噬菌體抗細菌生物膜機制及應用策略的研究進展

楊佩霓，李慶蓉，李 江，何 薇，和平安，呂 梅，楊 旭（昆明醫科大學第二附屬醫院檢驗科，昆明 650032）

近年來，隨著現代醫學中抗生素的濫用、新抗生素的開發速度減緩，迫使抗微生物藥物耐藥性（antimicrobial resistance，AMR）持續增加，導致全球范圍內的抗生素耐藥危機，若不采取有效措施，預計到2050年，將超過1 000 萬死亡病例與AMR有關[1]，并給世界經濟造成累計100 萬億美元的損失[2]。細菌抵御抗生素產生耐藥性的機制之一是細菌生物膜的形成。細菌生物膜可附著在活體組織、醫療設備、食品工業設備等表面形成復雜的微生物群落[3]，為細菌提供一個庇護所來防御環境中抗菌劑、饑餓、干燥等不利生存條件，顯著增加了細菌耐藥性和對宿主免疫系統的逃避能力。細菌生物膜的形成被認為是導致難治性、局限性和全身性感染的關鍵毒力因子，其能引起如肺部感染、慢性傷口、心內膜炎等組織相關感染及導管、植入物等醫療留置設備相關感染，即使應用抗生素或常用消毒劑也很難治愈[4]。噬菌體被認為是治療細菌生物膜有前景的替代方法，本文結合國內外研究現狀，對噬菌體抗細菌生物膜的作用機制及應用策略方面的最新研究進展進行綜述，為開發新型、高效的噬菌體抗細菌生物膜方法提供新思路。

1 細菌生物膜

細菌生物膜或細菌生物被膜（bacterial biofilms，BF）是指附著在生物和非微生物表面，并在其自產的大量多糖、胞外DNA(extracellular DNA，eDNA）、脂質、蛋白質等所組成的胞外聚合物基質（extracellular polymeric substances，EPS)的包裹下所形成的復雜微生物群落[5]，該群落表現為一種可包含相同或不同細菌物種的三維結構。任何細菌都可以形成生物膜，銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌和金黃色葡萄球菌是常見的形成生物膜的細菌。細菌生物膜的形成是一個動態的循環過程，涉及各種物理、化學和生物過程，主要包含細菌附著、形成和成熟、擴散三個階段[6-7]。在細菌生物膜中，EPS 基質占到了干重90%以上，而微生物細胞不到10%。EPS由不同的物質組成，包括水、胞外多糖、eDNA，蛋白質、脂類、外膜囊泡(OMVs)和Ca2+等[8]。細菌生物膜中除了細菌細胞和EPS 外，還存在能調控生物膜生理功能的信使分子。群體感應系統(quorum sensing，QS)是一種細胞間的通訊機制，該系統允許細菌根據其自身產生的信號分子（又被稱為自誘導物）的積累來檢測群體密度變化，進一步調節相關基因表達、促進生物膜的形成與分散[9]。細菌生物膜可通過多種機制協助細菌抵御外界不利的環境條件，以增強細菌耐藥性。這些機制包括厚層EPS基質能極大限制抗生素的擴散；生物膜內抗生素耐藥基因可通過轉化、轉導和結合進行水平轉移[10]；生物膜內細菌增強外排泵表達將包括抗生素藥物在內的胞內毒素泵出細胞等[11]，深入理解生物膜內細菌耐藥機制必將有助于探尋有效的治療策略來處理生物膜相關感染。

2 噬菌體的基本結構及特點

噬菌體（bacteriophage，phage）是一類能感染細菌并進行自我復制的病毒，于20世紀初分別由Frederick Twort 和Félix D’Hérelle 獨立發現。噬菌體在自然界中無處不在，被認為是世界上最豐富的物種之一，其數量約為1031，可能超過所有物種數量之和[12]。噬菌體體積微小，由蛋白質和核酸共同組成，蛋白質被認為是核酸的外殼，決定了噬菌體的結構形態，雙鏈或單鏈的DNA 或RNA 是噬菌體的遺傳物質。目前已發現數千種噬菌體，可形成尾狀、多面體、絲狀和多形性四種基本結構，其中以雙鏈DNA 具尾狀形態的噬菌體最為常見[13]。根據噬菌體生命周期的分類，可分為裂解性（毒性噬菌體）、溶原性（溫帶噬菌體）、慢性感染和假溶原性四種類型。其中裂解性噬菌體通過附著、注入、復制、組裝、裂解、釋放一系列過程特異性的感染細菌，在短時間內復制其基因組并實現自我增殖，最終導致宿主菌裂解死亡，被認為是適用于治療細菌感染的類型。與抗生素、消毒劑等傳統抗菌劑相比，使用噬菌體治療細菌相關感染具有許多優點，如特異度高、安全性好、具有嚴格的殺菌活性、單次或較低劑量就可以出現治療效果且誘導耐藥性的可能性較低等[14-15]。

3 噬菌體抗細菌生物膜機制

3.1 以水通道方式擴散 細菌生物膜是由空隙（也稱為水通道）形成的高度水合的結構，不僅有利于營養物質在細菌生物膜內進行擴散，也使得噬菌體在重力作用下通過這些水通道滲透到細菌生物膜的內部[16]。與傳統抗生素作用于細菌生物膜相比，噬菌體在滲透過程中不會出現濃度的消耗，反而能通過活躍的復制能力增加噬菌體的數量，使得細菌生物膜內部的微生物解體，從而干擾生物膜的整體三維結構。

3.2 酶降解 噬菌體的基因組能編碼合成各種特定的酶，如裂解酶（endolysin 或 lysin）、解聚酶（depolymerase）和病毒粒子相關肽聚糖水解酶（virionassociated peptidoglycan hydrolases，VAPGHs）等，這些酶能降解細菌肽聚糖、莢膜多糖等物質以協助噬菌體迅速破壞細菌生物膜的完整性，是噬菌體抗細菌生物膜的重要機制之一。裂解酶是噬菌體感染周期結束時產生的一種水解酶，它可以特異性地降解細菌細胞壁中的肽聚糖。該酶通常編碼在噬菌體的內部或尾部區域，不僅能從細菌內部裂解其細胞壁隨后釋放，也可以在外部發揮協助細菌細胞穿透親本噬菌體的作用[17]。而解聚酶通常表現為噬菌體的尾部纖維，以一種尾刺蛋白(tail spike protein，TSP)或游離酶的形式促進細菌生物膜中細菌細胞的解聚和噬菌體的吸附，能夠降解細菌表面莢膜多糖、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、O 型多糖鏈或生物膜外多糖甚至破壞細胞壁上的多肽或脂質[18]。根據作用機制的不同，解聚酶可分為水解酶和裂解酶。水解酶如唾液酸酶、木糖苷酶、左旋酶、葡聚糖酶和肽酶等可催化糖苷鍵的水解，屬于O-糖基水解酶；裂解酶以透明質酸、海藻酸和果膠/果膠酸裂解酶為主，其解聚過程不需要水的利用，是基于β-消除形成新的雙鍵。

3.3 持久性細胞的處理 持久性細胞（persister cell）是指在細菌生物膜深處產生的代謝不活躍的細菌細胞，表現為極低的細胞生長速度和細胞分裂率?？股刂饕饔糜诖x活躍的細菌細胞，當運用傳統抗生素治療細菌生物膜時，這些持久性細胞能進入到休眠狀態，而對抗生素作用幾乎不敏感。一旦治療停止時，持久性細胞能夠被重新激活，作為所形成新的細菌生物膜的宿主菌[19]，繼續導致細菌感染使得慢性感染復發。與抗生素不同，裂解性噬菌體可以有效感染并殺死處于休眠狀態的持久性細胞。

3.4 搭便車行為 噬菌體能夠吸附運動細菌的鞭毛以增強其運動性?；谠撎卣?，噬菌體(搭便車者)能搭上運動的非宿主細菌(載體)，從而促進噬菌體對生物膜中宿主菌的感染。YU 等[20]研究表明裂解型噬菌體PHH01 能夠吸附蠟樣芽孢桿菌鞭毛即搭在蠟樣芽孢桿菌載體上，搭上蠟樣芽孢桿菌便車的PHH01 的遷移能力不僅是單獨PHH01 的5.15 倍，而且對生物膜宿主菌大腸埃希菌的感染效率比單獨PHH01 高出4.36 倍。該研究證實了在噬菌體中的搭便車行為可以促進噬菌體感染生物膜細菌。

4 噬菌體與細菌生物膜的相互作用

噬菌體與生物膜內的細菌不是簡單的捕食與被捕食的關系，而是存在復雜的相互作用。一方面噬菌體通過編碼合成特定的降解酶等機制發揮有效的抗生物膜作用，另一方面，噬菌體也可以在某些情況下促進細菌生物膜的形成，例如低濃度噬菌體、特定噬菌體及原噬菌體等。①低濃度噬菌體可能會刺激生物膜的形成。研究者使用低濃度（102～104噬菌體/ml）的多價裂解型噬菌體處理大腸埃希菌K-12 的生物膜6h，結果顯示，與未處理組相比，大腸埃希菌K-12 的生物膜內群體感應基因、多糖生產基因和卷曲桿菌合成基因表達上升，使得生物膜基質的多糖和eDNA 含量增加，促進了生物膜的形成[21]。②特定噬菌體有助于細菌生物膜的形成。Pf 噬菌體作為能感染銅綠假單胞菌的溫和的、無包膜的絲狀病毒，其卻能有助于銅綠假單胞菌生物膜的形成。研究發現，不同實驗室環境下，Pf 噬菌體基因的上調是銅綠假單胞菌生物膜形成的一個共同特征，此外，不同條件下生長的銅綠假單胞菌生物膜都與大量重疊感染的Pf 噬菌體的產生有關[22]。③原噬菌體能釋放細菌生物膜組裝所需的基質成分。研究發現一種線性質粒樣原噬菌體 xhp1 可通過自發誘導和釋放胞外 DNA(eDNA)，提供溶齒放線菌（Actinomyces odontolyticus）XH001 生物膜組裝所需的基質成分，有助于XH001 生物膜的形成?？傊?，噬菌體與細菌生物膜相互作用較為復雜，我們還需繼續深入理解、研究，以制定未來抗細菌生物膜治療的高效方案。

5 基于噬菌體及其衍生物的抗細菌生物膜應用策略

5.1 噬菌體療法 噬菌體療法通常需要制備單一噬菌體制劑或噬菌體雞尾酒。與單一類型的噬菌體制劑相比，噬菌體雞尾酒具有擴大宿主范圍和減少噬菌體不敏感突變體(bacteriophage-insensitive mutants，BIMs)出現的優勢[23]，在控制和根除細菌生物膜方面更廣泛、更有效。例如，研究發現，含三種噬菌體的雞尾酒療法與單一噬菌體相比，在不影響彼此的活性作用下，能抑制生物膜的形成并破壞2～3 株奇異變形桿菌的生物膜[24]。FORTI 等[25]人設計了一種混合六種噬菌體的雞尾酒對急性呼吸道感染的小鼠模型進行清除銅綠假單胞菌生物膜的試驗，結果顯示這種噬菌體雞尾酒能夠清除銅綠假單胞菌多重耐藥菌株并在48h 內幾乎完全清除所形成生物膜。另一項評估噬菌體雞尾酒抗生物膜活性對控制由金黃色葡萄球菌引起的骨科植入物相關感染潛力的研究中，通過將噬菌體混合物與生物膜涂層的三維打印多孔鈦作用，這種多孔鈦常用于骨科植入物，結果顯示噬菌體雞尾酒作用8h 后，生物膜的生物量、厚度和面積均出現減少[26]。需要指出的是，噬菌體療法雖然具有治療優勢，但在臨床使用中仍面臨一些風險和挑戰，如單一類型噬菌體宿主譜相對狹窄、內毒素釋放引發炎癥反應、免疫系統會產生噬菌體中和抗體削弱噬菌體的作用、在劑量和持續時間上有局限性等等[27]。

5.2 噬菌體與抗生素聯合治療 噬菌體和抗生素聯合使用被認為是對抗細菌生物膜感染的有效策略之一。用亞致死濃度的抗生素可以在一定條件下刺激宿主細菌細胞產生一些毒性噬菌體的現象被稱為噬菌體-抗生素協同作用(phage-antibiotic synergy，PAS)[28]。噬菌體引起細菌細胞裂解釋放的營養物質可以重新激活生物膜內生長受阻細胞的代謝活動，使其對抗生素敏感性增加。此外，細菌裂解也導致了EPS 基質的破壞，有助于抗生素向基質深層的擴散[29]。體外研究已廣泛證明，抗生素與噬菌體的某些組合能夠有效控制細菌生物膜。如一項研究中評估了金黃色葡萄球菌噬菌體Sb-1 與5 種抗生素聯合對10 種耐利福平金黃色葡萄球菌臨床菌株的生物膜活性。結果顯示，Sb-1 與達托霉素、氟氯西林、頭孢唑啉或磷霉素的組合夠在體外根除耐利福平的金黃色葡萄球菌生物膜[29]。當噬菌體與抗生素聯合使用時，兩者的劑量和給藥時間等對治療效果有較大影響。因此，未來的研究應優化組合條件，在確保安全性的同時充分發揮組合治療的效果。

5.3 噬菌體相關酶 噬菌體療法主要通過噬菌體的裂解酶和解聚酶發揮抗生物膜作用。這些酶能降解細菌肽聚糖、莢膜多糖等物質主動穿透和破壞生物膜，其功效已在一些研究中得到證實。FURSOV等[30]人測試了大腸埃希菌噬菌體裂解酶LysECD7 對肺炎克雷伯菌生物膜的功效，結果表明向動物腹腔注射50μg 的LysECD7 可以破壞形成的生物膜中的大部分細菌，并且LysECD7 能夠在體外降解預先形成的生物膜。此外，體外使用濃度≥12.5 μg/ml 的葡萄球菌裂解酶 P128 時，對慢性鼻竇炎（chronic rhinosinusitis，CRS）患者分離的甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(methicillin sensitiveS.aureus，MSSA)和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistantS.aureus，MRSA）生物膜的抑制率可高達95.5%[31]。裂解酶雖然是很有潛力的抗菌藥物，但正如MURRAY 等[32]人所述其也存在一些治療挑戰例如需探索合適的給藥方法、監管機構的批準等。與解聚酶相關的重要實例如一種新型噬菌體源性解聚酶Dpo10 對大腸埃希菌O157 的脂多糖表現出特異性結合和裂解活性，可有效用于治療大腸埃希菌O157∶H7 菌株的生物膜[33]。最近的研究已證實噬菌體來源的解聚酶在很大程度上可以有效地破壞生物膜，除了單獨使用外，還可以與裂解酶、抗生素、化學藥品等聯合，加強治療生物膜效果。

5.4 基因工程噬菌體 噬菌體可以通過基因工程技術以擴大其宿主范圍、在生物膜基質中的存活率、增加生物膜的降解，從而獲得更廣泛的應用。目前，不同類型的基因工程技術如同源重組（homologous recombination，HR）、電穿孔DNA 噬菌體重組（bacteriophage recombineering of electroporated DNA ，BRED）、基于CRISPR-Cas 的噬菌體工程、體內重組等已開發應用[34]。在一項研究中，研究人員將具有廣譜抗生物膜效應的抗菌肽1 080 的編碼序列插入到大腸埃希菌T7Select 噬菌體基因組，與未修飾的噬菌體相比，經修飾后的噬菌體在根除大腸埃希菌生物膜方面更有效[35]。LANDLINGER等[36]人研究發現，通過重組噬菌體裂解酶的酶活性結構域(EADs）和細胞壁結合域(CBD）生成了一種工程lysin PM-477，該裂解酶可消除細菌性陰道病中加德納菌生物膜，而不會破壞有益的陰道微生物群，使lysin PM-477 成為治療細菌性陰道病的有潛力的抗生素替代品?；蚬こ淌删w在治療細菌生物膜方面的巨大潛力吸引著研究者的極大興趣，但在今后的研究中仍需要不斷的臨床試驗來確保其有效性和安全性。

5.5 噬菌體抗生物膜的其他措施 除了上述的治療方案外，一些基于噬菌體的其他策略也被報道用于預防和控制細菌生物膜。STACHLER 等[37]人評估了聯合噬菌體和化學消毒劑對機會性病原體銅綠假單胞菌的協同作用的潛力，結果表明噬菌體可以與化學消毒劑有效結合，在改善濕生物膜和去除表面細菌的同時，也能防止干燥生物膜的再生。此外，噬菌體也可與機械清創術、納米技術有效結合，以增強根除細菌生物膜的效果。

6 小結

近年來，細菌抗微生物藥物耐藥性不斷上升，其中細菌生物膜的形成是細菌抵御抗生素等抗菌劑并產生較高耐藥性的原因之一，給醫療衛生領域帶來極大挑戰。以醫院檢驗科為例，細菌生物膜的形成導致細菌耐藥檢出率顯著升高且極易出現多重耐藥現象繼而造成各種細菌慢性感染。當使用傳統抗生素和消毒劑無法根除生物膜時，噬菌體作為一種新的替代方法可通過多種機制有效抑制或消除細菌生物膜。檢驗科可通過菌斑法即利用雙層瓊脂法測定細菌生長抑制區或斑塊以評估噬菌體療效；通過噬菌體懸浮液的連續稀釋度再以斑點形成單位計數來建立噬菌體滴度；利用96 孔板進行液體培養物的生長動力學監測，從而實時評估噬菌體與細菌的相互作用等等。

本文基于當前的研究總結了噬菌體抗生物膜的多種機制并討論了基于噬菌體及其衍生物的抗生物膜應用策略，包括噬菌體雞尾酒、噬菌體相關酶、噬菌體與抗生素聯合使用、基因工程噬菌體等。雖然噬菌體及其衍生物在治療細菌生物膜相關感染方面有很大的潛力，但仍存在一些有待解決的局限性。首先是安全性。截至目前，噬菌體抗生物膜的研究主要是體外研究，體內研究和臨床試驗有限，需要進行更多的基礎和臨床研究確保其應用過程中的安全性。其次，病毒通常被認為對人類健康有害，需要更多關于噬菌體的知識，以提高社會公眾對以噬菌體為基礎的治療方法的接受度。此外，要注意細菌生物膜是動態結構，其組成和結構隨環境條件的變化而變化，無論使用基于噬菌體的何種應用策略，其治療方案也各不相同，我們需要深入研究噬菌體和細菌生物膜之間的相互作用，建立標準化的方法來評估噬菌體抗細菌生物膜的功效。