心外膜在心肌梗死后心肌修復中作用的研究進展

孫 洋，張 巖

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 阜外醫院 國家心血管病中心 1.病理科； 2.心外科, 北京 100037)

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是致死率極高的常見病和多發病，嚴重威脅人們的生命及健康。心肌梗死后如何促進心肌再生為目前亟待解決的醫學難題。心外膜是緊貼在心肌外面的一層疏松結締組織，為一群具有異質性的細胞群，具有多向分化的潛能，不僅能夠增殖、分化為多種間質細胞，還能夠提供許多調節心肌組織修復的信號分子，因此近十年來，心外膜細胞已成為心肌再生領域的研究熱點[1]。隨著對心外膜生物學特性認識的深入，越來越多的研究者嘗試利用心外膜促進心臟修復。低等脊椎動物心肌細胞具有較強的再生能力，如斑馬魚的心臟被部分切除或損傷后1～2 d，心外膜即可被廣泛激活，表達胚胎期標記(如fn1a、raldh2、tbx18和wt1)，促進心肌完全愈合。幼年哺乳動物的心肌細胞也具有再生能力，如切除新生小鼠心尖部組織后，創傷能夠快速激活心外膜，促進心肌細胞增生、修復，恢復心室腔的體積[2]。在成年小鼠中，已有研究發現心臟損傷同樣能夠激活心外膜， 引起胚胎期標志物的重新表達，但心外膜在心肌修復中的作用，不同的研究者持不同觀點?，F就心外膜的特點，及其在心臟修復中的作用進行綜述，并探討如何利用心外膜的特性提高心臟修復能力。

1 心外膜細胞的起源、分化和再生

胚胎期心外膜細胞來源于一個叫做心外膜器官(proepicardial organ，PEO)的瞬時胚胎細胞簇。在受精后60～72 h PEO移位并貼附于心肌表面，在心室、心房和流出道(或球狀動脈)表面擴展，相互融合形成心外膜。隨著發育的進展，一部分心外膜細胞經歷上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，并遷移到心外膜下空間內，分化產生各種類型的細胞，被統稱為心外膜來源細胞(epcardium-derived cells,EPDCs)[3]。使用單細胞轉錄組技術證明心外膜細胞是一群具有異質性的細胞亞群，每個亞群均有特定的表達特征以及特異的標記基因[4]。

心外膜細胞具有多向分化潛能，能夠分化為成纖維細胞[5]、血管平滑肌細胞、周細胞和脂肪細胞，但是目前尚無充分的證據證明心外膜能夠分化為血管內皮細胞或心肌細胞。使用譜系追蹤技術研究小鼠心臟發育發現，心外膜細胞是成纖維細胞的主要來源[6]。心臟損傷后，心外膜來源的成纖維細胞廣泛增殖并參與瘢痕組織形成；心外膜細胞亦能夠分化為梗死區內的血管平滑肌細胞和周細胞[7],并協助冠脈系統重建；心外膜還能夠分化為脂肪細胞，替代萎縮消失的心肌細胞。

心外膜有很強的再生能力。成年心臟損傷后，殘余的心外膜細胞會發生增殖并向損傷部位遷移。使用基因燒蝕系統(tcf21:Nitroreductase，tcf21:NTR)將成年斑馬魚中90%的心外膜細胞燒蝕，心外膜依然能快速再生[8]。對斑馬魚心外膜再生過程進行高分辨率實時成像觀察，發現在再生組織的前端出現了一個多倍體心外膜細胞亞群。這些多倍體細胞是在機械張力作用下，通過非細胞分裂的基因組復制而形成。

2 心外膜的信號功能

成年心臟發生MI后，能夠激活心外膜， 使其增殖、擴散、發生EMT以及遷移入心肌層。心外膜被激活后，還能夠分泌很多影響心肌再生的信號分子[9]。心外膜來源的細胞外基質成分(extracellular matrix,ECM)和生長因子在維持心臟組織結構和電生理功能方面起重要作用。此外，激活的心外膜可增強炎性反應，減少調節性T細胞(Treg)數量、激活巨噬細胞并調節中性粒細胞浸潤[10]。

2.1 心外膜表達的重要信號分子

2.1.1 轉化生長因子-β：轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)在心血管發育和疾病中發揮多重作用，斑馬魚心肌損傷后，心外膜細胞、纖維母細胞和心肌細胞均廣泛表達TGFβ1、TGFβ2、和TGFβ3。藥物阻斷斑馬魚的TGFβ信號通路能夠抑制ECM沉積和心肌細胞增殖。

2.1.2 血小板源生長因子： 血小板源生長因子(platelet-derived growth factors，PDGF)信號在體外能夠誘導斑馬魚心外膜細胞增殖，在體內能夠抑制心臟再生過程中冠狀動脈血管形成。在斑馬魚切除損傷模型中，在傷口纖維蛋白凝塊中表達PDGF-β，而在傷口部位的心外膜中表達血小板源性生長因子受體-β(PDGFR-β)。小鼠MI后, 梗死區表達 PDGF-β、PDGFR-β和PDGFR-α, 梗塞區血管周細胞中表達磷酸化活化的PDGFR-β?？贵w阻斷PDGFR-α和PDGFR-β，能夠減少膠原蛋白沉積，造成MI區的修復能力受損。

2.1.3 胰島素樣生長因子：斑馬魚中，損傷后7 d內，成熟的心內膜和心外膜細胞中表達IGF2b配體，心肌細胞中表達IGF1受體。使用IGF信號激動劑NBI-31772，可以促進心肌細胞增殖；而抑制IGF信號能夠降低心肌細胞的增殖和受損的心臟再生。

2.1.4 趨化因子：斑馬魚心肌切除損傷模型中，心外膜組織中表達CXC-趨化因子配體12a(CXCL12a)，心肌中表達CXC-趨化因子受體 4b(CXCR4b)。阻斷CXCR4后破壞了心臟的再生能力，原因可能為心肌細胞遷移受阻。另外，心肌CXCL12b信號和內皮CXCR4a信號在斑馬魚冠狀動脈血管發育中起著重要作用，CXCR4a突變者心臟再生缺陷。

2.1.5 WNT-β-catenin信號通路：Wnt1在胎兒心外膜中表達，正常成年心外膜不表達[11]。MI后，損傷區的心外膜和心肌成纖維細胞中能夠誘導性表達Wnt1。若在心外膜細胞中敲除其下游β-catenin將導致心外膜EMT的能力下降；在心臟成纖維細胞中敲除β-catenin導致急性心臟擴張,心臟功能紊亂。

2.1.6 Hedgehog：Hedgehog參與多個器官、組織的發育過程,與心臟再生相關。斑馬魚局部心室切除后7 d，損傷部位心外膜中 Hedgehog配體激活, Hedgehog的靶基因PTCH 2在再生區的心肌細胞內表達，促進再生過程中心肌細胞的增殖。Hedgehog還可調節心外膜細胞再生。在哺乳動物心臟發育和體內穩態過程中，Hedgehog信號可能是缺血性心臟病的一個潛在治療靶點。

2.1.7 Hippo-YAP信號通路：Hippo-YAP信號通路能夠調節哺乳動物的心肌細胞增殖，即使是在成年期YAP1的表達及其結合靶基因的能力也會對心肌細胞的增殖產生顯著影響[12]。在小鼠心臟發育過程中，Hippo-YAP信號通路中的許多信號分子 (YAP、Taz、Tead1-Tead3、Lats1、Lats2)在心外膜中表達，心外膜中YAP1、Taz是冠狀動脈血管發育所必需的。敲減胚胎期小鼠心外膜中Lats1和Lats2，能夠減少心外膜-成纖維細胞分化。在小鼠心外膜中敲除Yap和Taz可引起深部心包炎、心肌纖維化、心肌病和MI。

其他心外膜表達的信號分子，如胸腺素β4、小窩蛋白caveolin 1、神經調節因子1 (neuregulin 1，Nrg1)、成纖維細胞生長因子、骨形成蛋白(BMP)、視網膜醛脫氫酶2 (Raldh2)以及Notch等也參與心臟修復。他們功能多樣，在心臟修復中，相同的信號分子在小鼠和斑馬魚之間的作用存在差異。如心肌損傷后，在斑馬魚中抑制BMP信號，心肌細胞增殖減少，而在小鼠中抑制BMP信號，心肌細胞凋亡減少。這些信號分子在人類心臟如何作用還有待研究。

2.2 心外膜在ECM形成中的作用

ECM為其周圍細胞提供化學信號和機械支撐，越來越多的證據表明，心外膜影響ECM重構，同樣ECM也影響心外膜細胞的功能[13]。在心肌修復過程中，心外膜來源的ECM除了為細胞提供支架外，還促進細胞增殖和成熟。例如, 在斑馬魚中，心臟損傷后心外膜細胞表達ECM中的重要成分FN1和FN1b基因，若FN1基因突變或無表達會干擾心臟再生，導致瘢痕形成。在蠑螈心臟切除-再生模型中，心外膜細胞能夠誘導ECM (纖連蛋白、透明質酸和替那霉素C)在損傷部位沉積[14]。在鼠心臟發育過程中,抑制ECM中的重要成分α4-整合素信號能夠刺激心外膜細胞發生EMT并分化。盡管這些過程背后的機制還需要進一步澄清，但可以肯定的是心外膜有助于建立支持心臟再生的ECM環境。

3 心外膜在MI后心肌修復治療中可能的應用

3.1 調控心外膜

3.1.1 激活心外膜：第一項針對心外膜的嘗試性治療是在小鼠中使用再生因子胸腺素β4通過改變染色質激活心外膜[15]，刺激EPDCs增生并多向分化為成纖維細胞、平滑肌細胞和內皮細胞，從而促進毛細血管增生，擴大血管床面積，改善心肌組織血供。之后，研究者們也不斷嘗試其他方法，如使用前動力蛋白1(prokineticin 1，POK1)、VEGFA或基因調控的方法增加修復因子分泌或刺激產生有益的ECM成分，或者使用多種手段相結合，輔以病毒載體使藥物更容易地進入心外膜，促進心肌再生[16]。然而心肌細胞的再生能力有限，MI后受損的心肌只能由瘢痕增生替代，心臟功能降低迅速，目前這些方法還并不是特別有效。

3.1.2 調控心外膜分化：開發了一種從人誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)中產生功能性心外膜樣細胞的方法，通過控制BMP和WNT的劑量來調控人類iPSCs的心血管譜系分化。后續研究中，iPSCs誘導分化的心外膜細胞能夠發生EMT，并能分化為平滑肌細胞和成纖維細胞[17]。用BMP4和RA促進人類胚胎干細胞(embryonic stem cell,ESC)和人類iPSCs分化，將其接種到小雞胚胎宿主上時，產生的心外膜樣細胞具有黏附性，并能在心肌表面擴散[18]。這些研究為移植心外膜細胞和心外膜來源譜系用于治療心臟病提供了可能性。雖然研究者們做了多種嘗試，但是誘導人類心外膜細胞增殖和分化的實驗還存在技術上的挑戰。

3.2 心外膜補片

心外膜補片移植是MI后心肌再生治療良好的給藥途徑，效率比直接肌肉注射或血管內灌注更好。一類補片直接在支架材料上結合種子細胞(干細胞或間質細胞)或藥物，如結合心肌基質細胞的微針孔補片[19]、結合間質干細胞的補片[20]和離子交聯透明水凝膠制成的黏彈性補片[21]。另一類補片則嘗試模擬心外膜成分或激活心外膜。在小鼠中應用生物工程技術設計制作的類似胚胎期心外膜的補片能夠刺激心肌細胞增殖、縮小梗死面積、改善心肌功能[22]。該研究發現，將心外膜間皮細胞與小鼠胚胎干細胞來源的未成熟心肌細胞共培養，能夠提高心肌細胞增殖能力，其主要活性因子為分泌糖蛋白FSTL1。FSTL1參與抑制炎性反應、降低心肌細胞凋亡、促進心肌纖維細胞活化和MI后的心肌保護。在一項小型豬研究中也觀察到類似的效果。在損傷后應用心外膜補片，1周后即可觀察到修復效果，這對MI確診后使用患者特異性補片的治療具有指導性意義。作者在兔心肌梗死動物模型中，使用添加了TGF-β等藥物的載藥薄膜補片，使用緩釋藥物刺激心外膜反應，亦觀察到實驗組心肌梗死面積較對照組小，心肌內毛細血管密度增高。

4 問題與展望

人類心臟損傷的再生性治療是一個巨大的挑戰，雖然心外膜細胞不能直接發育成心肌細胞，但可以通過分化成脂肪細胞、血管平滑肌細胞和周細胞，并分泌多種信號分子，促進心肌細胞再生。通過激活心外膜和EPDCs，獲得心外膜對再生功能的支持，可能成為治療的新方向。為了達到這一目標，還需要篩選更多、更有效的心外膜和心肌細胞激活物。此外，為了能夠使用生物工程的方法精確操控心外膜細胞分化，需要更敏感、更特異的標志物識別不同細胞亞群，并需要對載體進行優化，以期最終實現藥物開發、治療性細胞移植等目標。