苗藥花蝴蝶回調CIA模型鼠血細胞變化的初步研究

張慶忠,龍思芳,戚國平,魏勝蘭,吳富小,朱啟悅,韋小龍,周枝

類風濕關節炎(RA)是一種病因未明的慢性系統性疾病,其臨床表現為手、足小關節的多關節、對稱性、侵襲性關節炎癥,可伴關節器官受累、畸形、功能喪失等癥狀,若控制不佳,10年內約35% RA患者喪失自由活動能力[1-2]。臨床資料顯示,血中淋巴細胞[3-4]、單核細胞[5-6]、紅細胞[7-8]、血小板[9-10]等細胞以及相關指標[11]檢測對RA的輔助診斷和作用機制研究有一定意義。苗藥花蝴蝶,學名赤脛散,為蓼科蓼屬植物,貴州省苗族民間草醫常用此藥治療RA,效果較好[12],本課題組前期預實驗效果也較好[13]。因此,結合RA相關血細胞文獻資料,本實驗研究苗藥花蝴蝶回調膠原誘導關節炎(CIA)模型鼠外周血白細胞、淋巴細胞、單核細胞、淋巴細胞/單核細胞、紅細胞、血細胞比容、血小板、平均血小板體積等指標,并初步探討苗藥花蝴蝶的作用機制。報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 苗藥花蝴蝶藥液:將采自本苗族地區的新鮮花蝴蝶全株約2 000 g,處理干凈后于實驗室水提3次,合并濃縮液后靜置取上清液為本實驗用苗藥花蝴蝶藥液。

1.1.2 實驗試劑、用品及動物:第三軍醫大學動物實驗中心提供的SPF級雄性SD大鼠40只,體質量(180±20)g[SCX-(軍)2022-1031]。購自美國SIGMA公司完全弗氏佐劑(CFA)(2 mg/支)。牛Ⅱ型膠原蛋白(CⅡ)購自北京索萊寶科技有限公司。甲氨蝶呤片購自貴州鼎晟泰生物科技有限公司。希森美康(sysmex)自動血細胞分析儀等。

1.2 方法

1.2.1 建模CIA模型鼠:按照動物福利保護法進行實驗(本校倫理委員會動物實驗倫理審查表編號:20231013)。40只SD雄性大鼠,隨機分為建模組32只和正常組8只。將CⅡ溶于0.1 g/ml醋酸溶液,制成濃度為1 mg/ml CⅡ溶液,搖床4 ℃過夜。次日將CFA與CⅡ溶液按體積比2∶1混合于冰上乳化成乳劑(即膠原誘導關節炎建模液)。所有建模組大鼠左右后足掌部皮內注射CIA建模液0.50 mg/只。

1.2.2 建模組大鼠分組:CIA建模后大鼠足關節炎指數評分≥3.5分,出現后足或前足踝關節明顯腫脹、關節紅腫等,視為建模成功[13]。將建模組大鼠隨機分為花蝴蝶低劑量治療組(花蝴蝶低組)、花蝴蝶高劑量治療組(花蝴蝶高組)、甲氨蝶呤治療組(甲氨蝶呤組)、CIA模型組(模型組),每組8只大鼠。

1.2.3 灌胃給藥:各組行灌胃給藥實驗,根據民間用藥經驗和前期實驗確定[12-13],花蝴蝶高、低組分別每天灌胃藥液7.6 mg/kg、3.8 mg/kg,甲氨蝶呤組灌胃以1.04 mg/kg(每周2次),模型組和正常組大鼠均生理鹽水灌胃,灌胃約35 d即可停止給藥。

1.3 觀察指標及方法

1.3.1 大鼠足關節腫脹指數評分:CIA模型鼠建模成功的第1、4、8、12、16、20、24、28和32天,觀察、評估和照相大鼠左右后足跖及相關組織、關節腫脹指數評分。

1.3.2 血液指標:末次給藥第2天,腹腔注射20%烏來糖(6 ml/kg)麻醉[14]后,取股動脈全血3 ml/只并立即送貴州醫科大學第三附屬醫院檢驗科檢測外周血白細胞計數、淋巴細胞計數、單核細胞計數、淋巴細胞/單核細胞、紅細胞計數、血細胞比容、血小板計數、平均血小板體積等指標。

1.3.3 足關節骨髓腔病理切片:麻醉大鼠(方法同“1.3.2”)后,取膝關節、趾關節等,并用4%多聚甲醇固定,即送黔南州人民醫院病理科制作大鼠足關節病理切片(HE染色),后掃描切片為數字圖像資料備用。

2 結 果

2.1 各組大鼠足關節腫脹指數評分比較 模型組大鼠足關節腫脹指數評分明顯高于花蝴蝶低組、花蝴蝶高組、甲氨蝶呤組和正常組(P<0.01);正常組、甲氨蝶呤組、花蝴蝶高組、花蝴蝶低組足關節腫脹指數評分比較差異無統計學意義(P>0.05),見表1。

表1 各組大鼠足關節腫脹指數評分比較分)

2.2 各組大鼠外周血白細胞計數、淋巴細胞計數、單核細胞計數、淋巴細胞/單核細胞、紅細胞計數、血細胞比容、血小板計數、平均血小板體積比較 與其他各組比較,模型組大鼠外周血白細胞計數、淋巴細胞計數、單核細胞計數、紅細胞計數、血細胞比容、血小板計數檢測指標均升高(P<0.01),而模型組大鼠外周血淋巴細胞/單核細胞、平均血小板體積均降低(P<0.01)。正常組、甲氨蝶呤組、花蝴蝶高組、花蝴蝶低組外周血相關檢測指標各組間比較差異無統計學意義(P>0.05),見表2。

表2 各組實驗鼠外周血白細胞、淋巴細胞等8項指標檢測結果比較

2.3 各組大鼠膝關節病理切片結果比較 與其他各組比較,模型組大鼠膝關節骨髓腔淋巴細胞、單核細胞等評分均升高,脂肪細胞評分均降低(P<0.01)。正常組、甲氨蝶呤組、花蝴蝶高組、花蝴蝶低組大鼠膝關節骨髓腔淋巴細胞、單核細胞增生和脂肪細胞減少各組間比較差異無統計學意義(P>0.05),見表3。染片結果見圖1。

圖1 各組實驗鼠膝關節骨髓腔病理切片圖(HE染色,倍數×70 μm)

表3 各組實驗鼠膝關節骨髓腔淋巴細胞、單核細胞和脂肪細胞變化病理評分比較分)

3 討 論

3.1 苗藥花蝴蝶對CIA模型鼠白細胞變化的回調作用 從表2可知,苗藥花蝴蝶能顯著回調CIA模型鼠外周血白細胞、淋巴細胞、單核細胞等指標升高,淋巴細胞/單核細胞比值降低。結合文獻資料報道“外周血淋巴細胞升高、淋巴細胞/單核細胞比值降低是RA的臨床多指標聯合輔助診斷措施[3-4,11,15]”“大量單核細胞/巨噬細胞顯著導致RA[5]”等,提示苗藥花蝴蝶對CIA模型鼠外周血細胞的顯著回調作用可用于RA患者的臨床治療,且可能對緩解淋巴細胞、單核細胞升高和淋巴細胞/單核細胞比值降低型RA患者的作用明顯。同時,苗藥花蝴蝶能顯著回調CIA模型鼠膝關節骨髓腔淋巴細胞、單核細胞等顯著彌漫性增生。表3結果顯示,CIA模型鼠骨髓腔產生大量淋巴細胞、單核細胞等,導致外周血相關血細胞增多及關節炎癥,苗藥花蝴蝶可能通過回調CIA模型鼠骨髓淋巴細胞、單核細胞等大量增生達到緩解CIA模型鼠發展趨勢。因此推測,本省民族民間使用苗藥花蝴蝶治療RA的初步作用機制之一可能是該藥通過緩解RA患者骨髓淋巴細胞、單核細胞等升高和淋巴細胞/單核細胞比值降低,回調了RA患者外周血相關血細胞的變化,最終達到治療RA目的。

3.2 苗藥花蝴蝶回調紅細胞和血細胞比容作用 本研究結果表2顯示,苗藥花蝴蝶能顯著回調CIA模型鼠外周血紅細胞、血細胞比容等升高。結合資料報道“紅細胞相關指標水平與傳統反映RA活動度的炎癥呈正相關[7]”,提示苗藥花蝴蝶的回調作用可用于緩解RA患者外周血紅細胞、血細胞比容等指標,這也可能是苗藥花蝴蝶治療RA患者的作用機制之一。

3.3 苗藥花蝴蝶回調CIA模型血小板作用 本研究結果表2顯示,苗藥花蝴蝶能顯著回調CIA模型鼠外周血血小板升高和平均血小板體積降低。結合資料研究結果“RA患者外周血血小板參數變化與疾病活動具有相關性”[8-9,16]提示,苗藥花蝴蝶的回調作用可用于緩解RA患者外周血小板和平均血小板體積,這可能是苗藥花蝴蝶治療RA患者的作用機制之一。

綜上所述,苗藥花蝴蝶可能通過回調CIA模型鼠骨髓淋巴細胞、單核細胞、紅細胞、血細胞比容、血小板等指標升高和平均血小板體積、淋巴細胞/單核細胞比值降低,回轉CIA模型鼠外周血相應血細胞變化,最終達到緩解CIA模型鼠癥狀。這可能是苗藥花蝴蝶治療RA的初步作用機制,應進一步研究。

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