.41,P=0.006)(圖11)。提示FAM134B通過抑制ERs改善LPS誘導的細胞活力降低、鐵死亡和氧化應激增加。

圖7 不同濃度LPS對MLE12細胞ERs和內質網自噬的影響

圖8 FAM134B對LPS誘導的MLE12細胞ERs和內質網自噬抑制的影響

圖9 FAM134B對LPS誘導的MLE12細胞活力降低的影響

圖10 FAM134B對LPS誘導的MLE12細胞鐵死亡的影響

圖11 FAM134B對LPS誘導的MLE12細胞氧化應激的影響

2.4 FAM134B過度表達減輕LPS誘導的小鼠肺部炎癥損傷HE染色分析結果顯示,與Con+Vector組小鼠相比,LPS+Vector組小鼠肺組織中出現中性粒細胞浸潤、肺泡隔膜增厚、肺泡水腫。FAM134B+LPS組小鼠肺組織中中性粒細胞浸潤、肺泡隔膜增厚以及肺泡水腫較LPS+Vector組減輕(圖12A);與Con+Vector組小鼠相比,LPS+Vector組小鼠肺組織中4-HNE、ATF4和CHOP表達水平增加(t=5.36、3.87、4.35,均P<0.01),GPX4、FAM134B表達水平降低(t=5.07、5.64,均P<0.001)。說明LPS誘導小鼠肺組織ERs并抑制內質網自噬。與LPS+Vector組相比,LPS+FAM134B組小鼠肺組織中4-HNE、ATF4、CHOP表達水平降低(t=3.88、3.55、5.61,均P<0.01),GPX4、FAM134B表達水平增加(t=2.87、5.07,均P<0.05)(圖12B-G)。說明FAM134B過度表達減輕LPS誘導的小鼠肺部炎癥損傷。

圖12 FAM134B過度表達對LPS誘導的小鼠肺部損傷的影響(n=6)

3 討論

鐵死亡是最近發現的一種氧化性細胞死亡,其特征是鐵依賴性脂質過氧化,并與多種疾病過程有關,包括癌癥、缺血再灌注損傷、感染和神經退行性疾病[5]。肺中的各種細胞類型,包括上皮細胞和巨噬細胞,可以產生鐵代謝相關蛋白,以調節鐵穩態,保護肺組織免受氧化應激[2]。鐵代謝紊亂與ARDS患者的肺組織損傷密切相關[3],即過多的鐵可以通過芬頓反應產生活性氧和細胞毒性。臨床研究[10]表明,ARDS的嚴重程度與鐵和鐵相關蛋白的水平有關。研究[11]表明,血液制品中的鐵會導致受血者體內鐵的增加,從而促進輸血相關ALI的發生。在ARDS患者的支氣管肺泡灌洗液中可以檢測到Fe2+和鐵調節劑水平升高[12]。由于肺泡上皮細胞死亡可能是ARDS中肺泡損傷的一個關鍵特征,受損的AECs產生過量活性氧進一步加重ARDS肺損傷[13]。因此,本研究選擇MLE12細胞作為體外研究對象。先前研究[14]表明Fer-1抑制脂質過氧化減輕了LPS誘導的人支氣管上皮細胞系BEAS-2B細胞死亡。本研究發現LPS以劑量依賴的方式誘導MLE12細胞活力降低、鐵死亡、氧化應激增加,這與先前的研究一致。

眾所周知,內質網是一種重要的細胞器,對活性氧敏感?；钚匝踉趦荣|網中的持續積聚引發ERs,可能是導致ALI進展的重要機制[4]。證據[3]表明,抑制ERs可以改善膿毒癥相關的肺損傷。GRP78是ERs的主要調節蛋白,ATF4在ERs中顯著上調,促進CHOP等因子表達,這些因子通常被視為ERs的生物標志物[3]。本研究發現,隨著LPS劑量的增加,GRP78、ATF4和CHOP的表達水平增加,表明LPS可以誘導MLE12細胞的ERs。近年來,證據[7]表明ERs增加與LPS誘導的鐵死亡相關。FAM134B作為介導內質網自噬的主要受體之一,在ERs情況下,可以通過螯合進入自噬體來介導ER進入溶酶體。FAM134B可以通過其膜彎曲能力促進膜重塑和減輕ERs破壞,并通過與LC3的結合誘導內質網自噬,FAM134B的下調將導致內質網的擴張[7]。此外,研究[15]表明,未折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR)可以激活FAM134B的表達以識別內質網腔中錯誤折疊或聚集的蛋白質。本研究發現LPS激活了MLE12細胞中的ERs和抑制內質網自噬,通過上調FAM134B,減輕了LPS誘導的MLE12細胞活力降低、鐵死亡和氧化應激增加,提示內質網自噬抑制參與介導LPS誘導的MLE12細胞鐵死亡。此外,本研究通過體內研究驗證了體外發現,LPS誘導的小鼠肺部組織中4-HNE上調和GPX4表達抑制,伴隨著ERs激活和FAM134B水平的下降,而FAM134B預處理逆轉了LPS誘導的這些變化。研究[7]表明,膿毒癥相關肺損傷中4-HNE超載通過上調ERs基因(如ATF4、CHOP)激活所有UPR途徑,并促進鐵死亡。因此,上調FAM134B對于抑制ARDS病理過程相關的鐵死亡至關重要。

總之,本研究顯示LPS以劑量依賴的方式誘導MLE12細胞鐵死亡和ERs。通過激活內質網自噬相關FAM134B受體有助于抑制ERs,并減輕細胞鐵死亡。本研究的發現為LPS誘導的ARDS提供了新的見解,這有助于更好地理解ARDS相關病理機制,并作為尋找預防ARDS的有效策略的基礎。然而,本研究主要集中在FAM134B自噬受體上,不能排除其他受體以及其他形式的自噬(如鐵蛋白自噬)是否參與LPS誘導的肺上皮細胞鐵死亡,未來需要更多研究以擴展本研究發現。