NAD(P)H依賴型氧化還原酶不對稱還原胺化制備手性胺的研究進展

程峰，李清華，李恒，薛亞平

1 浙江工業大學 生物有機合成技術研究浙江省重點實驗室，浙江 杭州 310014

2 浙江工業大學 手性生物制造國家地方聯合工程研究中心，浙江 杭州 310014

手性胺是指手性中心含有氨基的一類化合物。其作為一種結構單元，在生物活性小分子中占有相當大的比例，并構成了眾多醫藥及農藥關鍵中間體[1-2]。研究表明FDA批準的小分子藥物化合物結構中大約40%都含有1個及以上的手性胺模塊[3]。鑒于光學純手性胺在不同領域的重要應用，由簡單易得的原料出發，高效、綠色合成手性胺成為當前重要的研究領域。

目前手性胺的合成方法主要包括化學催化合成法、生物催化合成法和組合催化合成法[4-5]。其中化學催化潛手性C=N鍵的不對稱還原反應已經研究得較為透徹。但是隨著綠色工業制造對三廢排放等的要求不斷提高，傳統化學合成的方法局限性日益突出；而生物催化的不對稱合成因具有反應條件溫和、選擇性高、綠色無污染等優點，逐漸被廣泛應用于手性胺的合成中[6-8]。并且隨著分子生物學及合成生物技術快速發展，對酶的改造和修飾變得更加容易[6]。生物催化的不對稱合成已有的報道包括NAD(P)H依賴型氧化還原酶還原胺化生產手性胺 (圖1)、水解酶不對稱水解外消旋胺、黃素依賴性單胺氧化酶 (MAO)[9]去消旋化合成手性胺、ω-轉氨酶以酮化合物作為底物不對稱合成手性胺等。盡管ω-轉氨酶合成手性胺有一些成功的實例，比如Codexis公司開發的ATA-117突變體成功為糖尿病治療藥物西他列汀(含有1個手性胺模塊) 的化學-酶法合成提供了高效的催化劑，但是，轉氨酶催化合成手性胺反應是一個可逆反應，受到平衡常數的影響，底物往往很難完全轉化[10]。同時轉氨酶的催化機制決定了它的催化范圍僅允許-NH2的轉移：在轉氨過程中，來自供體的氨與輔因子5′-磷酸吡哆醛(PLP) 發生反應，將氨保留在輔因子5′-磷酸吡哆胺 (PMP) 中；之后將氨轉移到反應的共底物中；最終，潛手性酮轉化為手性伯胺 (初級胺)。而對于手性仲胺則可以使用MAO拆分外消旋胺底物，但是理論最大得率僅為50%。亞胺還原酶 (IRED)也可用于光學純手性仲胺的制備，但是由于亞胺底物本身合成的困難，限制了該酶的應用范圍[11]。還原性酮胺化酶 (RedAm) 可以以等摩爾的酮和胺為底物，催化形成碳酰胺中間體，從中除去水形成亞胺離子；然后，亞胺離子在煙酰胺輔因子NAD(P)H的作用下不對稱還原，生成產物手性胺。此外，還原性酮胺化酶還需要一種機制來防止底物酮還原為醇。

圖1 還原胺化反應一般過程Fig.1 Scheme of reductive amination reaction.

以NAD(P)H依賴型氧化還原酶為催化劑、酮化合物為底物，一步還原胺化合成手性胺的反應理論最大收率 (Yield) 和產物光學純度 (e.e.) 均可達到100%。因此，該反應是合成手性胺的最重要反應之一。本文中，我們以亞胺還原酶、氨基酸脫氫酶、冠癭堿脫氫酶和還原性酮胺化酶為例，從酶的結構和機理、分子改造及催化應用等方面總結了NAD(P)H依賴型氧化還原酶在不對稱還原胺化合成手性胺中的研究進展。

1 NAD(P)H依賴型氧化還原酶的介紹

1.1 亞胺還原酶

2011年，Mitesukura等首次報道了來源于鏈霉菌Streptomyces的亞胺還原酶 (Imine reductase，IRED，EC 1.5.1.48) 能夠不對稱還原環亞胺形成手性胺[12-16]。兩個來自Streptomyces的NADPH依賴型亞胺還原酶能夠催化亞胺2-甲基-1-吡咯啉不對稱還原胺化 (圖2)，產物具有互補的立體構型，區別于酶催化酮還原胺化的一般性機制(圖3)。在過去5年中，越來越多的IRED被發現并應用于一系列潛手性化合物的不對稱還原制備手性胺，例如苯甲醛還原為N-苯甲胺，4-苯基丁-2-酮還原為4-苯基丁-2-胺等。

圖2 通過來自Streptomyces sp.GF3546和GF5387的(S)-和(R)-IRED對2-甲基-1-吡咯啉進行同步互補還原[15-16]Fig.2 Enantio-complementary reductions of 2-methyl-1-pyrroline by (S)- and (R)-IREDs from Streptomyces sp.GF3546 and GF5387[15-16].

圖3 推定的酶催化酮還原胺化的一般性機制[1-3]Fig.3 Putative mechanism for enzyme-catalyzed reductive amination of ketone[1-3].

1.2 氨基酸脫氫酶

氨基酸脫氫酶 (Amino acid dehydrogenase，AADH，EC 1.4.1.X) 是一種NADH或NADPH依賴的氧化還原酶，催化酮化合物和氨基酸之間的相互轉化 (圖4)[17]。在胺化方向上，通過氨基酸脫氫酶催化酮酸和氨基供體偶聯形成亞胺中間體，然后利用輔助因子提供的氫化物還原亞胺中間體。關于氨基酸脫氫酶的機理及應用已經有許多報道[18]，其中研究最廣泛的氨基酸脫氫酶是亮氨酸脫氫酶 (LeuDH)[19]、苯丙氨酸脫氫酶(PheDH)[20]、谷氨酸脫氫酶 (GluDH) 以及二氨基庚二酸脫氫酶 (DAPDH)[21]。此外還有關于甘氨酸脫氫酶、丙氨酸脫氫酶、天冬氨酸脫氫酶、賴氨酸脫氫酶和色氨酸脫氫酶的報道。

圖4 氨基酸脫氫酶催化的還原胺化反應Fig.4 Reductive amination reaction catalyzed by amino acid dehydrogenase.

1.3 冠癭堿脫氫酶

冠癭堿脫氫酶 (Opine dehydrogenase,OpDH,EC 1.5.1.28)能可逆地催化氨基酸和酮酸形成N-衍生氨基酸 (冠癭堿)[22]。OpDH主要存在于細菌和高等生物體中，細菌來源的這類酶主要是NADH依賴型，例如來自節桿菌Arthrobactersp.的冠癭堿脫氫酶可以催化氨基戊酸和丙酮酸生成2S-2-[(1-R-羧基)-氨基]戊酸鹽 (圖5)；此外在細菌中如農桿菌Agrobacterium也發現一些黃素依賴型的OpDHs[23]。在高等生物體中 (如軟體動物和海綿生物) OpDH主要是NADPH依賴型的，其主要生理作用是在缺氧條件下維持糖酵解通量[24]。OpDHs除了可以催化底物與無機銨偶聯反應以外，還可以催化含有羧基的化合物與有機胺偶聯的反應，通過對其進行改造還可以獲得催化合成仲胺的突變體。

圖5 冠癭堿脫氫酶OpDH催化的還原胺化反應方程[25]Fig.5 Reductive amination reactions catalyzed by opine dehydrogenases OpDH[25].

1.4 還原性酮胺化酶

利用還原性的酮胺化反應，以酮與胺為底物等摩爾制備手性胺是許多生物催化專家的研究目標[26]。2017年，英國曼徹斯特大學Turner教授研究組在Nature Chemistry上發表了一個來源于米曲霉Aspergillus oryzae的還原性酮胺化酶 (Reductive aminase，RedAm，EC 1.5.1.28) 的酶學性質系統研究及結構解析[27]。在這篇文章中，作者首次將這種酶命名為“reductive aminase”，該酶能夠直接催化羰基化合物和胺類物質耦合成相對應的亞胺，并實現亞胺的不對稱還原。文中選取了32個酮(分成4組) 和18個胺 (分成3類) 構成的底物化合物庫被用于對其底物特異性的研究。在胺供體與輔酶NADPH充足的條件下，該酶對環狀酮、C5-C6線性酮及醛的活力明顯高于C4 酮化合物，具有較好的對映異構選擇性；而對親核性胺化合物的篩選中發現該酶顯示出對伯胺的偏好性，特別是不飽和的脂肪伯胺。進一步針對不同的酮化合物，選擇合適的醇脫氫酶偶聯酮胺化酶，可以實現生物催化“借氫”反應路徑，并對底物還原胺化[28]。盡管這些研究報道鼓舞人心，但目前對該類酶的序列、酶學性質研究與其他手性胺制備常用酶相比還相對偏少。

2 NAD(P)H依賴型氧化還原酶的結構與機理

2.1 亞胺還原酶的結構與催化機理

IRED具有二聚體結構，其中一個亞基分子量大約30 kDa，通過結構域的共享來形成活性口袋，其活性位點位于其中一個亞基Rossman折疊的N端和臨近亞基C-端的交接處 (圖6A)[29-30]。每個亞基的兩個結構域之間由一個長α螺旋來連接。整個二聚體在協同催化過程中是相對柔性的，與底物結合時可以觀察到結構域之間明顯的閉合。IREDs的晶體結構與羥基異丁酸脫氫酶(HIBDHs) 的晶體結構高度相似。但是在HIBDHs結構中 (例如2CVZ，來源于極端嗜熱菌Thermus thermophilus的HIBDH) 并沒有觀察到類似IREDs的結構域共享機制[31]。在HIBDH結構中，活性位點Lys殘基的作用是在還原方向上使新生醇質子化。當把HIBDH和IRED的結構疊加時，可以看到2CVZ結構的Lys殘基與IRED結構中不同的殘基重疊 (比如Lys與Asp或Tyr重疊)。有觀點提出，這些殘基在IRED催化的反應中起到對胺產物提供質子的作用[29]。盡管這些氨基酸殘基在催化機制方面的作用還沒有通過結構研究得以證實，但是將這些殘基突變為丙氨酸會導致其催化活性大幅下降。最近，來自東方擬無枝酸菌Amycolatopsis orientalis的IRED結構被解析出來，這是第1個有輔因子存在的情況下觀察到的IRED與胺產物 (R)-1-甲基-四氫異喹啉 (R-MTQ)結合的復合物結構 (圖6B)[32]。與沒有配體結合的IRED相比，復合物結構中催化口袋變得更加封閉，并且胺產物與活性位點Y179和N241殘基側鏈形成相互作用。這證實了活性位點氨基酸殘基在配體鉚定方面發揮著重要作用，同時它使胺的親電子碳與NADPH的煙酰胺環C-4之間處于一個合適的距離，有利于氫化物的傳遞。IRED活性位點中的Asn與HIBDH活性位點的Lys作用是一樣的，即在還原方向上給中間產物提供質子，因此在IRED催化亞胺還原過程中發揮著重要作用。

圖6 亞胺還原酶的結構示意圖 (A：來自Amycolatopsis orientalis的亞胺還原酶 (AoIRED) 結構圖；B：AoIRED的活性位點與外消旋MTQ和NADPH的復合物結構圖，改編自[32])Fig.6 The structures of imine reductase.(A) The structure of imine reductase from Amycolatopsis orientalis (AoIRED).(B) The active site of AoIRED with racemic MTQ and NADPH (adapt from [32]).

2.2 氨基酸脫氫酶的結構與催化機理

目前，針對氨基酸脫氫酶的還原胺化反應，研究較多的是亮氨酸脫氫酶 (LeuDH) 和苯丙氨酸脫氫酶 (PheDH) 等。Rice等確定了一個來自球形芽孢桿菌B.sphaericus的LeuDH晶體結構(PDB︰1LEH)[33]。該酶的晶體結構中，兩個亞基締合形成二聚體，其中一個亞基由364個氨基酸組成，存在由深裂縫分開的兩個結構域。該深裂縫是輔因子結合位點及底物結合位點 (圖7A)。而在溶液中，LeuDH的四級結構普遍被認為是一個八聚體，結構域運動在催化作用中發揮重要作用，在底物存在的情況下關閉結構域，從而使輔因子和底物足夠接近以進行氫化物轉移。

酶-底物模型表明，該酶通過115位天冬氨酸殘基及68位、80位兩個賴氨酸殘基與底物結合，將L-亮氨酸錨定在活性中心 (圖7B)。K80在AADHs序列中是高度保守的。如果將K80突變成Ala或Gln，K80Q突變體Km值從野生型的5.1 mmol/L增加至17 mmol/L，K80A突變體Km值則降低至3.7 mmol/L (以L-亮氨酸為底物)。Sekimoto等也分析了K80的作用，其最主要的作用被證明是參與了水的活化，并在脫氨方向上對亞胺離子的親電碳進行攻擊，具體催化機制如圖8所示[34]。通過NAD+從亮氨酸 (Ⅰ) 中提取氫化物形成亞胺離子 (Ⅱ)，K80作為質子供體，激活水分子以攻擊親電碳原子，形成碳酰胺中間體 (Ⅲ)，從中間羥基到胺分子內質子轉移形成氧負離子(Ⅳ)，通過K80的側鏈穩定氧負離子 (Ⅳ)，最終脫去氨基基團，生成產物α-酮異己酸鹽 (Ⅴ)。目前已解析的PheDH的晶體結構中包括能催化苯丙酮酸和L-苯丙氨酸之間相互轉化的1BW9和1C1D，以及能催化苯基乳酸和β-苯丙酸酯之間相互轉化的1C1X與1BXG。有研究指出，PheDH的催化活性是通過活性位點上的結構域閉合來實現的，使底物和輔因子充分接近以進行催化反應。例如來源于粟褐芽孢桿菌Bacillus badius的苯丙氨酸脫氫酶[35]和來源于紅球菌Rhodococcussp.M4的PheDH[36-37]。它們具有48%的序列同源性，晶體結構也非常相似，同樣由兩個結構域構成，中間由一個大裂隙分開，輔因子結合在其中，結構域的移動被證明參與了還原胺化和氧化脫氨反應。

圖7 亮氨酸脫氫酶的結構示意圖[33] (A：含有NADH和L-亮氨酸的LeuDH復合物結構；B：含有L-亮氨酸及NADH的活性位點結構圖)Fig.7 The structure of leucine dehydrogenase[33].(A) The complex structure of LeuDH with NADH and L-Leucine.(B)The active site of LeuDH with L-leucine and NADH.

圖8 LeuDH對L-亮氨酸脫氨基的催化機制[34] (Ⅰ：L-亮氨酸；Ⅱ：亞胺離子；Ⅲ：碳酰胺；Ⅳ：含氧負離子；Ⅴ：α-酮異己酸鹽)Fig.8 Proposed mechanism of deamination of L-leucine by LeuDH[34].I:L-leucine;II:iminium ion;III:carbinolamine;IV:oxyanion;V:α-ketoisocaproate.

來自Rhodococcussp.的PheDH與L-Phe的復合物圖如圖9A所示，類似于LeuDH催化機制，底物氨基與118位點的天冬氨酸相互作用，羧基與66位點和78位點賴氨酸殘基以及262位點天冬酰胺的側鏈相互作用 (圖9B)。當以3-苯基丙酸酯作為底物對野生型及突變體進行動力學測定時發現對于底物結合來說，D118與底物氨基的相互作用并不特別重要，而K68側鏈在底物存在時，發揮了識別水分子的作用，水分子參與形成碳酰胺中間體。關于脫氨方向的催化機制被認為是首先與輔因子NAD+結合，然后通過L-Phe有序釋放銨離子、苯丙酮酸和NADH。

圖9 苯丙氨酸脫氫酶結構示意圖[37] (A：含有NAD和L-Phe的PheDH (1C1D) 單體結構圖；B：PheDH活性位點處底物與輔酶及關鍵氨基酸殘基的結構圖)Fig.9 Structures of phenylalanine dehydrogenase[37].(A) Structure of monomer of PheDH (1C1D),with NAD and L-Phe.(B) The PheDH active site structure of substrate,NAD and key residues.

基于此，Brunhuber等推測出了類似于LeuDH脫氨機制的PheDH脫氨基催化機制 (圖10)[37]。底物以兩性離子形式存在，胺處于質子化狀態。K78活化水分子催化氨基 (Ⅰ) 去質子化，氫化物轉移至NAD+與其相互作用 (Ⅱ)，形成亞胺離子 (Ⅲ)；接著K78活化水分子以攻擊亞胺碳(Ⅲ)，得到碳酰胺中間體 (Ⅳ)；然后K78催化碳酰胺去質子化 (Ⅴ)，D118向胺基團提供質子，使得產物苯丙酮酸的羰基與K78的側鏈結合 (Ⅵ)，可以防止苯丙酮酸被輔因子還原成苯基乳酸。底物為苯基乳酸時，酮基與K78的側鏈結合使得羰基碳與NAD(H) 的C-4的距離變為5.1 ?，對于它們之間發生氫化物遞送而言距離遠，因此反應很難進行。

圖10 推定的PheDH催化機制 (改編自[37])Fig.10 Mechanism of PheDH adapted from Brunhuber and co-workers[37].

在D-氨基酸脫氫酶 (DADH) 中研究最為廣泛的是一種NADP+依賴性的氧化還原酶內消旋-2,6-二氨基庚二酸脫氫酶 (Meso-DAPDH)。meso-DAPDH可以分為兩大類型：一類是表現出對內消旋-二氨基庚二酸 (Meso-DAP) 底物專一的氧化脫氨活性，屬于Ⅰ型，例如來源于谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum的meso-DAPDH (CgDAPDH)；另一類不僅表現出對內消旋-二氨基庚二酸 (Meso-DAP) 底物氧化脫氨活性，更表現出優越的可逆胺化活性，并且具有更寬的底物譜，屬于Ⅱ型，例如來源于嗜熱菌Symbiobacterium thermophilum的meso-DAPDH(StDAPDH) (圖11)[38-40]。

圖11 內消旋-2,6-二氨基庚二酸脫氫酶催化的可逆反應[38-40]Fig.11 The reversible reaction catalyzed by DAPDH[38-40].

來源于Symbiobacterium thermophilum的meso-DAPDH (StDAPDH) 是在自然界中發現的第一個具有還原胺化活性的D-氨基酸脫氫酶，通過對StDAPDH的晶體結構 (PDB︰3WBF) 研究發現，StDAPDH屬于六聚體結構，輔因子和底物結合在其中 (圖12A)。StDAPDH通過與CgDAPDH序列比對及保守型分析，發現StDAPDH的兩個氨基酸殘基R35和R71在Ⅱ型中是高度保守的，通過進一步的實驗研究發現，R35只是活性相關位點，并不是底物偏好性的相關氨基酸殘基。而R71不僅是活性相關位點，而且是影響StDAPDH底物偏好性的重要氨基酸殘基。此外StDAPDH中還存在兩個丙酮酸的底物結合通道，位于M152的兩側，Asp92和Asn253與M152相互作用，從而可能影響StDAPDH結構域運動及其催化性能 (圖12B)[39]。

通過進一步的研究，Gao等推導出StDAPDH催化內消旋-二氨基庚二酸脫氨基催化機制(圖13)[41]，首先是氫化物從內消旋-二氨基庚二酸Cα轉移至輔因子煙酰胺環的C4N上，生成亞氨基酸 (Ⅰ)；接著在H154的作用下，水分子進攻亞氨基酸，形成甲醇胺 (Ⅱ)；隨后該中間產物分解生成L-2-氨基-6-酮基庚二酸和氨 (Ⅲ)。

2.3 冠癭堿脫氫酶的結構與催化機理

Asano等在以N-(1-(R,S)-羧基乙烷基)-S-苯丙氨酸 (圖14) 為底物的富集培養基上篩選到含有OpDH的節桿菌Arthrobactersp.strain 1C，并從該菌株中成功純化出OpDH[25]。以L-苯丙氨酸、丙酮酸鹽為底物，NADH作為輔酶，OpDH-CENDH作為催化劑催化底物形成N-(1-(R,S)-羧基乙烷基)-S-苯丙氨酸。其他疏水性L-氨基酸包括L-甲硫氨酸，以及D-氨基酸包括D-亮氨酸也可以作為該酶的底物，但是對L-甲硫氨酸的催化活性很低，轉化率僅有3.4%。同時，草酰乙酸以及碳鏈更短的乙醛酸也可以作為底物。

Asano教授課題組通過進一步的研究，成功克隆出該酶基因，編碼359個氨基酸[42]?；诖?，該酶的裸蛋白結構[43]及與底物精氨酸和苯丙酮酸的復合物結構[44]都得以解析。與其他AADHs相同，OpDH在兩個結構域的交界處有一條裂隙，并且可以在裂隙中觀察到輔酶 (圖15A)。借助NMR、ITC等手段，結合復合物結構基本闡明了OpDH的催化機制[45]：在以L-精氨酸為底物的晶體復合物中，L-精氨酸的α-羧基與H212相互作用，胍基與E142的側鏈基團相互作用 (圖15B)[44]。由于這些發揮作用的氨基酸分別來自于不同的結構域，因此可以認為是L-精氨酸的結合觸發了不同結構域的閉合，實現了酶的偶聯催化。在以丙酮酸為底物的晶體復合物中，丙酮酸的α-羧基與Q118的側鏈相互作用，H212與底物羰基形成氫鍵。由于羰基位置遠離輔酶NADH，因此無法觀察到從丙酮酸還原到乳酸的過程。同時將118位點進行突變，獲得突變體Q118A，其還原活性大幅度下降?；谶@些結果，可以得出精氨酸與丙酮酸這兩個底物與酶的結合順序。從精氨酸與丙酮酸疊合之后的晶體復合物中觀察到Q118和H212的朝向幾乎沒有任何改變 (圖15B)。

圖13 StDAPDH對meso-DAP脫氨基的催化機制[41]Fig.13 Proposed mechanism of deamination of meso-DAP by StDAP[41].

圖14 由來自Arthrobacter sp.strain 1C冠癭堿脫氫酶OpDH-CENDH催化的還原胺化反應方程式[25]Fig.14 Reductive amination reactions catalyzed by opine dehydrogenases OpDH-CENDH from Arthrobacter sp.strain 1C[25].

圖15 OpDH的結構與機理圖[43-45] (A：來源于扇貝鲆Pecten maximus的OpDH與L-精氨酸、丙酮酸和NADH的復合物結構圖；B：OpDH的活性位點與底物L-精氨酸、配體丙酮酸的局部示意圖)Fig.15 The structure and mechanism of OpDH[43-45].(A)Structure of OpDH from Pecten maximus with L-arginine,pyruvate and NADH.(B) The OpDH active site structure with L-arginine and ligand pyruvate.

但是，每個配體到輔酶NADPH煙酰胺環的距離都較遠，這表明在活性構象中底物被煙酰胺環C4位的H還原為亞胺，因此在這種構象中包含了不同的配體結合模式。進一步，NMR的實驗研究被用于探究L-精氨酸和丙酮酸與酶的結合順序[45]。通過監測15N標記的apo蛋白，在15N-1H-TROSY光譜中選擇5個峰，可以觀察到NADH的結合對這些化學位移產生了擾動影響。在向OpDH-NADH復合物中添加L-精氨酸之后，觀察到進一步的擾動，但是當丙酮酸添加到同樣的復合物中時卻沒有發現擾動現象。這一點可以證明在偶聯催化反應中L-精氨酸是在NADH與OpDH結合之后與酶結合的。等溫量熱研究也證實了這一觀點：當L-精氨酸加入OpDH-NADH復合物時，可以顯示出可測量的焓變，但當加入丙酮酸到同樣的復合物時，卻沒有焓的變化。

2.4 還原性酮胺化酶的結構與催化機理

鑒于還原性酮胺化酶RedAm能夠實現酮與胺的等摩爾還原胺化，科學家對其三維空間結構(apo及holo形式) 進行了解析 (PDB 5G6R：不結合底物的apo形式，PDB 5G6S：結合底物的holo形式)。結果顯示該酶具有典型的亞胺還原酶同源二聚體三級結構，每個單體分別由一個N端的Rossman結構域和C端的α-螺旋束結構域構成，兩個結構域中間通過一個長α-螺旋臂連接，兩個結構域之間則依靠α-螺旋束之間的交叉作用力形成二聚體 (圖16)。該還原性酮胺化酶的三維空間結構緊湊，底物結合區域的空間體積明顯小于類似的亞胺還原酶，在酶的底物結合區域，組成了催化三連體Asn93-Asp169-Tyr177。為了探索還原性酮胺化酶底物識別分子機制與催化機制，科學家對該酶活性口袋附近的氨基酸D169、Y177進行了突變及酶學性質研究。結合動力學研究結果與晶體結構信息及結構特征，推測反應過程中亞胺中間態的形成也在酶的活性口袋，這一點明顯區別于以往發現的亞胺還原酶，這也是其表現出催化活性比亞胺還原酶高的原因所在。對于還原性酮胺化酶AspRA的催化機理，認為首先是Y177側鏈與酮底物的羰基相互作用，將酮底物進行固定，同時胺底物與N93和D169的側鏈相互作用，D169使胺底物脫去質子，然后與酮底物偶聯生成甲醇胺中間體，去除水分子形成亞胺離子，然后亞胺離子被NADPH還原，最終獲得產物胺化合物 (圖17)[27]。

圖16 還原性酮胺化酶的二聚體結構與酶-NADPH-底物結合的放大精細圖[27] (紫色區域：Rossman結構域；藍色區域：二聚體α-螺旋束；紅框區域：酶-NADPH-底物)Fig.16 The dimer structure of reductive aminase and the complex of RA-NADPH-substrate[27].Purple region:Rossman domain;blue region:dimeric α-helical beam;red box region:RA-NADPH-substrate.

圖17 推測的還原性酮胺化酶反應機理[27]Fig.17 Proposed mechanism of AspRA towards ketones[27].

3 NAD(P)H依賴型氧化還原酶的改造與應用

3.1 亞胺還原酶 (IRED) 的改造與應用

首次提出IREDs具有還原胺化活性的Mueller等對來自鏈霉菌Streptomycessp.GF3546的S-選擇性IRED不對稱胺化還原4-苯基-2-丁酮生成手性胺進行了詳細研究 (圖18)。當甲酸銨作為氨基供體，雖然加入氨基供體的量足夠多，反應過程中投入大量的酶，但是最終的轉化率仍然很低，為8.8%，ee值為76%。目前尚不清楚對于這個反應IRED是否真正發生了還原胺化反應，還是因為在反應介質中加入大量氨而預先自發形成亞胺。

圖18 由來自鏈霉菌屬 (Streptomyces sp.GF3546)的 (S)-IRED催化還原胺化4-苯基丁-2-酮[30]Fig.18 Reductive amination of 4-phenylbutan-2-one by(S)-IRED from Streptomyces sp.GF3546[30].

為了進一步研究IREDs催化還原胺化反應的機制，Hauer等進行了雙分子還原胺化反應的研究，在研究過程中將來自玫瑰鏈孢囊菌Streptosporangium roseum的IRED在無機銨、甲胺或者苯胺存在的情況下還原胺化苯甲醛[46]。當使用1倍的胺進行反應時，速度較慢；當胺的用量增加到10或50倍時，苯甲醛與甲胺生成N-苯甲胺，反應8 h，轉化率達到73%。使用50倍的甲胺，乙酰苯和環己基酮作為底物，與甲胺反應生成相應的產物胺，轉化率分別為39%和53%，ee值為87%和78%。

Roche公司的生物催化小組首次報道了具有嚴格立體選擇性且能夠不對稱還原環亞胺的IREDs家族，之后該小組又繼續研究了IRED催化的不對稱還原胺化反應[47]，向IRED酶庫中添加9種酶之后，篩選對酮 (包括苯乙酮、2-己酮和環己酮) 底物和親核胺供體 (包括氨、甲胺或丁胺) 具有還原胺化活性的IRED。實驗結果表明不同底物轉化率各不相同，分別在10%–90%之間，其中對苯乙酮的胺化反應產率最低。兩個優勢突變體“IR_11”和“IR_20”催化100 mg底物的反應中。IR_11催化酮和甲胺生成手性胺產物1，產率為71%，de值98% (圖19)；IR_20催化酮和無機銨生成手性胺產物2，產率為50%，de值94%。除此之外，IR_20還可以催化2-己酮和甲胺還原胺化生成手性胺產物3，產率為55%，ee值96%。上述每個反應都是在pH 9.3 (利于亞胺形成) 的條件下進行的，其中胺的摩爾量都是底物摩爾量的12.5倍。導致活性較低的原因主要歸因于亞胺在水溶液中形成速率較慢，通過使用NMR也沒有檢測到亞胺中間體。

圖19 優勢突變體“IR_11”和“IR_20”催化的還原胺化反應[48]Fig.19 Reductive aminations of ketones by superior IREDs (IR_11Q and IR_20)[48].

H?hne等進一步將IRED擴展到更多的手性化合物合成上[49]。除了先前測定的活性外，再次對Roche公司的IRED酶庫進行篩選。其中，使用仲胺5作為胺供體成功還原胺化環己酮4 (圖20)?？古两鹕C合征藥物(R)-雷沙吉蘭9同樣也是由Roche酶庫中的IR_14催化茚酮7和炔丙胺8還原胺化生成的，產率為58%，ee值為90%。除此之外，IRED突變體“IR_Sip”用于合成(S)-雷沙吉蘭，產率為81%，ee值為72%。上述的每個反應都處于pH 9.0的緩沖液中，胺供體摩爾用量為底物摩爾量的40倍，這一點證明了預形成的亞胺底物是IRED產生活性的首要條件。

圖20 利用IRED進行還原胺化反應制備(R)-和(S)-雷沙吉蘭[49]Fig.20 Preparation of (R)-and (S)-rasagiline using IREDs in reductive amination reactions[49].

研究中發現，亞胺還原酶大多為NADPH依賴型，在全細胞催化的反應中NADPH的含量要都低于NADH，從而影響催化效率。Nestl等采用“Cofactor Specificity Reversal—Structural Analysis and Library Design”策略，對來自葉柄粘球菌Myxococcus stipitatus的亞胺還原酶經過多輪突變，獲得的突變體V10，對NADH/NADPH的活力提高了2 900倍，從而能增加了亞胺還原酶轉化2-甲基吡咯啉 (2MP) 生成2-甲基吡咯烷(2MPD)的效率[50]。

Zhu等通過對大量IREDs (包括88種酶) 進行篩選，成功篩選出亞胺還原酶優勢突變體IR2和IR45 (圖21)。它們能夠以極高的立體選擇性和轉化率將間位和對位的氯/甲基/甲氧基-芐基二氫異喹啉 (DHIQ) 轉化為相應的R型或S型THIQ。通過對結構的觀察，發現IR45的W191位點對空間位阻影響較大，將191位的色氨酸突變為丙氨酸后，其Km值比野生型IR45降低了170倍，解除了底物抑制作用，催化效率 (kcat/Km) 比野生型IR45提高約8倍[51]。

圖21 IREDs不對稱還原1-芐基-DHIQ衍生物Fig.21 Asymmetric reduction of 1-benzyl-DHIQ derivatives by IREDs.

到目前為止，IRED已經被證明可以在高pH環境下對亞胺進行不對稱還原，亞胺的形成一般通過如圖2所示的一般催化機制來進行，但是在這個亞胺形成的過程中酶所發揮的作用尚不十分清楚。隨著IRED酶序列、結構以及用于酶進化高通量方法的研究結果逐漸增加，對用于還原胺化反應的IREDs改造及機制相關研究將成為未來的研究熱點。

3.2 氨基酸脫氫酶 (AADH) 的定向進化與應用

胺脫氫酶 (Amine dehydrogenase，AmDH，EC 1.4.99.3) 是一類能夠催化初級胺氧化脫氨生成醛和氨的氧化還原酶。而氨基酸脫氫酶可以實現氨基酸與酮化合物之間的相互轉化，因此可以通過改造氨基酸脫氫酶，獲得能夠催化其逆反應的胺脫氫酶，即以醛或酮為底物，無機銨為供體，通過還原胺化反應生產手性胺。例如通過定向進化改造亮氨酸脫氫酶獲得的胺脫氫酶能夠還原胺化α-酮異己酸酯的類似物甲基異丁基酮 (圖22)[52]。Bommarius等針對來自嗜熱脂肪芽孢桿菌Bacillus stearothermophilus的LeuDH中對羧酸鹽識別機制的68位點殘基進行了定點飽和突變，篩選到一株對甲基異丁基酮具有活性的突變體K68M，但其活性較低[52]。因此對圖7B中所示的來自B.sphaericus的LeuDH晶體結構中其他活性位點進行突變，其目的是篩選到對甲基異丁基酮催化活性提高的突變株。優先考慮的突變位點有K68、D114和V291，以及參與輔因子NADH識別的N261。經過突變篩選到最優突變體為K68S/E114V/N261L/V291C，其對甲基異丁基酮的轉化率顯著提高至92.5%，ee值為99.8%。

圖22 LeuDH定向進化獲得AmDH的活性[52]Fig.22 Activity of AmDH evolved from LeuDH[52].

Bommarius等研究了LeuDH的體外的定向進化的過程，旨在進行PheDH對酮還原胺化方面的研究[35]。以LeuDH成功突變案例作為指導，將來自Bacillus badius的PheDH進行突變獲得雙變體K77M/N276V，其對4-甲基-2-戊酮和氟苯基丙酮的活力較野生型酶有了提高[35]。在兩個位點的基礎上又繼續突變，獲得了新的變體K77S/N276L，其kcat值較雙突變體K77M/N276V又提高了15倍。新突變體K77S/N276L (F-AmDH) 增加了對苯氧基-2-丙酮、2-己酮和3-甲基-2-丁酮的還原胺化活性。F-AmDH是NADH依賴型氧化還原酶，在催化過程中使用葡萄糖和葡萄糖脫氫酶輔酶再生系統，轉化氟苯基丙酮得到相應的胺產物，轉化率為93.8% (產物分離產率為73.9%)，ee>99.8%(圖23)。

圖23 F-AmDH還原胺化氟苯基丙酮，同時使用輔酶循環系統實現輔酶循環[34]Fig.23 Reductive amination of p-fluorophenylacetone by F-AmDH,with cofactor recycling[34] .

通過將F-AmDH的N-端部分 (1–149位點)與LeuDH突變體的140–166的位點組合產生的新嵌合胺脫氫酶cFL1-AmDH，其對苯乙酮和金剛烷基甲基酮具有催化活性，并且具有嚴格的立體選擇性，只形成 (R)-胺產物[53]。在進一步的改造中，嵌合體中的兩個相鄰的天冬酰胺殘基N270和N271突變為亮氨酸，以試圖影響其胺化活性，結果表明新突變體催化氟苯基丙酮的kcat值有了提高。F-AmDH對一些底物催化活性較低，可能因為底物在水溶液中的溶解度較差的原因。因此制備了庚烷與水=1︰4的雙相反應系統，在這樣的催化體系中，F-AmDH催化氟苯基丙酮還原胺化的體積生產率提高為原來的2倍[54]。

隨后Li等針對酮的不對稱還原胺化，對來自Rhodococcussp.的PheDH進行改造[55]。將其結構中與底物羧酸鹽基團相互作用的氨基酸K66、S149和N262進行三重突變，獲得了一個K66Q/S149G/N262C三突變體。該突變酶能夠催化苯丙酮12和4-苯基-2-丁酮14生成 (R)-苯丙胺13和(R)-1-甲基-3-苯基丙胺15，ee值均>98% (圖24)。S149G位點的突變除了改變與底物羧酸鹽基團的相互作用之外，還改變了與底物結合口袋入口的大小。來自Rhodococcussp.的胺脫氫酶S149G突變體與葡萄糖/葡萄糖脫氫酶NADH輔酶循環系統相互作用，15 mmol/L的14在60 h后轉化為(R)-1-甲基-3-苯基丙胺15，轉化率為95.2%。進一步，Li等將AmDH與GDH共同固定在磁性納米顆粒 (MNPs) 上[57]，為14的不對稱還原胺化提供了一個合適的反應體系，NADH再循環的總轉換數達到2 940。Mutti等驗證了來自Rhodococcussp.M4的胺脫氫酶還原胺化活性，結果表明除了底物12和14之外，該酶還可以有效轉化鄰甲氧基苯基丙酮衍生物，脂族酮 (2-辛酮，轉化率99%) 和“大體積”酮類 (如1-苯基-丁-2-酮，轉化率>99%；1-苯基戊-2-酮，轉化率71%；1-苯基戊-3-酮，轉化率83%)[56]。此外，來自Rhodococcussp.的AmDH與甲酸/甲酸脫氫酶輔酶循環系統相互作用，可以將208 mg (對甲氧基苯基)丙酮16轉化為 (R)-胺17，產物分離產率為82% (圖24)。

圖24 由來自Rhodococcus sp.M4的AmDH針對不同酮化合物的還原胺化反應方程式[55-56]Fig.24 Reductive amination of ketones by AmDH from Rhodococcus sp.M4[55-56].

AmDHs的發現促使人們尋找可能具有該活性的天然酶。在排除了作用于胺α-或β-羧酸酯基團的脫氫酶同源物的搜索，Vergne-Vaxelaire等使用了L-erythro-3,5-二氨基己酸脫氫酶(3,5-DAHDH) 的序列作為鑒定AmDHs此類酶的模板[58]。在169個同源物中，選取20個克隆并表達，其中有3個顯示出對4-氧代戊酸和5-氧代己酸具有還原胺化活性。來自移動石袍菌Petrotoga mobilis的一種AmDH和甲酸/甲酸脫氫酶輔酶循環系統相互作用，可以將4-氧代戊酸轉化為(S)-4-氨基戊酸酸，產物分離產率為88%，ee>99.5% (圖25)。目前還沒有找到AmDH這種酶的緊密同源物的結構，這些天然存在的AmDH為胺生產提供了新的酶目標。

圖25 通過來自Petrotoga mobilis的胺脫氫酶還原胺化4-氧代戊酸[58]Fig.25 Reductive amination of 4-oxopentanoic acid by naturally occurring amine dehydrogenase from Petrotoga mobilis[58].

華東理工大學許建和、鄭高偉課題組在胺脫氫酶創制方面作出了許多出色的工作，他們以自主研發的氨基酸脫氫酶為模板，開發出了3個新的胺脫氫酶并針對其底物譜較窄的問題，采用計算機輔助的蛋白質工程技術，構建了突變體LfAmDH(A113G/T134G)，實現了對活性口袋的“容積拓展”，從而將該酶所催化的底物范圍由最長6個碳鏈的脂肪酮拓展至長達10–12個碳鏈的脂肪酮，顯著地拓寬了該酶催化的底物范圍[59]。最近，許建和課題組與曼徹斯特大學Turner教授課題組合作，對來源于紡錘形賴氨酸芽孢桿菌Lysinibacillus fusiformis的氨基酸脫氫酶進行了分子改造，開發出了一系列能夠轉化-羥基酮不對稱還原胺化的胺脫氫酶 (圖26)，其中的最優突變體可以不對稱還原胺化不同鏈長-羥基酮，合成相應的(S)-鄰位氨基醇 (99%的轉化率且ee>99%)。該工作將胺脫氫酶的底物譜由酮類化合物拓展到羥基酮類化合物，為手性藥物中間體鄰位氨基醇的合成提供了新型的生物催化劑[60]。

圖26 胺脫氫酶催化的α-羥基酮不對稱還原胺化合成手性鄰位氨基醇[60]Fig.26 Asymmetric reductive amination of α-hydroxy ketones catalyzed by amine dehydrogenase for the synthesis of chiral vicinal amino alcohols[60].

針對D-氨基酸脫氫酶底物譜狹窄的缺點，許多科學家在拓寬其底物譜上作出了貢獻。中國科學院天津工業生物技術研究所朱敦明、吳洽慶課題組對來自Symbiobacterium thermophilum的meso-DAPDH催化口袋進行改造，提高催化口袋的大小容納更大體積的2-酮酸。選擇Phe146、Thr171、Arg181和His227四個點進行突變，獲得的StDAPDH突變體H227V催化苯丙酮酸活力達到2.39 U/mg，較原始菌株提高了35.1倍[61]。在此基礎上，進行半理性設計及飽和突變，獲得一株突變體W121L/H227I，不僅對大位阻2-酮酸底物展現出優良的活性，成功合成了對應的D-氨基酸 (D-苯甘氨酸、D-色氨酸、D-叔亮氨酸)，而且提高了對其他結構2-酮酸的比活力。通過將底物與野生型和突變體進行分子對接，發現這些有益突變重塑了底物結合口袋，不僅可以容納這些大位阻底物，同時拉近了底物與輔酶之間的催化距離，使其獲得對大位阻底物的催化活性[62]。另一個有意思的例子是Vedha等對來源于谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum的meso-DAPDH進行三輪定向進化，獲得的突變體BC621打破了該酶只能氧化脫氨的限制。該突變體可以催化多種酮酸生成相應的D-氨基酸，其中催化生成D-2-氨基己酸酯、D-2-氨基庚酸、D-2-氨基辛酸酯、D-環己基丙氨酸，酶活力較原始菌株分別提高257、538、975、625倍，ee均大于95%[63]。

日本科學家Akita等成功通過在活性位點附近引入5個突變獲得一株熱穩定性的突變體。該突變體在65 ℃下活力幾乎沒有任何損失，具有巨大的工業應用潛力[64]。Hayashi和其合作者通過定點突變技術將來源于嗜熱球形脲芽胞桿菌Ureibacillus thermosphaericus的meso-DAPDHs的底物譜進行了拓寬[65]。通過將94位的天冬氨酸替換為丙氨酸 (D94A)，該酶的底物譜得到了極大的提高，其對D-亮氨酸、D-正亮氨酸、D-甲硫氨酸、D-異亮氨酸和D-色氨酸的活力提高了6–25倍，其中對苯丙酮酸的活力最高 (16.1 μmol/(min·mg))。通過晶體結構解析，發現D94A減少了底物苯基與側鏈天冬氨酸的空間碰撞，通過結構比對發現底物口袋的擴大和口袋疏水性的增強是導致突變株對大位阻疏水性D-氨基酸活性增強的主要原因。一年后，Akita等將來源于U.thermosphaericus的meso-MADPHs進行了組合突變 (Q154L、D158G、T173I、R199M和H249N)，創造出了高熱穩定性的meso-MADPHs[66]。進一步，通過引入單突變D94A，該高熱穩定性的D-氨基酸脫氫酶對大位阻側鏈D-氨基酸的活力明顯提高。

針對非天然氨基酸前體酮作為底物的氨基酸脫氫酶定向進化，浙江大學楊立榮團隊挖掘到來源于惡臭假單胞菌Pseudomonas putida的氨基酸脫氫酶，將其應用到L-草銨膦的合成，采用蛋白質工程技術，獲得突變體I170M，其活力較野生型有2.1倍的提高[67]。通過后期的繼續工作研究，構建突變體A167G和V378A，活力較之前有了很大提升[68]。

同時，筆者所在課題組采用計算機輔助的蛋白質工程技術，獲得一系列谷氨酸脫氫酶超級突變體“草銨膦脫氫酶”，其能高效地轉化2-羰基-4-(羥基甲基氧膦基)-丁酸 (PPO) 生成L-草銨膦。與葡萄糖脫氫酶輔酶循環系統相互作用，500 mmol/L的PPO可以在30 min內轉化完全 (圖27)[69]，并通過將“草銨膦脫氫酶”與D-氨基酸氧化酶偶聯采用一鍋法制備L-草銨膦，以外消旋D,L-草銨膦為底物，D-草銨膦經過D-氨基酸氧化酶催化生成PPO，PPO經過“草銨膦脫氫酶”催化生成L-草銨膦，實現L-草銨膦的高效合成，為工業化生產奠定了基礎[70]。

圖27 谷氨酸脫氫酶 (GluDH) 不對稱還原胺化PPO生成L-PPT，葡萄糖作為第二底物供給葡萄糖脫氫酶輔酶循環系統生成NADPHFig.27 Asymmetric reductive amination of PPO catalyzed by glutamate dehydrogenase mutant for the synthesis of L-PPT and combined with glucose dehydrogenase,glucose as a secondary substrate for the regeneration of NADPH.

3.3 冠癭堿脫氫酶 (OpDH) 的定向進化與應用

OpDH催化的酮酸不對稱胺化反應中，以有機胺作為氨基供體的轉化效率大于無機銨，因此Codexis公司的研究人員希望能應用這些酶催化無羧基的酮和有機胺直接的反應[71]。通過以Arthrobactersp.strain 1C菌株來源的CENDH作為出發序列，通過定向進化，他們獲得了一株不僅能夠催化丙酮酸和L-纈氨酸生成相應的(2S)-2-(1-(羧乙基)氨基)-戊酸，同樣能夠催化1-丁胺生成相應的2-(丁氨)-丙酸的突變體 (圖28)。后續的定向進化又獲得了更多的突變體，它們能夠利用多種胺來催化環己酮、2-戊酮、2-四氫萘酮的衍生物生成相應的仲胺產物，ee值均大于99.5% (圖28)。其中一個七重組合突變體首次表現出了對催化環己酮和丁胺生成相應的仲胺的活性。通過解析CENDH的晶體結構 (1BG6和3C7D)，發現這些突變位點都位于兩個結構域之間的裂隙內 (圖29)。

圖28 由定向進化產生的CENDH突變體催化的選擇性還原胺化反應[71]Fig.28 Selected reductive aminations catalyzed by CENDH variants created using directed evolution[71].

圖29 CENDH的活性中心示意圖 (含輔酶NADH和丙酮酸)[71]Fig.29 The active site structure of CENDH with NADH and pyruvate[71].

根據以上的這些研究可以清楚地發現在以有機胺為胺供體的情況下，OpDH具有催化酮還原胺化為手性胺的潛力，但是有關OpDH催化機制以及活性位點殘基與底物之間的相互作用等方面還不清楚，這些信息將有助于進一步的蛋白質工程研究。

3.4 還原性酮胺化酶 (RedAm) 的定向進化與應用

還原性酮胺化酶可以催化等摩爾的酮與伯胺的不對稱還原胺化得到仲胺產物，在合成手性胺方面具有巨大潛力。英國曼徹斯特大學Turner課題組針對來源于曲霉菌A.terreus和A.dermatitidis的還原性酮胺化酶AtRedAm和AdRedAm進行定向進化，獲得突變體AtRedAm-Y222A，以烯丙胺作為胺供體，對18、20、21 (圖30) 三種不同酮類進行生物還原胺化，其轉化率相對野生型酶分別提高了11%、49%和5%。優勢突變體I123A使用環己酮19作為酮底物，以A、B、D、E、F、G為胺供體，發現其比酶活較野生型酶提高了2.7–6.2倍；以C、H為胺供體，由野生型無活性變為有活性，比酶活達到8.5 mU/mg和17.2 mU/mg。AdRedAm突變體H215A使用烯丙胺作為胺供體，對18、19、21進行還原胺化，其轉化率分別提高了20%、2%和16%[27]。

圖30 還原性酮胺化酶涉及到的酮和胺底物[27]Fig.30 Ketone and amine substrates catalyzed by RedAm[27].

4 總結

利用NAD(P)H依賴型氧化還原酶不對稱還原胺化已成為制備光學純手性胺的重要方法，相關的研究引起了國內外學者的極大興趣，也取得了顯著的進展。從現有氨基酸脫氫酶的蛋白質工程改造到天然胺脫氫酶的發掘，再到亞胺還原酶及還原性胺化酶的補充，已經有許多手段和方法進行挖掘、鑒定、改造獲得具有還原胺化活性的NAD(P)H依賴型氧化還原酶。通過對這些酶胺化反應機理的解析，可以成功改造這些酶 (氨基酸脫氫酶、胺脫氫酶、冠癭堿脫氫酶、亞胺還原酶和還原性酮胺化酶) 的部分酶學性質 (表1)。但總體來說這類酶在工業應用上成功的案例還相對較少。未來，針對NAD(P)H依賴型氧化還原酶實際應用的工業環境，突破它們底物譜較窄、活性較低、高濃度底物轉化率偏低等瓶頸限制，是實現其在工業上廣泛應用的關鍵所在。