小分子PIM 激酶抑制劑的研究進展

鄭小洲，金曉磊，趙臨襄

(沈陽藥科大學 基于靶點的藥物設計與研究教育部重點實驗室，遼寧 沈陽110016)

1 PIM 激酶的結構

PIM-1 基因最早作為莫洛尼小鼠白血病病毒的前病毒整合位點(proviral integration site of moloney murine leukemia virus)而得名。PIM 激酶家族有3 名成員:PIM-1、PIM-2 和PIM-3 激酶，同屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。它們的氨基酸序列具有同源性:PIM-1 和PIM-2 為61%，PIM-1 和PIM-3 為71%［1－2］。目前，PIM-1 和PIM-2 激酶研究得較多，而關于PIM-3 的晶體結構未見報道。

Figure 1 Inhibitor interactions in the ATP pocket［4］

PIM-1 激酶有34 kDa 和44 kDa 兩種，其中以44 kDa 的激酶為主。PIM-1 是典型的雙葉型激酶結構，N 端主要是反向平行的β 折疊，C 端主要是α 螺旋，N 端和C 端兩個結構域通過短的鉸鏈區連接。這兩個結構域之間接口處的口袋構成了活性部位(圖1)，包含鉸鏈區(殘基122-127)、N 末端結構域中富含甘氨酸的環(殘基44-52)和C 末端結構域中的活化環(殘基186-210)［3－4］。PIM-2 激酶有34 kDa、38 kDa 和40 kDa 三種，其中以34 kDa 的激酶為主。PIM-2 也是典型的雙葉型蛋白質結構，具有與PIM-1 相似的活性口袋。

2 PIM 激酶與腫瘤

PIM 激酶通過多種機制影響腫瘤細胞的存活和增殖:PIM-1 和轉錄因子c-myc 對前列腺癌和淋巴瘤的形成具有協同作用，PIM-1 在c-myc 基因誘導的小鼠前列腺癌中高表達［5］;PIM-1 磷酸化BAD 蛋白Ser112 位點(BAD 蛋白失活的門控位點)，使BAD 蛋白失去促凋亡活性;PIM 激酶可以調節細胞周期，誘導細胞的增殖，例如:PIM-1 磷酸化細胞周期磷酸酯酶CDC25A 并增強其活性，促進細胞G1/S 期的進程;PIM-1 激酶介導細胞周期抑制劑p27Kip1和p21cip1/WAP1的磷酸化作用，抑制PCNA(增殖細胞核抗原)與p21cip1/WAP1結合，促進細胞G1 期和G2/M 期的進程［6－7］;PIM 激酶既可以正向調節STAT3 和Wnt 信號傳導通路，也可正向調節NFκB 信號傳導系統，從而促進細胞增殖。

3 小分子PIM 激酶抑制劑

3.1 咪唑并［1，2-b］噠嗪類和三唑并［4，3-b］噠嗪類化合物

Chen 等［8］發現咪唑并［1，2-b］噠嗪類化合物(圖2)有很好的可改造性和成藥性。其中最具代表性的是K00135 和SGI-1776。在小鼠Ba/F3 細胞激酶試驗中，K00135 對PIM-1 和PIM-2 有良好的抑 制 作 用，IC50分 別 為0.12 μmol·L－1和1.8 μmol·L－1［9］?；衔颯GI-1776 對B 細胞慢性淋巴細胞性白血病(B-CLL)具有凋亡誘導作用(PIM-1，IC50= 7 nmol·L－1;PIM-2，IC50=363 nmol·L－1;PIM-3，IC50= 69 nmol·L－1)。2008 年11 月，FDA 批準SuperGen 公司開始SGI-1776 的Ⅰ期臨床試驗，由于試驗中出現了心臟QTc 間期延長的現象，2010 年11 月該化合物的臨床試驗被迫終止。之后Blanco-Aparicio 等［10］發現ETP-39010 是一種有效的PIM 激酶抑制劑(PIM-1，IC50= 130 nmol·L－1;PIM-2，IC50=420 nmol·L－1;PIM-3，IC50=79 nmol·L－1)。

Grey 等［11］通過對咪唑并噠嗪母核的改造，得到了三唑并［4，3-b］噠嗪類化合物，例如化合物1 和2(圖3)。將化合物1 的環己基對位引入羥基(化合物2)可以明顯改善物理性質:clogP=2.8，clogD7.4=3.9，溶解度為170 μmol·L－1，MDCK 滲透性為35.3/49.0。多種激酶活性測試發現，化合物2 對PIM-1 具有良好的抑制活性和高度選擇性(PIM-1，Ki＜5 nmol·L－1)。

Figure 2 Imidazo［1，2-b］pyridazines as PIM kinase inhibitors

Figure 3 1，2，4-triazolo［4，3-b］pyridazines as PIM kinase inhibitors

3.2 苯并［c］［2，6］萘啶類化合物

苯并［c］［2，6］萘啶類化合物CX-4945(圖4)作為首個CK2 激酶的ATP 競爭性抑制劑已進入臨床試驗［12］。通過對238 種激酶進行抑制活性篩選，Siddiqui-Jain 等［13］發現該化合物還具有PIM-1激酶抑制活性(CK2，IC50= 0.001 μmol·L－1;PIM-1，IC50=0.046 μmol·L－1)。Pierre 等［14］對CX-4945 的結構進行修飾，設計并合成了一系列結構類似的化合物(圖4)，由急性髓性白血病細胞株MV-4-11 的抗增殖實驗可知，這類化合物均有較好的PIM 激酶抑制活性。例如化合物3(CK2，IC50＞0.5 μmol·L－1;PIM-1，IC50= 0.027 μmol·L－1;PIM-2，IC50=0.018 μmol·L－1)。構效關系表明:C-7位引入三氮唑(化合物3)使CK2 活性減弱，PIM-1活性增強，從而選擇性抑制PIM-1 激酶;C-5 位的2'-氯苯胺或2'-氟苯胺使活性提高到納摩爾級，如化合物4(PIM-1，IC50=0.005 μmol·L－1;PIM-2，IC50=0.003 μmol·L－1;PIM-3，IC50=0.057 μmol·L－1);將母核A 環換成五元環，如吡咯、噻吩、咪唑等［15］，既可保持對PIM 激酶的抑制活性，也恢復了對CK2 激酶的抑制活性。以化合物5 為例，對PIM-1、PIM-2 和CK2 的IC50值 分 別 為0.003、0.002、0.009 μmol·L－1。

Figure 4 Benzo［c］［2，6］naphthyridines as PIM kinase inhibitors

3.3 苯亞甲基聯噻唑烷類化合物

經過高通量篩選，Beharry 和Xia 等［16－17］發現了苯亞甲基聯噻唑烷類PIM 激酶抑制劑。對50多種蛋白激酶活性篩選后發現這類化合物對PIM激酶有高選擇性。在此基礎上，Dakin 等［18］設計并合成了一系列苯亞甲基聯噻唑烷-2，4-二酮衍生物，例 如化合物6(PIM-1，IC50=0. 024 μmol·L－1;PIM-2，IC50=0.1 μmol·L－1)、化合物7(PIM-1，IC50=0.15 μmol·L－1;PIM-2，IC50=0.02 μmol·L－1)、化 合 物8 (PIM-1，IC50＜0.004 μmol·L－1，PIM-2，IC50= 0.05 μmol·L－1，PIM-3，IC50＜0.003 μmol·L－1)，上述化合物6 ～8 的結構見圖5。

Figure 5 Benzylidene-linked thiazolidines as PIM kinase inhibitors

3.4 苯并［4，5］噻吩并［3，2-d］嘧啶酮類化合物

Tao 等［19］通過高通量篩選發現:苯并［4，5］噻吩并［3，2-d］嘧啶酮類化合物(圖6)對K562和MV4-11 細胞具有有效的抗增殖活性，例如化合物9(PIM-1，Ki=63 nmol·L－1;PIM-2，Ki=160 nmol·L－1)。該類化合物構效關系如下:2 位引入二甲氨基甲基，化合物對PIM-1 和PIM-2 的活性增加，例如化合物10(PIM-1，Ki=14 nmol·L－1;PIM-2，Ki=63 nmol·L－1);2 位引入羥基吡咯烷基，化合物對PIM-1 和PIM-2 活性保持(與化合物10 相比)，如化合物11(PIM-1，Ki=5 nmol·L－1;PIM-2，Ki=29 nmol·L－1);8 位引入疏水性強的環丙乙烯基可大大增加化合物的PIM-1 和PIM-2 抑制活性，如化合物12(PIM-1，Ki=1 nmol·L－1;PIM-2，Ki=2 nmol·L－1);8 位引入苯基取代基可以明顯增強PIM 激酶抑制活性，其中抑制活性大小為:對羥基苯基＞間羥基苯基＞鄰甲基苯基，如化合物13(PIM-1，Ki= 2 nmol·L－1;PIM-2，Ki= 3 nmol·L－1，PIM-3，Ki=0.5 nmol·L－1)。

Figure 6 3H-Benzo［4，5］thieno［3，2-d］pyrimidin-4-ones as PIM kinase inhibitors

3.5 酰腙類化合物

Figure 7 Acylhydrazones as PIM kinase inhibitors

Chang 等［20］為了得到對W10 小鼠B-淋巴瘤細胞株有細胞毒性的化合物，通過高通量篩選發現了3 個結構類似的酰腙類化合物21A8、21H7和65D4(圖7)，它們對W10 細胞的LD50值為0.4 ～1.0 μmol·L－1，而對正常細胞無顯著影響，其中65D4 能最有效地抑制癌細胞存活。為了改善65D4 的水溶性，對其A、B、C 三個區域進行了結構改造(圖7):包括將A 區域的苯環換成嘧啶環，并在間位引入嗎啡啉基團;變化連接嗎啡啉環碳鏈的長度;在C區域引入羥基和鹵素。經過結構改造得到了21 種對前列腺癌細胞生長有抑制作用的化合物，其中M110 對DU-145 細胞抑制活性最好，IC50=0.9 μmol·L－1。激酶活性篩選實驗結果表明:M110 是高選擇的PIM 激酶抑制劑(PIM-1，IC50= 2.5 μmol·L－1;PIM-2，IC50=2.5 μmol·L－1，PIM-3，IC50= 0.05 μmol·L－1);M110 對上皮細胞瘤有效，可以抑制前列腺癌衍生細胞株的增殖(IC50＜1 μmol·L－1)，而對正常的人外周血液淋巴細胞作用較小(IC50值達到40 μmol·L－1)。

3.6 苯并呋喃-2 羧酸類化合物

Xiang 等［21］通過高通量篩選發現苯并呋喃-2羧酸類化合物(圖8)有PIM 激酶抑制活性，例如化合物14(PIM-1，IC50=8.5 μmol·L－1)和化合物15(PIM-1，IC50=5.8 μmol·L－1)?；衔?4的5 位溴和2 位羧基是活性必需基團，通過結構優化得到了高活性的PIM 激酶抑制劑，如化合物16(PIM-1，IC50= 0.020 μmol·L－1PIM-2，IC50=0.19 μmol·L－1)、化 合 物 17 (PIM-1，IC50=0.001 μmol·L－1;PIM-2，IC50=0.004 μmol·L－1)、化合物18(PIM-1，IC50= 0.019 μmol·L－1;PIM-2，IC50=0.066 μmol·L－1)。

Figure 8 Benzofuran-2-carboxylic acids as PIM kinase inhibitors

3.7 吡咯并咔唑類化合物

Akue-Gedu 等［22］發現了吡咯并［2，3-a］咔唑類PIM 激酶抑制劑(圖9)。對66 種激酶進行活性篩選，發現化合物19 是最強的PIM 激酶抑制劑(PIM-1，IC50=0.12 μmol·L－1;PIM-2，IC50=0.51 μmol·L－1;PIM-3，IC50=0.01 μmol·L－1)。Letribot 等［23－24］在化合物19 的C 環N-10 上引入取代基，雖然抑制活性變化不大，但改善了化合物的滲透性。在人類纖維原代培養細胞(Fibro)和3 種實體瘤細胞株(PC3、DU145 和PA1)的體外實驗中，這類化合物的抗增殖活性都在低微摩爾級，如化合物20(Fibro，IC50=0.63 μmol·L－1;PC3，IC50= 0.65 μmol·L－1;DU145，IC50=0.96 μmol·L－1;PA1，IC50=0.486 μmol·L－1)。Giraud 等［25］將化合物19 的C-3 位醛基去掉，并在C-4 位上引入了甲氧羰基得到了化合物21，其對PIM-1 和PIM-3 激酶有抑制活性(PIM-1，IC50=3 μmol·L－1;PIM-3，IC50=0.5 μmol·L－1)，且顯示出微摩爾級的抗增殖活性(Fibro，IC50=8 μmol·L－1;PC3，IC50=6 μmol·L－1;DU145，IC50＞50 μmol·L－1;PA1，IC50=27 μmol·L－1)。

Figure 9 Pyrrolo［2，3-a］carbazoles as PIM kinase inhibitors

3.8 吲哚酮類化合物

Figure 10 Oxindoles as PIM kinase inhibitors

Haddach 等［26］通過高通量篩選發現吲哚酮類化合物(圖10)具有PIM-1 激酶抑制活性，例如化合物22(PIM-1，IC50=0.386 μmol·L－1)。并且從同類化合物中發現，內酰胺的NH 作為氫鍵供體是PIM 激酶活性必需基團，在NH 上引入甲基PIM 激酶活性消失。吲哚環上5 位用氯原子取代可以加強PIM 激酶活性，而F 取代則活性降低。通過MV-4-11(人類AML 細胞)抗增殖活性篩選發現了活性更好的化合物23(PIM-1，IC50=5 nmol·L－1;PIM-2，IC50=25 nmol·L－1;PIM-3，IC50=16 nmol·L－1)。

4 結語

本文從結構特征、作用機制及小分子抑制劑的研究進展三個方面對PIM 激酶進行了總結。PIM 激酶通過多種機制影響腫瘤細胞的增殖和存活:PIM 激酶與轉錄因子協同作用，促進腫瘤細胞增殖;PIM 激酶也可通過磷酸化凋亡蛋白BAD和ASK1 來增加細胞存活;PIM 激酶通過調節多種細胞周期因子來調節細胞周期，誘導細胞的增殖;PIM 激酶通過調節細胞信號通路，增強細胞存活能力?？傊?，PIM 激酶在腫瘤的形成和發展過程中發揮著重要作用。盡管目前還沒有PIM 激酶抑制劑上市，但關于小分子PIM 激酶抑制劑的研究越來越多，這些研究成果將推動新靶點抗腫瘤藥物向前發展。

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