基于網絡藥理學探討紫蘇子—杏仁藥對治療咳嗽變異性哮喘的作用機制

王卉,趙克明

咳嗽變異性哮喘(CVA)主要臨床表現為咳嗽,是慢性咳嗽的主要病因,為臨床上一種較為特殊的哮喘類型。CVA與典型支氣管哮喘具有相似的病理生理特征,但疾病的程度相對較輕[1]?，F代醫學對于CVA的治療多運用茶堿類、白三烯受體拮抗劑、糖皮質激素、β受體激動劑等藥物以改善臨床癥狀[2],但部分患者激素治療的依從性低,癥狀控制不理想,且部分患者有停藥后復發的風險?，F如今研究中藥治療疾病的潛在分子機制多應用網絡藥理學,其能通過相關算法整合中藥成分數據庫、疾病數據庫、靶標數據庫,結合醫學、藥理學、系統生物學等多個學科,以此闡釋中藥治療疾病的機理?；谝陨蟽瀯?本研究擬應用網絡藥理學分析建立紫蘇子—杏仁藥對活性成分間的互作網絡,從中篩選出與治療CVA相關的活性成分,預測這些成分的作用靶點,為其進一步藥理作用研究及臨床應用提供參考。

1 資料與方法

1.1 紫蘇子—杏仁藥對有效活性成分篩選及靶點預測 以類藥性(DL)≥0.18,口服生物利用度(OB)≥30%作為標準,通過中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(TCMSP,https://tcmspw.com/tcmsp.php)數據庫檢索并篩選紫蘇子—杏仁藥對的活性成分。通過Pubchem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索已篩選的每個活性成分的分子結構及名稱并進行核對,再利用SwissTargetPrediction網站(http://www.swisstargetprediction.ch/)預測其可能存在的作用靶點。

1.2 疾病潛在作用靶點的篩選 登錄GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/),檢索“cough variant asthma”得到CVA相關疾病靶點。

1.3 構建“藥物—活性成分—共同靶點”網絡圖 將預測的藥物成分靶點和疾病靶點導入Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)繪制韋恩圖,得到紫蘇子—杏仁藥對的有效活性成分靶點和CVA靶點的交集。將交集靶點輸入CytoScape 3.9.1(https://cytoscape.org),得到并可視化“藥物—活性成分—共同靶點”網絡。使用網絡分析插件CytoNCA,關注節點的度中心性,度值越大代表相關的生物功能越多,重要性就越高。

1.4 PPI網絡建立及其核心蛋白篩選 將交集靶點導入STRING數據庫(https://cn.string-db.org/cgi/input.pl),物種設置為Homo Sapiens(智人),得到PPI蛋白互作網絡圖,使用Cytoscape的“centiscape 2.2”插件,以度中心性、中介中心性、接近中心性≥閾值為條件,篩選出合適的節點,再次構建PPI,并通過Cytoscape 3.9.1軟件將其可視化。

1.5 GO功能分析及KEGG通路富集分析 交集靶點導入將DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)對其進行GO功能及KEGG通路富集分析,物種限定為人類,得到GO功能和KEGG通路的富集分析。GO功能富集分析包括分子功能(MF)、細胞成分(CC)和生物學過程(BP),以P<0.05進行篩選排序,利用微生信平臺作圖(http://www.bioinformatics.com.cn/),以氣泡圖表示,對結果進行可視化分析。

2 結 果

2.1 紫蘇子—杏仁藥對有效活性成分與CVA相關靶點 以DL≥0.18、OB≥30%作為篩選條件,利用TCMSP數據庫進行篩選,得到杏仁有效活性成分19個,紫蘇子有效活性成分16個,其中未預測到相應靶點的有效活性成分3個,進一步篩選后得到有效成分32個,靶點426個。在GeneCards數據庫內檢索與CVA相關基因,共得到靶點基因3 229個。將紫蘇子—杏仁藥對有效活性成分靶點與CVA相關靶點取交集,共獲得交集靶點224個,以韋恩圖表示,見圖1。

圖1 紫蘇子—杏仁藥對與CVA的交集靶點韋恩圖

2.2 “藥物—活性成分—共同靶點”網絡分析 將紫蘇子—杏仁藥對的活性成分數據和相應靶點數據,以及交集靶點數據導入Cytoscape 3.9.1,構建“藥物—活性成分—共同靶點”網絡圖,見圖2。此網絡共有節點255個和953條邊,節點代表作用靶點及活性成分,兩個“V”形代表紫蘇子與杏仁兩味藥物,“△”是紫蘇子與杏仁的活性成分,“◇”是224個共同靶點,連線代表相互關聯。圖中節點的大小代表的是度值的大小,度值越大,其對應的節點越大,可以交互的靶點數更多,在網絡中的重要性也就越高。從化合物角度,排名前6位的化合物依次為花生四烯酸、甘草醇、甘草苷、木犀草素、11,14-二十碳二烯酸、菠甾醇,可能是紫蘇子—杏仁藥對治療CVA的關鍵化合物。從圖2中可以發現,多個靶點可以與同一個活性成分相關聯,一個靶點也可關聯單個或多個活性成分,這說明紫蘇子—杏仁藥對可能是通過多成分、多靶點的聯合起到對CVA的治療作用。

圖2 紫蘇子—杏仁藥對的“藥物—活性成分—共同靶點”網絡圖

2.3 PPI蛋白互作網絡分析 在STRING數據庫在線平臺導入224個交集靶點,下載潛在靶點蛋白互作關系文件,將其輸入Cytoscape 3.9.1軟件,通過插件centiscape 2.2的“network analysis”功能,以度中心性≥25.723 214 29、中介中心性≥253.080 357 1、接近中心性≥0.002 138 077為篩選條件,拓撲篩選后獲得44個核心靶點,根據新的44個核心靶點再次建立PPI網絡圖,見圖3。根據度值大小排名前10位的靶點為AKT1、IL-6、TP53、SRC、MAPK3、EGFR、JUN、PTGS2、HSP90AA1、ESR1。

圖3 PPI蛋白互作網絡圖

2.4 GO功能與KEGG通路富集分析 在DAVID數據庫輸入224個交集靶點進行GO功能富集分析,以P<0.05篩選后,共得到分子功能(MF)165個、細胞組分(CC)79個、生物過程(BP)630個,選擇前20個條目使用微生信進行繪圖,見圖4。圖中節點的大小由相關聯基因數決定,節點從小到大表明關聯基因的數量從少到多。對紫蘇子—杏仁藥對治療CVA的靶點進行KEGG通路富集分析,共涉及通路155條,取前20條繪圖,見圖5。顯著性通路主要涉及PI3K-Akt信號通路、cAMP信號通路、神經活性配體—受體相互作用、癌癥通路、化學致癌—受體激活通路等。

MF

圖5 紫蘇子—杏仁藥對治療CVA預測靶點的KEGG通路富集圖

3 討 論

CVA并非由單一的因素引起,中醫學雖并無CVA的病名記載,但在既往典籍中有類似癥狀的記載,《內經》云:“五臟六腑皆令人咳,非獨肺也”,如今很多醫者認為CVA的病機關鍵在風、痰、虛、瘀,尤其以風邪為主[3]?，F代研究認為氣道高反應性、變異性致敏源、氣道炎性反應和氣道重塑等與CVA的發病密切相關[4]。

本研究通過對“中藥—活性成分—疾病靶點”網絡構建發現,抗CVA的主要活性成分可能為花生四烯酸、甘草醇、甘草苷、木犀草素、11,14-二十碳二烯酸、菠甾醇?；ㄉ南┧岜恢鹾厦复x可能導致白三烯形成,引起支氣管收縮、氣道重塑、支氣管高反應性和嗜酸性粒細胞浸潤等[5-6]。木犀草素可降低卵清蛋白(OVA)致敏小鼠的氣管支氣管收縮和支氣管氣道高反應性,從而減輕實驗小鼠的癥狀[7]。龔國清等[8]研究證明木犀草素可改善支氣管炎性反應的嚴重程度,其是通過抑制TGF-β1mRNA的表達來實現。還有研究表明木犀草素的抗炎機制可能是通過抑制COX-2信號通路、調節Th1/Th2平衡等途徑來實現,其可通過降低血清特異性IgE水平減少哮喘的氣道高反應性[9-10]。木犀草素還可通過下調miR-132緩解氣道支氣管收縮和降低氣道高反應性[11]。

在PPI網絡中篩選出前10個核心基因,并按度值排序如下AKT1、IL-6、TP53、SRC、MAPK3、EGFR、JUN、PTGS2、HSP90AA1、ESR1。有研究表明,AKT1可成為CVA的治療靶點是通過其靶向下調CD38的表達,推動平滑肌細胞的分化增殖來實現[12]。IL-6是目前發現的功能最廣泛的細胞因子之一,其作為炎性遞質具備促炎與抗炎雙重作用,且能參與調節免疫反應、細胞增殖分化等[13]。相關研究證實TP53基因多態性與哮喘易感性相關[14]。SRC激酶是非受體酪氨酸激酶,其緩解哮喘的發作是通過遏制其活性,阻遏淋巴細胞的活化與增殖,從而減少炎性反應實現的[15]。MAPK3的活化會導致支氣管上皮細胞發生炎性反應[16]。研究發現當機體受到病毒感染時,早期c-Jun蛋白可表達且調節CD4+和CD8+T細胞增殖和炎性反應,而JUN正是編碼c-Jun蛋白的基因[17]。HSP90AA1可在炎性反應、細胞凋亡信號轉導途徑、減少鈣超載等方面發揮調節作用[18]。ESR1基因變異可能會影響哮喘患者氣道高反應性的發展,且可加速女性患者肺功能惡化,雌激素影響肺的發育及氣道重塑可能是其發生機制[19]。

GO功能BP分析發現,關鍵靶點主要參與細胞凋亡過程負調控、對脂多糖的反應、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控及負調控、細胞增殖的正向調節、信號轉導、炎性反應、蛋白質磷酸化等。有研究表明,在亞洲沙塵導致的過敏性氣道炎性反應中,脂多糖可強化中性粒細胞的聚集,使過敏性氣道炎性反應加重[20]。CC分析發現關鍵靶點基因主要作用于質膜、胞質溶膠、質膜的組成成分、質膜固有成分等。MF分析發現,關鍵靶點基因主要參與蛋白質結合、相同蛋白質結合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、鋅離子結合、酶結合、金屬離子結合、蛋白激酶活性等。

通過KEGG通路富集分析發現,紫蘇子—杏仁藥對治療CVA的關鍵通路有PI3K-Akt信號通路、cAMP信號通路、癌癥通路、化學致癌—受體激活通路、神經活性配體—受體相互作用等。PI3K-Akt信號通路在哮喘氣道重塑中起到重要作用,與其能夠推動氣道平滑肌細胞的增殖密切相關[21]。通過抑制PI3K-Akt信號通路可減少氣道上皮細胞的上皮—間質轉化,以達到抑制氣道重塑的目的[22]。神經活性配體—受體相互作用信號通路與哮喘的異質性炎性反應密切相關,是質膜上所有與細胞內外信號通路相關的受體和配體的集合[23]。cAMP調控著細胞的多種生理和病理效應,因為其作為細胞內的第二信使與多條信號通路密切相關[24]。糖皮質激素及β受體激動劑等哮喘治療藥物的作用發揮機制,一般與其影響cAMP信號通路的活性關系密切[25]。

綜上所述,紫蘇子—杏仁藥對存在花生四烯酸、甘草醇、甘草苷、木犀草素等活性成分,通過調控神經活性配體—受體相互作用通路、PI3K-Akt信號通路、cAMP信號通路等,作用于AKT1、IL-6、TP53、SRC、MAPK3、EGFR、JUN、PTGS2、HSP90AA1、ESR1等靶點,調控多個途徑、多個靶點協同來干預細胞代謝的多個過程,從而有效治療CVA。但本研究主要依托于數據庫信息,后續仍需進一步體外實驗驗證。

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