耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌現狀及耐藥機制分析

丁金蓉,李小彬,王蔚,翁育清

銅綠假單胞菌分布廣泛,具有極強的環境適應能力,是常見醫院內獲得性感染的重要條件致病菌[1]。因其對多種抗菌藥物存在天然耐藥以及容易獲得性耐藥,導致可選用的抗菌藥物越來越少,且隨著人口老齡化、惡性腫瘤放化療、介入性診療技術的發展、臨床上廣譜強效抗菌藥物的大量應用、免疫缺陷宿主的增加、抗生素不合理使用和異質性耐藥情況的發生,逐漸出現多藥耐藥或泛藥耐藥現象,給臨床治療帶來更大困難[2]。碳青霉烯類革蘭陰性桿菌檢出率在全球范圍內呈逐年增高趨勢,臨床抗感染治療常面臨無藥可用的困境,疾病負擔重,成為中國乃至世界最重要的公共衛生問題之一[3]。根據WHO 2017年所發表的《WHO PRIORITY PATHOGENS LIST FOR R&D OF NEW ANTIBIOTICS》,耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌(CRPA)被納入對人類健康構成最大威脅的12種耐藥菌目錄中,并列為最高級別1-,說明銅綠假單胞菌的嚴重耐藥性已對人們健康造成巨大威脅。

1 國內耐藥菌分布情況

根據2020年CHINET中國細菌耐藥監測網收集全國52所醫院臨床分離菌共251 135株,其中革蘭陰性菌占71.9%,前五位的細菌排名分別為大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌。其中銅綠假單胞菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為23.2%和19.3%[4]。

2 CRPA的流行病學特點及耐藥機制概括

2.1 流行病學特點 根據各地耐藥菌統計數據可看出,CRPA的樣本搜集主要分布于醫院的呼吸內科、重癥監護室、神經外科、血液內科等科室[5-7]。銅綠假單胞菌主要分離自痰標本,且主要集中在住院周期長以及惡性腫瘤的放化療、介入性診療技術操作比如插胃管、氣管插管等患者。銅綠假單胞菌呈現出臨床檢出率高、科室分布廣泛、耐藥現象嚴重的特點,研究CRPA耐藥機制有益于臨床進一步治療以及阻斷其耐藥傳播[6]。

2.2 耐藥機制

2.2.1 固有(自然)耐藥性:固有可定義為一種細菌物種內普遍共有的特性,固有耐藥性又稱天然耐藥性,由細菌染色體基因所決定,由自身基因產生的該種特有結構可對抗抗生素的某種作用機制,這類基因位置保守且與耐藥相關,會隨著基因傳給下一代,不會輕易改變。與獲得性耐藥相比,固有耐藥的研究報道較少,大多數人認為固有耐藥機制研究相對清楚且只能垂直傳播,常局限于個別種類的細菌。但近期有研究發現固有耐藥與獲得性耐藥密切相關,甚至能被移動元件捕獲進而可水平轉移至其他細菌[8]。固有耐藥的作用機制主要有膜的通透性、外排泵表達及酶的產生[9-11]。

2.2.2 碳青霉烯酶的產生:碳青霉烯酶的產生是碳青霉烯類抗生素耐藥的一個主要原因,能通過化學修飾或水解碳青霉烯類抗菌藥物等使大多數β-內酰胺抗菌藥物包括碳青霉烯類抗生素失去活性[12]。β-內酰胺酶根據Ambler分類可分為A、B、C、D 4類,碳青霉烯酶是一種能水解碳青霉烯類的β-內酰胺酶,包括以絲氨酸為活性中心的A、D類和通過金屬離子來抑制碳青霉烯類藥物的β-內酰胺酶的B類[13]。

2.2.2.1 A類絲氨酸碳青霉烯酶:A類酶是一種絲氨酸酶,可利用活性中心的絲氨酸殘基滅活β-內酰胺類藥物,主要包括KPC、SME、GES酶家族[14]。對于CRPA,最值得關注的是GES酶,blaGES主要以基因盒的形式存在于耐藥菌株的Ⅰ類整合子上,可通過結合轉座子、質粒等可移動基因元件來獲得水平轉移能力,產生對碳青霉烯抗生素的水解活性[15-16]。

2.2.2.2 金屬β-內酰胺酶(MBLs):B類酶是一類金屬β-內酰胺酶,是細菌產生耐藥性的主要機制之一[17-18]。目前國內外發現并報道的B類金屬酶主要有NDM、VIM、IMP、SIM、GIM等,目前最為常見的包括IMP、NDM及VIM[19]。VIM型酶于1996年首次被發現,目前包含60種不同等位基因變異體。VIM-2是最常見的MBLs,主要存在于銅綠假單胞菌中,其他腸桿菌屬也可見,其編碼基因位于細菌染色體或質粒上,并常以基因盒形式存在于整合子中。López等[20]測量了亞胺培南、頭孢他啶、頭孢吡肟和哌拉西林對表達不同MBLs三種菌株的最低抑菌濃度(MIC),發現NDM-1在銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌中抗性水平最高。多個試驗都說明MBLs基因的存在和其產生的金屬酶是銅綠假單胞菌對碳青霉烯類耐藥的機制之一[21]。

2.2.2.3 D類酶碳青霉烯酶(OXA酶):現在已發現的OXA酶有400多種,其中OXA-48被廣泛報道[22],但D類β-內酰胺酶最常在不動桿菌屬中發現,主要在銅綠假單胞菌對其他抗菌藥物的耐藥機制中,而非碳青霉烯類抗菌藥物。

2.2.3 細胞膜通透性下降:膜孔蛋白對細菌耐藥性產生有十分重要的作用,一般細菌的細胞外膜上含有允許小分子蛋白通過的孔蛋白,其中允許抗生素通過的孔蛋白包括OprC、OprD、OprE、OprF、OprG 和OprH等,膜孔蛋白的數量決定了進入菌體的抗菌藥物濃度,無論是數量減少還是缺失都會影響抗菌藥物的進入從而使細菌產生一定耐藥性。銅綠假單胞菌的外膜上分布OprC、OprD、OprE等具有孔道活性的蛋白[12]。OprD是一種孔徑較小、且具有特異性的孔道蛋白,主要允許碳青霉烯類抗菌藥物通過[23]。研究發現,耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌中OprD基因表達降低甚至未檢測到OprD基因表達,并發現部分CRPA中OprD基因發生突變,說明OprD在耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌中起關鍵作用[24-25]。OprD孔蛋白減少可導致抗生素不能通過細胞外膜,降低銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素的滲透性,從而產生耐藥性。同時有研究顯示,在中國OprD的突變失活是銅綠假單胞菌對亞胺培南產生耐藥性的主要原因[26-27]。

2.2.4 外排泵系統的表達:細菌外排泵系統可主動將菌體內的藥物泵出到菌體外,使菌體內有效藥物濃度降低,從而減弱抗菌藥物作用,使細菌產生耐藥性,這是CRPA的重要機制之一[28]。革蘭陰性菌的三聯多藥外排系統由內膜轉運蛋白、外膜通道和周質銜接蛋白組成[29-30]。目前研究報道與碳青霉烯類藥物耐藥的銅綠假單胞菌相關RND家族外排泵包括Mex AB-OprM、Mex CD-Opr J、MexXY-OprM等[31]。其中研究較透徹且被人們普遍驗證接受的是Mex AB-OprM,Mex AB-OprM為周質融合蛋白(Mex A)、RND轉運體(Mex B)和OprM的三聚體。當碳青霉烯類抗菌藥物經外膜孔蛋白進入膜間隙后會被內膜分布的Mex B捕獲,通過膜融合蛋白Mex A的橋聯作用經外膜蛋白OprM排出菌體外,外排系統的高表達可引起亞胺培南和美羅培南兩者的MIC值都升高。有研究對75株耐碳青霉烯類抗生素銅綠假單胞菌外排泵的作用進行研究并發現外排泵Mex AB-OprM的過度表達在CRPA中起重要作用。

2.2.5 青霉素結合蛋白(PBPs)的改變:PBPs是合成和重塑細菌肽聚糖細胞壁的主要催化劑,是細菌生長繁殖中不可或缺的酶。β-內酰胺抗生素可通過與PBPs結合,抑制PBPs酶活性,干擾細菌繁殖過程中細胞壁形成,并達到抗菌作用[32-33]。銅綠假單胞菌的PBP3是負責細胞壁肽聚糖合成的一種必需酶,可由β-內酰胺類抗生素共價滅活[34]。有研究指出,在對碳青霉烯類耐藥的銅綠假單胞菌中可發現PBP3表達量降低,表明PBPs改變是CRPA的其中一個機制[35]。

2.2.6 細菌生物膜(BF)的形成:BF是指細菌附著于惰性物體或生物物體表面由細菌及自身分泌的胞外基質組成的細胞外聚合物。BF結構穩定,可幫助細菌逃避宿主免疫應答、抵擋抗菌藥物的殺菌作用,從而對抗生素產生耐藥。張艷芳等[36]通過研究發現亞胺培南耐藥菌株的BF形成能力明顯強于敏感菌株,說明BF的形成在銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素耐藥產生過程中起到一定作用。Rossi等[37]對CRPA BF濃度測定的研究結果表明所有菌株均表現出較強BF形成能力,進一步表明BF產生在銅綠假單胞對碳青霉烯類抗生素耐藥中發揮重要作用。

3 小結與展望

抗生素耐藥性現已成為最大的公共衛生威脅之一。革蘭陰性病原體嚴重威脅公眾健康,同時碳青霉烯類抗生素作為臨床抗感染治療的一線藥物也受到了巨大挑戰?，F由于細菌多藥耐藥性而無法治療的感染在臨床中越來越普遍。了解CRPA耐藥機制及傳播途徑有助于為臨床用藥及預防、抗生素研究提供相應科學依據。

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