腦缺血模型中皮層Sirt3與自噬蛋白LC3表達的相關性

李建榮 蔣曉帆 張磊 岳康異 黑悅

(空軍軍醫大學西京醫院神經外科，陜西 西安 710032)

缺血性腦卒中(ischemic stroke, IS)后神經元不僅發生凋亡與壞死，還可發生自噬。目前研究發現，IS后自噬水平增高，同時一類線粒體去乙?；冈谏窠浽獡p傷后表達亦增高[1-3]。沉默信息調節因子3(silent information regulator, SIRT3)是線粒體的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)依賴的去乙?；讣易宄蓡T，廣泛存在于線粒體基質和細胞核中[4-5]。我們推測SIRT3可能通過調控線粒體自噬影響IS后皮層缺血區細胞的轉歸[6]。SIRT3定位于線粒體，在肝臟、心肌、大腦等高表達[7-8]。然而，SIRT3在缺血性腦卒中如何發揮作用及其機制，目前尚未得到明確肯定。

為了進一步研究SIRT3對小鼠缺血再灌注模型皮層區域神經元細胞自噬及凋亡的影響，本研究使用小鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)法建立腦缺血再灌注損傷模型，取再灌注3 h、24 h、3 d、7 d四個時間點，利用免疫熒光和蛋白印跡法觀察LC3和SIRT3的共定位以及損傷后的變化趨勢情況，分析兩者的相關性。

材料與方法

一、實驗動物和分組

全部健康成年C57BL/6J小鼠(20～22 g)32只，由第四軍醫大學實驗動物中心提供。實驗動物隨機分為4組，即腦缺血再灌注3 h、24 h、3 d、7 d組，每組8只。實驗過程中如遇死亡則另行補齊。

二、小鼠腦缺血再灌注模型的制作

術前12 h禁食不禁水，用腹腔麻醉(10%水合氯醛，3 mg/kg)麻醉小鼠，游離左側頸總動脈(common carotid artery, CCA)、頸外動脈(external carotid artery, ECA)和頸內動脈(internal carotid, ICA)，結扎ECA和CCA近心端，動脈夾夾閉CCA遠端，在CCA結扎與夾閉兩處之間用動脈剪剪一小口，將浸于肝素生理鹽水中的尼龍線栓(頭端直徑為0.23 mm)沿CCA插入ICA，約12 mm，然后結扎頸總動脈固定線栓，然后縫合皮膚。整個手術過程中室溫保持在22～25 ℃。術后將動物置于放有清潔墊料的飼養盒中，自由飲水、進食。

三、間接免疫熒光染色

5組中各取3只進行染色。無痛麻醉后剪開腹腔暴露心臟，以200 mL生理鹽水灌注后用4%多聚甲醛灌注固定。常規石蠟包埋，冠狀切片(厚度為2 mm)。石蠟切片常規脫蠟止水，pH=6.0的檸檬酸修復液進行抗原修復；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)漂洗3次，每次6 min；加入0.3% H2O2溶液封閉內源性過氧化酶15 min；PBS漂洗3次，每次6 min；加入驢血清封閉1 h后甩去血清分別加入兔抗SIRT3(1 ∶500，Abcam，美國)和 小鼠抗LC3(1 ∶500，Sigma，美國)抗體，在4 ℃冰箱中賦予過夜，洗脫。滴加熒光二抗(Invitrogen，1 ∶2 000，山羊抗兔和山羊抗小鼠)孵育3 h，洗去二抗并孵育4, 6-二脒基-2-苯基吲哚(4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride, DAPI)染色液10 min，在熒光顯微鏡下觀察分析。觀察采用單盲、雙人分析單個低倍鏡下(×20)陽性細胞個數(取10個切片×10個視野的平均數)。

四、皮層區域蛋白樣品制備和蛋白印跡檢測

提取皮層核心缺血區蛋白樣品，蛋白裂解液冰上裂解15 min后，4 ℃ 12 000 r/m離心30 min。BCA蛋白定量后-20 ℃保存待用。分別取60 μg各組蛋白樣品進行蛋白電泳(10% SDS-PAGE)和轉模(NC膜)。與LC3(1 ∶2 000)、SIRT3(1 ∶400)、β-Actin(兔抗，1 ∶2 000，Abcam，USA)抗體結合過夜，然后與辣根過氧化物酶標記的二抗(1 ∶20 000)結合孵育1.5 h，顯色壓片后使用Gel-Pro analyzer軟件進行圖像分析。

五、統計分析

圖1 不同時間點小鼠皮層損傷區域SIRT3和LC3表達的免疫熒光變化 (DAPI, ×200)

Fig 1 The expression of SIRT3 and LC3 in the damage part of cortex of mouse at different times using immunofluorescence (DAPI, ×200)

A: The expression of SIRT3 (green) and LC3 (red) at 3 h, 24 h, 3 d and 7 d; B: The quantification of the expression of SIRT3; C: The quantification of the expression of LC3.

aP<0.05,vs3 h (SIRT3);bP<0.05,vs3 h (LC3).

N=3 per group. Scale bar=40 μm.

結 果

一、間接免疫熒光

建立小鼠模型后取再灌注3 h、24 h、3 d、7 d四個時間點，觀察小鼠急性期大腦皮層損傷核心區域SIRT3和LC3的表達，如圖1所示。SIRT3表達在損傷過程中呈現動態上調，拋物線狀變化。再灌注24 h達到高峰(P<0.01vs3 h)，3 d時緩慢下降，但仍較3 h表達較高(P<0.05vs3 h)。LC3亦呈現相似改變，于24 h達到高峰(P<0.01vs3 h)，3 d時緩慢下降，但仍較3 h表達較高(P<0.05vs3 h)。另外，兩者表達存在共定位現象。

二、蛋白印跡

收集4組蛋白樣品后，同樣觀察缺血再灌注后3 h、24 h、3 d、7 d四個時間點的SIRT3和LC3的蛋白表達變化趨勢，如圖2所示。SIRT3表達在損傷過程中呈現動態上調，拋物線狀變化。再灌注24 h達到高峰(P<0.01vs3 h)，3 d時緩慢下降，但仍較3 h表達較高(P<0.05vs3 h)。LC3亦呈現相似改變，于24 h達到高峰(P<0.01vs3 h)。

三、Spearman相關性分析

取小鼠缺血再灌注3 h，24 h，3 d，7 d四個時間點的SIRT3(此為參數x1)和LC3(此為參數y1)陽性細胞數，采用Spearman相關性分析，得出r=0.6887,P=0.0065<0.01。另外，取3 h、24 h、3 d、7 d四個時間點的SIRT3(此為參數x2)和LC3(此為參數y2)的相對灰度值，再次采用Spearman相關性分析，得出r=0.7039,P=0.0050<0.01，再次顯示兩者具有顯著正相關。由此得出兩者表達具有顯著相關性。

圖2 不同時間點小鼠皮層損傷區域SIRT3和LC3表達的蛋白印跡分析

Fig 2 The protein expression of SIRT3 and LC3 in the core damage part of cortex of mouse at different time points using Western blotting

A: The expression of SIRT3 and LC3 at 3 h, 24 h, 3 d, 7 d; B: The quantification of the expression.

aP<0.05,vs3 h (SIRT3);bP<0.05,vs3 h (LC3).

N=3 per group.

討論

缺血性腦卒中占全部腦卒中病例的75%以上，幸存者往往伴有不同程度的神經功能障礙，給個人及社會帶來沉重的負擔，近30年來，IS后腦缺血損傷機制及腦保護作用研究成為世界性的難點和熱點問題[9]。而IS后皮層缺血區域細胞不僅發生凋亡與壞死，還可發生自噬[10]。已有研究證實，原代培養的神經元損傷模型中，傷后1 h、3 h、6 h、12 h 和24 h 作為觀察時間點，自噬相關分子LC3Ⅱ和Beclin-1的表達隨時間變化逐漸增高[2]。而在早期氧糖剝奪/再灌注應激情況下，細胞會啟動自噬機制來清除受損線粒體，這時自噬足以避免大量凋亡因子釋放進入胞質，對細胞起到一定保護作用[2,11]。

作為自噬的標志分子，LC3Ⅱ的表達的高低與發生自噬的程度成正比[6]，本研究蛋白印跡結果表明，LC3Ⅱ和SIRT3在缺血損傷后表達量逐漸上升，自噬被激活，再灌注24 h達到峰值后隨著時間的延長有所下降，但整體仍高于正常對照組。顯然SIRT3在自噬表達最高時其表達量亦最高，并且兩者有共定位表達。

線粒體自噬是神經元自噬的主要形式，在神經元轉歸中扮演重要角色。而目前研究發現，SIRT3可以通過多種途徑調控自噬水平[6,12]，對細胞產生保護作用：①SIRT3可通過去乙?；骖^蛋白O3A (folk head protein 3a, FOXO3a) 進而上調眾多抗氧化酶，包括過氧化氫酶(catalase, CAT)和錳超氧化物歧化酶(Mn-superoxide dismutase, MnSOD)等，增加ROS 清除率[13-14]；也可通過激活異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase, IDH2)和谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase, GDH)，促進還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)生成，NADPH 最終通過還原谷型胱甘肽清除活性氧類成分 (reactive oxygen species, ROS)；②SIRT3 可去乙?；€粒體電子傳遞鏈中的組分，包括復合輔Ⅰ(NADH脫氫酶)、復合物Ⅱ(琥珀酸脫氫酶)及復合物Ⅲ的成分，從而調節ROS 的產生[15]。進一步，在原代培養大鼠皮層神經元中SIRT3通過抑制線粒體鈣攝取和促進線粒體生物發生發揮神經保護作用，SIRT3增加皮層神經元對氧化性急性損傷的抵抗能力[13]?？偠灾?，本研究說明MCAO急性期皮層區域SIRT3對自噬水平可能的誘導作用，而產生的對神經元的保護。

目前本研究發現：①小鼠腦缺血再灌注損傷模型中，皮層區域SIRT3表達先增高后降低，呈拋物線狀；②自噬相關蛋白LC3-2的表達與SIRT3呈現相關性(Spearman相關性分析,P<0.05)，均在24 h呈現高峰；③免疫熒光發現LC3-2和Sirt3有共定位表達。而SIRT3和LC3之間的如何聯系尚未可知。下一步實驗將調控SIRT3表達(過表達或抑制)進一步證實LC3以及細胞凋亡的相應變化，闡明兩者的潛在的聯系和分子信號通路。