依維莫司在侵襲性腎臟上皮樣血管平滑肌脂肪瘤治療中的應用

郭剛 陳文政 張帆 張旭

1中國人民解放軍總醫院泌尿外科100853北京

腎上皮樣血管平滑肌脂肪瘤（epithelioid ano?myolipoma，EAML）為腎血管平滑肌脂肪瘤的少見亞型，是一種來源于血管周上皮樣細胞的間葉性腫瘤[1-2]。腎EAML在臨床少見，文獻多見于個案報道，該類腫瘤具有惡性潛能并呈現高侵襲性生物學行為，可發生局部復發、遠處轉移和死亡等情況[3]，目前仍無標準的治療方案。本研究對中國人民解放軍總醫院2014年10月－2017年10月收治的5例侵襲性腎上皮樣血管平滑肌脂肪瘤進行包括手術和依維莫司藥物的綜合治療，取得了良好的臨床效果，現報告如下。

1 資料及方法

1.1 臨床資料

收集5例侵襲性腎EMAL患者的臨床資料，包括臨床癥狀、腫瘤大小、病理學和影像學特點、手術方式及隨訪情況。5例患者均因腎腫瘤手術后復發或轉移就診，男女比例為2∶3，年齡27～60歲，平均（39.8±11.5）歲。左側2例，雙側3例。3例患者首次手術接受根治性腎切除，2例首次手術接受腎部分切除。5例患者在首次手術后7～100個月后出現疾病進展，中位至疾病進展時間30個月；局部復發3例、多發轉移2例；其中2例復發患者均接受二次手術切除病灶，1例遠處轉移患者行右肩胛骨轉移灶切除術，另2例患者未接受手術治療。2例患者符合結節性硬化的臨床診斷，2例通過基因檢測確診為結節性硬化，1例不伴有結節性硬化。所有患者病理診斷均為上皮樣腎血管平滑肌脂肪瘤，所有病例均為HMB45染色陽性，其中病例1、3、5的Ki-67陽性率超過20%，核分裂像超過2/10 HPF。病例2、4的Ki-67陽性率均為3%，核分裂像均為1～2/10 HPF，詳表1。

1.2 TSC1/2基因二代測序

1.2.1 目標序列捕獲與測序 抽取受試者及對照者靜脈血5 mL，按標準流程提取基因組DNA（QIAamp DNA Blood Midi Kit，Qiagen，Hilden，Germany）。利用 Covaris LE220超聲波儀（Mas?sachusetts，USA）將基因組DNA打斷成200～250 bp的片段，隨后進行Ampure Beads純化，將純化后的DNA片段進行末端修復、加“A”以及加接頭反應，從而完成單個受檢者的DNA建庫。Non-Captured樣品進行LM-PCR反應，純化，利用定制的基因片段捕獲探針（BGI自主探針），65℃雜交捕獲24 h，雜交結束后進行探針的洗滌和洗脫反應，隨后進行Captured樣品的LM-PCR反應。文庫經Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOne進行片段大小、濃度的檢測，最后利用高通量測序儀 Illumina HiSeq2500 Analyzers（Illumi?na，SanDiego，USA）連續雙向測序90個循環，用Illumina Pipeline software（version 1.3.4）讀出原始測序數據。

1.2.2 序列分析 數據下機后進入信息分析部分。首先對下機的原始數據（Raw reads）進行測序質量評估，去除低質量以及被接頭污染的數據。隨后用BWA軟件（Burrows Wheeler Align?er）與HG19進行序列比對，與此同時進行序列捕獲效果評價，用SOAPsnp軟件和Samtools軟件分別進行 SNV（single nucletide variant）和 Indel（insertion and deletion）的查詢，生成目標區域堿基多態性結果，隨后進行數據庫（NCBI dbSNP，HapMap，1000 human genome dataset和 data?base of 100 Chinese healthy adults）的比對，并對找出的可疑突變進行注釋、篩選。

表1 患者臨床資料

1.2.3 Sanger法驗證 對于所有發現的致病突變，在其所在片段上下游設計引物，進行PCR擴增，并對產物做Sanger測序。將所得結果與TSC1和TSC2基因標準序列進行比對，從而驗證探針捕獲和高通量測序的結果。

1.3 依維莫司藥物治療與評價

對所有患者給予依維莫司（諾華制藥，瑞士）藥物治療，起始劑量均為10 mg口服，1次/d，連續用藥。藥物治療直至疾病進展或者出現需要減量或停藥的Ⅲ級或Ⅳ級藥物不良反應。定期評估患者藥物治療的療效、血藥濃度及不良反應發生情況。

依維莫司治療前，所有患者均采用螺旋CT或者MRI測定腫瘤病灶，以最大直徑腫瘤作為靶病灶，應用實體瘤評價標準判定療效（RECIST 1.0）[4]。分別于治療后第 1、3、6、12 個月進行療效評價，之后每6個月進行療效評價。不良反應每周期進行評價，按照《美國國立癌癥研究所不良事件通用術語標準》（NCI CTCAR 3.0版2006年8月）進行分級[5]。依維莫司的血藥濃度通過檢測血清雷帕霉素血藥濃度并通過公式換算得出[6]。

2 結果

2.1 TSC1/2基因二代測序

BWA軟件行序列捕獲效果評價顯示，所有樣本NGS平均堿基覆蓋度為99.88%，最低樣本覆蓋度為99.44%。目標區域平均測序深度＞30X位點所占比例平均值為98.92%，最低值為97.35%。所有樣本的平均測序深度為280.4X，最低測序深度為168.4X。而且TSCl和TSC2基因各外顯子上的平均測序深度與測序深度中位數均比較接近，表明目標序列捕獲二代測序的隨機性較好。

共檢測到有臨床意義的TSC2突變3例、TSC1突變1例，均為錯義突變，另有1例患者檢測到TSC1的點突變，屬于良性突變（表2）。通過對比以往文獻及LOVD數據庫MJ[7]，有1個臨床意義未明確的突變，病例1的TSC1外顯子15的c.1700C＞T錯義突變?；驒z測與臨床診斷的符合率為60%（3/5）。

應用常規Sanger測序對5例NGS檢測到5種突變位點進行驗證，其結果與目標序列捕獲測序結果完全一致，符合率100%。

2.2 依維莫司藥物療效與安全性評價

5例患者均接受口服依維莫司治療，治療持續時間3～16個月，治療1個月時的初始療效評估：PR4例、SD1例，平均腫瘤最大徑從8.5 cm縮小為6.4 cm；治療3個月療效評估：PR4例，SD1例，平均腫瘤最大徑為5.2 cm（圖1），6個月時腫瘤直徑變化不顯著（圖2）。隨訪3～20個月，4例患者病情穩定，1例患者用藥16個月后出現疾病進展。4例通過臨床診斷或基因診斷為結節性硬化的患者療效顯著優于不伴有結節性硬化的患者，而是否伴有TSC1/2基因突變與依維莫司療效間無顯著相關性。

主要不良反應包括口腔黏膜炎5例、皮疹2例、貧血2例、月經失調2例、肝功能異常1例，大部分為1～2級不良反應，不需要停藥或減低劑量，給予對癥處理后可緩解。1例患者用藥9個月出現3級肝功能不全，檢測雷帕霉素血藥濃度結果谷濃度為15.18 μg/L，換算依維莫司血藥濃度為19.7 μg/L，暫停依維莫司并給予積極保護肝功能治療后緩解，遂重新開始依維莫司治療，劑量調整為5 mg口服，1次/d，復查依維莫司血藥濃度為 7.4 μg/L。

表2 患者TSC1/2基因二代測序結果

圖1 病例5患者依維莫司治療前后CT對比

圖2 依維莫司治療后腫瘤最大直徑變化

3 討論

腎EAML是一類比較罕見的腎臟腫瘤，其發病率不到所有腎腫瘤的1%，約占腎血管平滑肌脂肪瘤的4.6%[2]。該病好發于腎臟皮質，成年女性多見，Aydin等[1]報道腎 EAML 患者較經典AML更趨于年輕化。與經典AML不同，腎EM?AL以上皮樣細胞為主，缺乏脂肪組織[8]，腫瘤多呈良性發展過程，因此其臨床表現缺乏特異性，故腫瘤體積小時常無任何癥狀，多由查體時偶然發現。腎EMAL術前診斷主要依賴于影像學檢查，但其影像學特征存在多種變化，部分腫瘤呈侵襲性表現，可侵犯鄰近器官或遠處轉移，容易造與其他類型腎腫瘤混淆而誤診。本研究組中有4例患者首次發病因腰痛就診，1例因血尿就診，MRI檢查均為乏脂肪占位，其中2例臨床診斷符合結節性硬化癥表現。

腎EMAL具有獨特的生物學行為，其惡性診斷和預后參數尚無統一標準。2015年Lei等[9]依據腫瘤標本及病理學特點提出新的預測標準：①腫瘤直徑大于9 cm；②靜脈瘤栓形成；③上皮樣細胞成分大于70%或不典型的分裂像細胞大于60%；④發現壞死。當腫瘤符合至少3項視為有高度惡性生物學行為，需要臨床密切關注。Var?ma等[10]發現腎EMAL腫瘤P53陽性提示有惡性變的趨勢，并提出Ki-67、P53有助于該類腫瘤良惡性的評估。本組患者中所有病例均為HMB45染色陽性，其中病例1、3、5均為多發轉移，其共同特點是Ki-67陽性率超過20%，核分裂像超過2/10 HPF。而病例2、4的Ki-67陽性率均為3%，核分裂像均為1～2/10 HPF。病例5年輕女性患者在人工流產后短時間內出現腫瘤快速進展，值得關注。Tsai等[11]研究發現半數以上腎EAML伴有家族結節性硬化癥（tuberous sclerosis，TSC）或其他部位的腫瘤。有報道稱腎EMAL患者伴隨結節硬化癥的比例明顯高于經典型腎AML，20%～30%的青年腎EAML患者合并結節性硬化癥[12]。本組患者均接受了TSC1/2基因檢測，4例發現致病性TSC1或TSC2基因突變，其中2例符合結節性硬化臨床診斷標準，占同期我院診斷EAML患者的30.8%（4/13）。

腎EMAL目前的治療方案沒有統一規范標準，手術切除是主要的有效治療方式，而完整的腫瘤切除可提高治療效果[13]。在手術方式的選擇上，應根據患者腫瘤大小、位置、周圍組織侵犯及遠處轉移等情況綜合評估，本組5例患者中3例在術后出現局部復發，因此在術中徹底切除腫瘤尤為重要。目前部分學者研究發現腎EMAL對阿霉素、環磷酰胺、順鉑等化療藥物治療有一定療效，同時也有個案報道腎EMAL對于放療、化療及分子靶向治療均不敏感[14-16]。Kenerson等[17-18]研究發現mTOR信號通路的異常激活在腎EAML的生長及進展中起重要作用，部分患者應用雷帕霉素、依維莫司等mTOR抑制劑出現瘤體縮小，說明mTOR抑制劑可對上皮樣血管平滑肌脂肪瘤有一定的治療作用。在一項多中心隨機對照前瞻性臨床研究（EXIST-2）中，79例臨床診斷為TSC相關EAML患者接受了6個月的依維莫司藥物治療，42%的依維莫司組患者腎臟EAML病灶體積縮?。?0%，而對照組未出現病灶體積縮小的病例[19-20]。而依維莫司在侵襲性EAML治療中的應用僅有個案報道[21-22]。本組有4例患者考慮為結節性硬化相關的EAML，給予依維莫司治療1個月后瘤體明顯減小，腫瘤持續縮小至要治療后6個月，其療效持續穩定達12個月，目前僅有1例出現進展，而另外1例非結節性硬化相關的EAML患者使用依維莫司后腫瘤變化不明顯。我們選擇了既往治療結節性硬化相關腎血管平滑肌脂肪瘤的給藥劑量10 mg/d作為初始劑量，不良反應多為1～2級，3～4級不良反應發生率低，用藥期間進行定期的安全性檢查及血藥濃度監測將有效避免嚴重不良反應的發生，并可根據血藥濃度進行合理的劑量滴定，合理的藥物滴定有助于患者長期安全地接受藥物治療。

綜上所述，侵襲性腎EMAL是一種具有惡性潛能的腫瘤，完整的腫瘤切除是治療的關鍵。對于術前評估難以完整切除或者術后出現疾病進展的患者應進行TSC1和TSC2基因突變分析，對于存在致病性TSC1/2基因突變或臨床診斷為結節性硬化的患者，依維莫司的應用可以增加手術完整切除的概率，還可以有效控制局部復發或者轉移病灶，其療效還安全性還需要進一步的大樣本前瞻性隨機對照研究來證實。