基于Wnt/β-catenin信號通路干預糖尿病足創面愈合的中藥研究進展

楊寧，王藝晨，丁選勝

（中國藥科大學基礎醫學與臨床藥學學院，江蘇 南京 211198）

糖尿病足（diabetic foot，DF）是糖尿病患者最嚴重的并發癥之一，是糖尿病所致的足部潰瘍或肢端壞疽，常伴有感染。根據相關流行病學數據顯示，全球DF成人患者的足潰瘍患病率平均為6.3%，3 ～ 5年復發率為65%，終生下肢截肢發生率約為20%，5年死亡率高達50% ～ 70%[1]。因DF具有易復發、高致殘率和高死亡率等特點，導致DF的臨床治療頗具挑戰。

目前普遍認為，持續性高血糖引起的糖尿病神經病變和血管病變是DF的主要病因，進一步的細菌感染加劇了DF的治療難度，創面久治不愈[2-3]。針對DF創面的藥物治療，在內科管理的基礎上，西醫常采取口服擴血管藥物、抗凝藥物、鎮痛藥等改善下肢血液供應或神經疼痛，但因藥物毒性、成癮性等較多不良反應導致臨床治療困難[4]。近年來，中醫藥在促進DF創面愈合方面具有標本兼治、辨證論治、安全低毒等鮮明優勢，表現出較好的臨床效果。DF屬中醫“筋疽”“脫疽”范疇，虛實夾雜，是濕、熱、毒、虛等因素共同作用的結果[5]。我國DF防治指南[6]推薦，根據中醫辨證分型或創面愈合不同分期可采用中藥熏洗外敷、口服中成藥或復方湯劑等，以清化濕毒、溫通經脈、活血化瘀。Wnt/β-catenin信號通路在調節細胞生長、組織修復、器官發育等方面至關重要。此外，中藥基于Wnt/β-catenin信號通路干預DF創面愈合的研究逐年增多。本文對近年來基于Wnt/β-catenin通路調控DF創面愈合的中藥及中藥活性成分研究進展進行綜述，以期為DF的新藥研發及臨床治療提供參考。

1 Wnt/β-catenin信號通路的組成及調控

Wnt基因發現于小鼠乳腺癌的整合酶1（integration 1，Int1）和果蠅的無翅（wingless，Wg）基因，由于這2個基因的結構和蛋白功能相似，故將其組合命名為Wnt基因[7-8]。Wnt信號通路包含經典信號通路（Wnt/β-catenin）和非經典信號通路，兩種主要通路形成相互調控的網絡，參與哺乳動物某些組織的自我更新與修復[9-10]。Wnt配體是分泌性糖蛋白，結合膜上的卷曲受體蛋白（frizzled，FZD）和低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6（low-density lipoprotein receptor-related proteins 5/6，LRP5/6），啟動誘導信號；β-連環蛋白（β-catenin）是具有調節細胞間黏附及基因轉錄的雙功能蛋白，受Wnt信號誘導后入核，參與下游信號傳導[11]。經典的Wnt途徑是高度保守的，當無Wnt時，胞質中結腸腺瘤樣息肉蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）與支架蛋白軸蛋白（axis inhibitor，Axin）、酪蛋白激酶1（casein kinase 1，CK1）以及糖原合酶激酶-3β蛋白（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）共同組成“破壞復合體”，捕獲并降解β-catenin蛋白；當Wnt存在時，其被跨膜受體FZD和LRP5/6識別，“破壞復合體”被招募至細胞膜上，與FZD相互作用，失去了對β-catenin的降解能力。誘導的β-catenin可易位至細胞核，并激活核轉錄因子——T細胞因子（T cell factor，TCF）和淋巴樣增強結合因子（lymphoid enhancer binding factor，LEF），從而啟動下游細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、c-Myc、TCF1、Axin2等靶基因的轉錄，介導細胞增殖、遷移和分化相關基因的表達[12]。

2 Wnt/β-catenin信號通路在糖尿病足創面愈合中的作用

正常的創面愈合主要包括止血、炎癥、增殖和重塑4個階段[13]。與正常愈合過程相比，DF的創面愈合多表現為炎癥階段的時間延長、細胞增殖受限和組織重塑失衡，伴隨眾多關鍵結構蛋白和調節因子失調[14]。大量研究表明，Wnt/β-catenin信號通路是調節傷口愈合、血管新生、上皮重塑、維持干細胞多能性的關鍵通路之一[15]。相關研究也闡述了Wnt/β-catenin信號通路的部分效應蛋白可通過調節葡萄糖穩態、胰島β細胞增殖直接參與1型糖尿病或2型糖尿病發生發展[16]。檢測糖尿病足潰瘍（diabetic foot ulcer，DFU）患者創面肉芽組織的β-catenin與GSK-3β的表達結果顯示，DFU患者Wagner分級越高，創面組織中β-catenin表達水平越低，GSK-3β表達水平越高，Wnt/β-catenin信號通路功能越差；Spearman相關性分析進一步提示，激活Wnt/β-catenin信號通路可能對DFU創面愈合產生積極影響[17]。

2.1 Wnt/β-catenin信號通路調節炎癥

傷口愈合早期，適度的炎癥反應有助于機體清除病原體，但在糖尿病創面愈合中，晚期糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGE）累積，阻礙了中性粒細胞對細菌及細胞碎片的吞噬能力，同時大量單核細胞募集并向巨噬細胞轉化，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6等促炎細胞因子過度釋放，導致持續的炎癥反應，繼而損害后續的增殖及組織再上皮化[18]。巨噬細胞（macrophage，Mp）是創面愈合中Wnt配體的重要來源，而巨噬細胞功能障礙又是啟動炎癥反應的主要因素[19]。研究表明，慢性傷口周圍約80%的細胞是促炎的M1巨噬細胞，M1與抗炎的M2巨噬細胞穩態被打破，因此通過Wnt調節M1/M2巨噬細胞比例平衡是促進傷口愈合的策略之一[20-21]。另一項實驗研究顯示，糖尿病創面形成21天后，即創面愈合的中后期，糖尿病創面較正常創面組織中IL-6和TNF-α水平顯著升高（P＜0.01），Wnt1、Wnt3a和β-catenin蛋白表達明顯降低（P＜0.01），說明炎癥反應可能貫穿糖尿病創面愈合的整個階段，且對Wnt/β-catenin通路的抑制介導了這一過程[22]。

2.2 Wnt/β-catenin信號通路調節血管新生

不管是神經性DF還是缺血性DF，內皮功能障礙均是創面難愈的共同分子機制[23]。內皮細胞是維持血管張力與物質代謝穩態的必要細胞基礎。持續性高血糖損害內皮屏障，血管活性物質的釋放減少，從而阻礙創面的血液流動及血管新生。Wnt/β-catenin信號轉導與血管重塑關系密切，該通路不僅調節內皮細胞的血管生成活性，還能促進多能干細胞向血管內皮細胞的分化[24-25]。另一方面，巨噬細胞可以分泌Wnt5a、Wnt7b等蛋白，直接或間接地促進糖尿病患者傷口的血管重塑[26-27]；體外實驗也表明，Wnt9b/β-catenin信號受到抑制時，人血管內皮細胞的增殖和成管能力明顯降低，細胞凋亡進程加快，阻礙了傷口的愈合[27]。

2.3 Wnt/β-catenin信號通路調節細胞增殖與組織重塑

角質形成細胞與成纖維細胞在增殖階段發揮重要作用，它們的募集和活化是細胞增殖階段的重要特征。在難愈性糖尿病創面中，這2種細胞的增殖及遷移被抑制，分泌的生長因子減少，細胞間緊密連接受損；另一方面，基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）增多會破壞細胞外基質屏障，減緩了創面的再上皮化[28-29]。在促進DF創面愈合中，受損的神經細胞會進行再生和重塑；體外神經干細胞研究表明，Wnt3a信號的激活增加了β-catenin的蓄積和入核，促進靶基因Cyclin D1的轉錄，與細胞的增殖與分化呈正相關[26]。糖尿病創面組織病理學研究結果也顯示，在傷口愈合后期，促進創面組織Wnt/β-catenin正性調控因子的表達，抑制GSK-3β負性調控因子水平，可以明顯促進肉芽組織的增生及再上皮化[30]，提示Wnt/β-catenin信號轉導在創面愈合后期的重要性。

2.4 Wnt/β-catenin信號通路調節細胞凋亡

Wnt/β-catenin信號轉導與細胞凋亡的關系目前尚存爭議。部分研究表明，激活Wnt/β-catenin通路可以改善細胞凋亡，如抑制腎損傷疾病中腎小管上皮凋亡[31]，減緩生殖疾病中顆粒細胞凋亡[32]，可對抗疾病發展；然而在大多數癌癥中，Wnt/β-catenin通路的激活是腫瘤細胞的自我防御，從而促進腫瘤的轉移及生長[33-34]。在糖尿病創面愈合中，現有研究的結論相對一致，高糖可以抑制Wnt等蛋白表達，阻礙β-catenin及下游靶基因的轉錄，從而使得抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤-2（B cell lymphoma 2，Bcl-2）表達水平下降，促凋亡蛋白如含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Caspase 3）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）表達增加，引起細胞的增殖、遷移和分化受損，導致內皮功能障礙，促進凋亡進程[35-36]。對DF患者創面組織檢測結果顯示，Wnt1和β-catenin與血管內皮生長因子、胰島素樣生長因子、Bcl-2的表達呈正相關，與TNF-α、IL-6、Caspase-3 、Bax呈負相關；GSK-3β與之關系則相反[37]。上述研究結果表明，DF創面中Wnt/β-catenin通路受到抑制，激活Wnt/β-catenin信號轉導，可能是抑制功能細胞凋亡的有效途徑。

3 干預Wnt/β-catenin信號通路改善糖尿病足創面愈合的相關中藥

已有實驗及臨床研究表明，許多中藥復方及中藥活性成分可有效改善DF創面愈合。下文就干預Wnt/β-catenin信號通路改善DF創面愈合的中藥復方、中成藥及中藥單體研究進展進行總結。

3.1 中藥復方

3.1.1 四妙勇安湯四妙勇安湯為傳統經典名方，首見于《華佗神醫秘傳》，后收錄于《驗方新編》中，該方由金銀花、玄參、當歸、甘草4味中藥組成。四妙勇安湯是我國糖尿病足防治指南推薦用藥，具有調節血脂、改善神經傳導速度阻滯與局部缺血等臨床癥狀，加快創面愈合的治療效果[38-39]。為探討四妙勇安湯的可能作用機制，趙亞男等[40]構建2型糖尿病潰瘍大鼠模型，結果發現模型組大鼠較正常組創面愈合明顯延遲；創面組織的蛋白及基因水平檢測結果顯示，β-catenin含量明顯降低，GSK-3β含量明顯升高（P＜0.05）；給予四妙勇安湯干預，可緩解Wnt/β-catenin通路的抑制狀態，從而促進潰瘍創面愈合；動態評估不同時間點的創面病理變化及蛋白水平發現，四妙勇安湯多影響創面愈合早期的炎癥階段。

3.1.2 愈瘍靈軟膏愈瘍靈軟膏由紫草、地骨皮、當歸、血竭、象皮粉、黃柏等多味中藥組成，具有涼血散瘀、斂瘡生肌的功效?？紤]DF創面屬“血熱血瘀”之證，相關動物實驗便引申探討了愈瘍靈軟膏對DF大鼠潰瘍愈合的作用及機制，結果顯示愈瘍靈軟膏可有效改善DF大鼠潰瘍創面的病理損傷[41]；與四妙勇安湯干預的起效時間對比研究發現，愈瘍靈軟膏也可調控Wnt信號通路，但主要在DF創面愈合的后期，即增殖與重塑階段發揮促愈合作用[42]。內服及外用是DF疾病管理的重要手段，愈瘍靈軟膏外用聯合四妙勇安湯內服的實驗結果表明，聯合給藥組均優于單獨給藥組，提示在DF的治療中應內治外治并重[42]。

3.1.3 如意黃金散如意黃金散首載于明代《外科正宗》，具有清熱排毒、活血止痛的功效。如意黃金散現臨床用于治療靜脈炎、肛周膿腫等多種疾病，如對于肛周膿腫總有效率可達95%，能明顯縮短傷口愈合時間[43]。前期臨床研究表明，如意黃金散能明顯提高DF患者的潰瘍治愈率[44]；最新的實驗研究表明，如意黃金散在體外可劑量依賴性地增強成纖維細胞的抗氧化、抗炎、增殖和遷移能力；在體內升高細胞生長因子水平，增加血管和膠原蛋白的生成，其分子機制與激活Wnt信號通路有關，從而加速傷口愈合進程[45]。

1928年的《中國教育辭典》：“教育的定義有廣義、俠義兩種。廣義說，凡足以影響人類身心之種種活動，都可以叫教育；狹義上說，用一定的方法實現之改善目的者，可稱為‘教育’?！?930年的《教育大辭書》：“廣而言之，凡足以感化身心之影響，俱得云教育，只稱其結果，不計其方法；狹而言之，則惟具有目的，出以一定方案者，始云教育?！?985年的《中國大百科全書·教育》：“從廣義上說，凡是增進人們的知識和技能，影響人們的思想品德的活動，都是教育；狹義的教育主要指學校教育，其含義是教育者根據一定社會或階級的要求，有目的、有計劃地對受教育者地身心施加影響，把他們培養成為一定社會階級所需要的人的活動?！?/p>

3.1.4 拔毒生肌散拔毒生肌散由黃丹、紅粉、輕粉、制甘石、冰片等8味藥研磨而成，全方配伍，主攻拔毒生肌，兼能清熱祛腐。相關專家共識推薦拔毒生肌散可廣泛運用于多種慢性難愈性創面，如DF，且臨床療效及安全性良好[46]。DF的始發因素之一是AGE在組織中的積累，王雙勛等[47]研究發現，拔毒生肌散可降低大鼠潰瘍組織中AGE沉積和晚期糖基化終末產物受體（receptor of advanced glycation endproducts，RAGE）表達，且改善下游Wnt/β-catenin通路的抑制，促進糖尿病潰瘍創面愈合。

3.1.5 回陽生肌膏回陽生肌膏是北京中醫院用于治療慢性皮膚潰瘍陰瘡的院內方劑，能有效降低局部炎癥反應，抑菌殺菌，促進血管新生[48]。一項對DF大鼠潰瘍陰證創面的干預研究顯示，回陽生肌膏給藥第14天時，創面愈合率可達到83.26%，較模型組創面愈合率明顯提高，且Wnt/β-catenin信號通路的激活是其分子作用機制之一。

3.1.6 紫朱軟膏紫朱軟膏是柳國斌團隊基于中醫“煨膿長肉”理論及奚九一教授的“撈底膏”，創制的特色藥膏，方中以紫草和朱砂為君藥祛腐生肌，阿膠、龍血竭、黃芪為臣藥以補氣斂瘡，佐為冰片以清熱止痛，發揮促愈功效[49]。紫朱軟膏系列的研究成果表明，該方可應用于糖尿病性潰瘍愈合的整個階段，改善 “熱”“瘀”“虛”等病理病征，具有較好的臨床療效[50]。Wnt/β-catenin通路的激活是紫朱軟膏治療DF的作用機制之一。一項納入60例DFU患者的臨床研究報道，紫朱軟膏治療后能明顯改善DFU患者潰瘍組織中β-catenin、c-Myc、RSPO3等基因的轉錄水平低下，并降低GSK-3β基因的表達（P＜0.05）[51]。

3.1.7 畬藥十二時辰復方十二時辰是閩東地區畬族常用的特色中草藥，被廣泛用于風濕骨痛、跌打損傷；三葉青又名金線吊葫蘆，臨床外治常用于蜂窩織炎。劉思延[52]將十二時辰與三葉青兩藥配伍，研究畬藥十二時辰復方對DFU創面愈合的作用及機制，動物實驗結果表明，模型組創面愈合平均周期約14天，創面組織的新生血管數量減少，肉芽增生緩慢，畬藥十二時辰復方給藥能明顯縮短愈合時間，改善相關病理變化；同時，該研究結果表明，與正常組相比，DFU模型大鼠創面組織中β-catenin 蛋白表達明顯降低，GSK-3β蛋白含量則進一步積累，再次證實了Wnt/β-catenin信號通路功能低下與DFU愈合發展的相關性。由于該復方是研究人員的初步組方探索，所以對于畬藥十二時辰復方改善DF創面愈合的療效及機制有待進一步基礎及臨床研究。

3.1.8 愈潰油中藥油劑愈潰油，由西紅花、核桃仁、全墨魚干和菜籽油組成，具有流通氣血、防止毒邪內陷、透膿并托毒外泄等功效。郝治等[53]對該油劑與糖尿病皮膚潰瘍的Wnt/β-catenin信號通路關系進行探究發現，經愈潰油油劑處理9天和16天后，均可以顯著提高創面愈合率、改善創面病理變化，減輕炎癥反應；分子機制研究表明，糖尿病抑制了創面組織中血管新生與成纖維細胞活化的標志蛋白水平，愈潰油給藥后激活Wnt信號通路，緩解了α平滑肌肌動蛋白（alpha smooth muscle actin，α-SMA）、血管假性血友病因子（von Willebrand factor，VWF）及Wnt、β-catenin的降低，進而促進了內皮細胞和平滑肌細胞的形成與分化。

3.2 中成藥

黃芪注射液是傳統中藥黃芪的滅菌溶液制劑。黃芪是補氣活血的代表藥物，早在《神農本草經》《本草匯言》等中已被記載，其具有通暢血脈，排膿止痛，斂收久潰癰疽等眾多功效。黃芪注射液在臨床應用于DF干預時，可通過改善患者的神經與血管功能，促進創面肉芽再生與上皮化等發揮較好的治療效果[54-55]；相關動物實驗研究表明，黃芪注射液經灌胃給藥后可活化Wnt/β-catenin信號通路，顯著促進糖尿病大鼠創面表皮干細胞的增殖與分化，從而有效縮短創面愈合時間，且該作用具有一定的量效關系[56]。

3.3 中藥單體

3.3.2 黃芪多糖黃芪多糖是黃芪的主要藥效成分，黃芪多糖作為一種多靶點生物活性物質，已被證實可以促進糖尿病性潰瘍愈合[61]。相關實驗研究也表明，在1型糖尿病皮膚潰瘍大鼠模型中，灌胃黃芪多糖200 mg · kg-1可調節大鼠傷口愈合階段炎癥因子水平，促進血管新生、組織重塑，縮短創面愈合時間[62]。同樣，以黃芪多糖、黃芪皂苷為主要成分的黃芪提取液能有效促進糖尿病創面表皮干細胞的增殖與分化，從而促進創面修復與再生，并受Wnt/β-catenin的調控[63]。環黃芪醇為黃芪的另一活性單體成分黃芪甲苷的皂苷元，具有良好的生物利用度，體外研究顯示，環黃芪醇可促進表皮干細胞的增殖和遷移，激活Wnt/β-catenin信號通路，促進糖尿病性創面愈合[64]。此外，黃芪及其活性成分基于Wnt/β-catenin信號通路還介導了抑制細胞凋亡、改善MMPs分泌等過程[65]。

3.3.3 蘆薈多糖蘆薈多糖是蘆薈凝膠中的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗糖尿病及傷口修復等多種藥理作用[66]。DFU創面的內皮細胞受損，遷移修復所需的生長因子水平降低，經蘆薈多糖干預糖尿病大鼠潰瘍創面后，能增加血清堿性成纖維細胞生長因子和血小板衍生生長因子-BB水平，同時調節Wnt/β-catenin表達以促進傷口愈合[67]。

4 結語與展望

尋求DFU愈合的有效治療藥物與作用靶點一直是臨床關注的熱點[68]。多項研究發現，Wnt/β-catenin信號轉導調控DF創面愈合的各個階段，尤其在調節炎癥、促進血管新生方面發揮重要的作用。上述四妙勇安湯、如意黃金散、拔毒生肌散是傳統中藥名方，愈瘍靈軟膏、回陽生肌膏、紫朱軟膏等是院內經驗方，此外黃芪注射液、積雪草苷、黃芪多糖及蘆薈多糖等，均能改善糖尿病創面中Wnt/β-catenin信號轉導的抑制或失衡，從而促進DF的創面修復。關于調控Wnt/β-catenin信號通路改善DF創面愈合的中藥研究雖取得了一些進展，但仍存在一些不足，主要表現在：1）調控Wnt/β-catenin信號通路改善DF的中藥復方研究偏多，中成藥及單體研究較少，中藥活性成分的研究還處于基礎實驗階段；2）基于Wnt/β-catenin信號通路的分子機制研究普遍尚不深入，實驗設計重在體內藥效學觀察，藥代動力學、毒理及體外細胞實驗評價較少；3）DF不同分型發病機制不同，實驗模型多未區分與比較DF分型及藥物在不同分型中的作用特點，且足潰瘍造模方法各異，缺乏評價標準；4）中藥成分多，作用靶點和途徑復雜，各成分之間的相互作用鮮少闡明，各通路之間的協同、拮抗作用有待進一步探究。因此，未來可針對上述幾方面進一步研究，有望為DF防治的新靶點及藥物開發提供科學依據。