基于國產液相色譜串聯質譜檢測系統對血清中25-羥基維生素D含量檢測的驗證

姜瑞鳳 劉傳興 宋文君 張曼玉 杲立博 牛天渭 青島惠安康生物工程有限公司 （山東 青島 266114）

內容提要：目的：基于國產高效液相色譜串聯質譜檢測系統HAK6000，建立了準確測量血清中25-羥基維生素D的液相色譜-串聯質譜法。方法：通過對樣本中的25-羥基維生素D2[25(OH)D2]、25-羥基維生素D3[25(OH)D3]進行沉淀蛋白、萃取、氮吹濃縮等步驟獲取目標物及其內標的提取液，采用HAK6000直接對其中的目標物進行檢測。另外，使用HAK6000、AB 4500MD兩臺不同廠家的串聯質譜設備測定26例血清樣本，進行相關性分析。結果：采用HAK6000對樣本中的目標物25(OH)D2、25(OH)D3進行檢測，分別在1.25～40ng/mL和5～160ng/mL范圍內的線性相關系數R>0.9990，兩者的檢出限分別為0.4ng/mL、1.6ng/mL，定量限分別為1.25ng/mL、5.0ng/mL，質控品精密度優于5.0%。HAK6000、AB 4500MD串聯質譜設備測定血清樣本，2組數據的相關系數R≥0.99，這表明2臺儀器所測結果一致。結論：HAK6000可以達到準確定量檢測血清25-羥基維生素D的水平，能夠滿足臨床診斷需求。HAK6000將為臨床質譜分析提供一種更具性價比的選擇，助力國產質譜儀發展。

維生素D主要組成成分為維生素D2及維生素D3，可以通過皮膚合成或食物攝取獲得。維生素D缺乏不僅與骨質疏松癥和軟骨化癥相關，而且容易導致肌肉力量下降[1]。近年來發現維生素D與心血管疾病、糖尿病、多發性硬化癥等多種疾病都有相關性[2-4]。足量的體內維生素D水平與多發性硬化癥、糖尿病等都有相關性，足量的體內維生素D水平對多發性硬化癥、糖尿病等有一定預防作用。人體內維生素D主要以25-羥基維生素D的形式存在，約占維生素D總量的95%，且半衰期最長，性質穩定[5]。25-羥基維生素D的產生是由于維生素D在肝臟微粒體中經單氨酶系統作用，25位羥基化產生。分別測定25-羥基維生素D2[25(OH)D2]、25-羥基維生素D3[25(OH)D3]可以直接反映生物體內維生素D真實活性的水平，具有重要的臨床意義和療效判定意義。臨床上常見的檢測方法有化學發光法、免疫熒光層析法和液相色譜-串聯質譜法（Liquid Chromatography-Massspectrometry/Mass Spectrometry，LC-MS/MS）等，其中，LC-MS/MS具有高準確度、高靈敏度和高特異性的特點，是國際公認的測定25(OH)D的“金標準”[6-13]。

本研究擬采用高效液相色譜串聯質譜檢測系統HAK6000測量血清中25(OH)D的含量。結合第二類醫療器械注冊產品25-羥基維生素D檢測試劑盒（液相色譜-串聯質譜法），建立同位素稀釋質譜定量分析方法，經方法確證后，開展批量臨床樣本定量分析研究，并與進口品牌AB SCIEX Triple Quad?4500MD的測量結果進行對比，以期驗證國產質譜儀在臨床檢測方面的表現，為國產質譜儀技術和應用的快速發展提供幫助。

1.材料與方法

1.1 一般材料

研究起止時間：2023年4月～2023年5月。

樣本：本研究共采集了26例人血清樣本，血清樣本均來自于人體靜脈血，經離心后得到血清，每樣品血清不少于500μL，保存于-70?C冰箱中。儀器與試劑見表1。

表1.儀器與試劑

1.2 方法

通過對樣本中的25-羥基維生素D2（25(OH)D2）、25-羥基維生素D3[25(OH)D3]進行沉淀蛋白、萃取、氮吹濃縮等步驟獲取目標物及其內標的提取液，采用HAK6000直接對樣本中的目標物進行檢測。另外，使用HAK6000、AB 4500MD兩臺不同廠家的串聯質譜設備測定26例血清樣本，進行相關性分析。

1.2.1 試劑準備

檢測前，所有試劑及樣本應恢復至室溫，并充分混勻。

校準曲線各梯度的配制：按照檢測試劑盒說明書將校準品稀釋得到25-羥基維生素D2濃度為1.25、2.5、5、10、20、40ng/mL和25-羥基維生素D3濃度為5、10、20、40、80、160ng/mL的標準系列溶液。

標記物釋放液A的配制：取100μL內標液加入4mL釋放液A中，混勻。

1.2.2 樣本處理

取各標準系列溶液、質控品、血清樣本各200μL分別加入2mL離心管，加入400μL前述含標記物釋放液A，渦旋5s后，混勻振蕩3min；加入1.20mL釋放液B，顛倒混勻5次后，振蕩3min；4?C，10000r/min以上，離心5min，取上清液加入玻璃管中，各玻璃管38?C以下氮氣吹干；加入100μL復溶液至玻璃管，渦旋混勻5s，移入96孔板，上機檢測。

1.3 檢測條件

1.3.1 色譜條件

液相色譜柱常規柱型3.0mm×50mm，3μm；柱溫：40?C；流動相：A為含溶液A的水溶液，按1.5:500的比例在水中加入溶液A；B為含溶液B的甲醇溶液，按1.5:500的比例在甲醇中加入溶液B。流速：600μL/min。梯度洗脫：0.2min：流動相B為75%；0.8min：流動相B為98%；2.5min：流動相B為98%；2.51min：流動相B為75%；4.0min：流動相B為75%。

1.3.2 質譜條件

AB 4500MD質譜條件：電噴霧離子源，正離子模式，MRM掃描分析，電噴霧電壓5500V，離子源溫度500?C，GS1 50，GS2 50，Curtain Gas 20。其他質譜參數見表2。

表2.AB4500MD質譜參數

HAK6000質譜條件：電噴霧離子源，正離子模式，多反應監測模式，毛細管高壓5kⅤ，去溶劑氣450?C，霧化氣1.6L/min，去溶劑氣5L/min，擋板電壓550V，反吹氣1.2L/min，碰撞氣0.55mL/min。其他質譜參數見表3。

表3.HAK6000質譜參數

2.結果與討論

2.1 方法確證

2.1.1 線性關系

記錄色譜圖中檢測樣目標物峰面積與內標峰面積，并計算目標物和其內標峰面積的比值，通過對標準物質各標示濃度（x）、目標物峰面積與內標峰面積比值（y）繪制標準曲線并擬合標準曲線方程，25(OH)D2和25(OH)D3：線性范圍分別為1.25～40ng/mL和5～160ng/mL，線性方程相關系數R≥0.9990，見圖1。

圖1.標準曲線

2.1.2 精密度

精密度由變異系數（Coefficient of Ⅴariation，CV）表示。對低、高值質控樣品重復測定10次，連續測定3d，日內和日間精密度結果列于表4。結果表明，所有測量結果均在靶值范圍內并接近目標值，其中25(OH)D2和25(OH)D3的日內和日間精密度范圍分別為1.32%～4.11%和2.15%～4.19%。

表4.方法確證結果

2.1.3 準確度

準確度用相對偏差表示。采用有證參考物質[GBW(E)090965]，進行3次重復測試，計算相對偏差（B），且滿足重復測定3次相對偏差（B）均在±15%范圍內，結果列于表4?？梢?，25(OH)D2的相對偏差分別為3.18%、4.51%和3.74%；25(OH)D3的相對偏差分別為2.51%、3.69%和4.46%，測量過程可以保證檢測結果的準確性。

2.1.4 檢出限和定量限

以3 倍信噪比(S/N)作為檢出限，10 倍信噪比作為定量限，且滿足重復測定5 次峰面積CV ≤15%，結果列于表4。25(OH)D2和25(OH)D3的檢出限可以滿足0.4ng/mL、1.6ng/mL，定量限可以滿足1.25ng/mL、5.0ng/mL。

2.2 方法驗證

使用低、高值質控品對所建立的方法進行驗證，結果見表5。2臺設備檢測的結果一致，均在靶值范圍內，說明所建立的方法準確、可靠。

表5.質控品檢測結果

2.3 樣本檢測

分別采用HAK6000和AB 4500MD 2臺液相色譜串聯質譜檢測系統測定26例經處理后的血清樣品，樣本檢測結果見圖2。

圖2.樣本檢測結果

分析研究數據的相關性，繪制散點圖，結果見圖3。

圖3.檢測結果相關性分析

可見，HAK6000和AB 4500MD之間的相關系數R>0.99，說明兩者之間存在顯著的正相關，表明這2臺儀器所測的結果一致。

3.結論

近幾年，因國際環境的變化和國家政策的支持，以及醫療衛生領域對精準醫療的普及，國產質譜設備如雨后春筍般涌現出來，其性能參數也在不斷提高。作為已經取得國家醫療器械第二類注冊證的國產高效液相色譜串聯質譜檢測系統HAK6000來說，不但填補了國產高端儀器的空白，還能為客戶提供更具性價比的選擇。通過本研究證明，HAK6000可以滿足對血清中25-羥基維生素D濃度檢測的要求，也希望其能在更多的臨床檢測項目中發揮更大的作用。