綿羊粒細胞集落刺激因子原核表達與提純及用于顆粒細胞培養的效果

李閏婷，陳龍欣，張麗萌，何海迎，王泳，楊若晨，段春輝，劉月琴，王玉琴，張英杰

1 河北農業大學 動物科技學院，河北 保定 071001

2 鄭州師范學院 分子生物學實驗室，河南 鄭州 450044

3 河南科技大學 動物科技學院，河南 洛陽 471023

粒細胞集落刺激因子 (Granule cell stimulating factor，GCSF) 是集落刺激因子中糖蛋白生長因子中的一員，能支持造血祖細胞的增殖[1-3]。GCSF可刺激特定骨髓前體細胞增殖以及分化成粒細胞，延長中性粒細胞系各個階段的祖細胞的存活時間，刺激多能干細胞的增殖和分化，誘導單核細胞和巨噬細胞的形成，誘導成熟中性粒細胞產生更多的中性粒細胞并提高其存活率，維持其表型，但是該蛋白的半衰期較短[1-6]。有資料顯示GCSF的表達量差異可能與某些動物的抗病能力密切相關，有研究通過體外注射GCSF提高牛和狗的免疫力、提高輔助生殖率及治療乳房炎等的報道[7-17]，但尚無該蛋白用于羊的繁育方面的研究。

卵泡的生長和發育，受到來自顆粒細胞、卵泡膜細胞和卵母細胞自分泌或者旁分泌的基因、激素以及生長因子的作用和調控[18]。有研究提示細胞集落刺激因子參與了卵泡發育和排卵的生理過程，這種炎癥性細胞因子可能以自分泌和旁分泌的方式參與到卵泡周期的調控當中，在發育的卵泡周圍存在著巨噬細胞，這些細胞通過分泌內皮生長因子和其他細胞因子起到促進顆粒細胞增殖的作用[18]。研究發現磷脂酰肌醇3激酶(Phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(Protein kinase B，PKB/AKT) 和肝激酶B1 (Liver kinase B1，LKB1)/AMP活化蛋白激酶 (AMPactivated protein kinase，AMPK) 信號通路相關因子共同參與調控卵泡顆粒細胞增殖、卵泡直徑變化、成熟和周期性排卵等過程[19]。有報道顯示GCSF在PI3K/AKT通路中起到重要作用[20-21]。

本研究通過分子克隆的方法，原核表達羊GCSF蛋白，并將純化的GCSF蛋白添加到體外培養的綿羊顆粒細胞中，通過細胞活力試驗、細胞周期試驗和凋亡試驗，研究GCSF對顆粒細胞增殖和凋亡的影響，為GCSF作為分子靶點用于提高綿羊免疫力的分子遺傳育種研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

宿主菌大腸桿菌Escherichia coliXL1-Blue、原核表達載體pET28a均由鄭州師范學院分子生物學實驗室提供。DMEM/F12培養基為Gibco產品。E.coliBL21(DE3) 化學感受態細胞、TransGen質粒提取試劑盒、Anti-His Mouse Monoclonal Antibody、HRP標記的Goat Anti-Mouse IgG(H+L)、6× Protein Loading Buffer及DNA marker購自北京全式金生物技術有限公司。DNA膠回收試劑盒為QIAgen產品。Ni-NTA凝膠購自南京金斯瑞生物科技有限公司。ECL發光液試劑盒購自晶彩公司。Annexin-V FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術。胰酶替代物 (不含EDTA)和AlamarBlue?HS Cell Viability Reagent購自賽默飛世爾科技 (中國) 有限公司。碘化丙啶(Propidium iodide，PI) 購自Life technologies。限制性內切酶購自NEB北京。其他試劑為國產分析純試劑。

1.2 羊GCSF的克隆

根據羊GCSF的C-末端的序列 (GenBank登錄號：L07939)，由GENEWIZ公司進行合成并連接到pUC57載體上。

pUC57-GCSF與載體質粒pET28a分別進行BamH Ⅰ和NcoⅠ雙酶切后回收目的大小的DNA片段，用T4 DNA連接酶將兩個片段連接后42 ℃熱激60 s轉化到感受態細胞E.coliXL1-Blue中，涂布于含有50 μg/mL卡那霉素和100 μg/mL四環素的2×YT固體培養基平板上，37 ℃培養過夜。次日挑取單克隆增菌培養后用TransGen質粒提取試劑盒提取質粒，對重組質粒進行酶切鑒定、PCR鑒定及序列測定 (GENEWIZ) 分析，將轉化獲得的陽性重組質粒命名為pET28a-GCSF。以熱休克法 (42 ℃熱激60 s) 將重組質粒pET28a-GCSF轉化宿主菌E.coliBL21(DE3) 中，重組菌命名為BL21(DE3)/pET28a-GCSF。

1.3 羊GCSF的表達

取重組菌BL21(DE3)/pET28a-GCSF接種于2 mL的LB培養基 (含50 μg/mL卡那霉素) 中，37 ℃培養至OD600約為0.6時，加IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼續劇烈振蕩培養5 h后，取1 mL菌液，10 000×g離心，棄上清，在沉淀中加入70 μL PBS、20 μL 6×蛋白上樣緩沖液和10 μL 1 mmol/L DTT后，煮沸5 min，取10 μL用于SDS-PAGE。同時，設未誘導重組菌作為對照。確定重組羊GCSF能夠表達后，進行大量搖菌表達，誘導表達方法同上。誘導表達結束后，用50 mL離心管收集全部培養物，8 000 r/min離心20 min收集菌體沉淀。

1.4 羊GCSF的純化與鑒定

上述菌體沉淀加入20 mL的PBS溶液 (按照1︰20稀釋)，充分重懸菌體沉淀。對重懸液中的菌體進行冰浴超聲破碎20 min，超聲破碎程序：超聲5 s，暫停5 s。超聲后12 000 r/min離心收集上清。上清中的重組蛋白用Ni-NTA凝膠裝填的重力柱進行純化，詳細的溶液配方與操作步驟參考Ni-NTA凝膠說明。主要包括2 mL的填料裝填到25 mL的空柱中，依次用ddH2O和結合緩沖液各10 mL對柱子進行平衡；超聲破碎后的上清全部過柱；之后用20 mL的結合緩沖液分兩次洗滌柱子；待結合緩沖液全部流出后，用洗脫緩沖液洗脫柱子上結合的蛋白，并收集流出液。將所有收集的流出液用3 kDa的超濾管進行超濾濃縮，并用PBS替換其中的含有咪唑的溶液。濃縮后的樣品用分子篩Superdex75 10/300 GL在AKTA蛋白純化系統中進行精細純化，收集進樣后12 min出峰的溶液，最后再經3 kDa的超濾管進行超濾濃縮，濃縮液即為純化的GCSF蛋白質溶液。

純化的GCSF蛋白溶液用NanoDrop2000C測量濃度后進行分裝。取2 μg用于SDS-PAGE和Western blotting檢測。Western blotting檢測采用硝酸纖維素膜，90 V轉膜30 min，5%脫脂乳 (含有0.05%的Tween20的PBST配制) 室溫封閉2 h，一抗為Anti-His Mouse Monoclonal Antibody，室溫孵育1 h，二抗為HRP標記的Goat Anti-Mouse IgG(H+L)，室溫孵育1 h，ECL發光液顯色，用多色熒光化學發光凝聚成像系統拍照保存結果。其余蛋白儲存于?80 ℃備用。使用時用DMEM/F12培養基稀釋至需要的濃度。

1.5 羊GCSF的活力驗證

M-NSF60細胞是一種用于檢測GCSF活力的細胞。從液氮中取出的M-NSF60細胞迅速在37 ℃的水浴中融化，立即轉移到37 ℃預熱的含10%FBS、1%雙抗、2 nmol/L β-巰基乙醇、62 ng/mL hMCSF的RPMI1640培養基中重懸浮細胞，用白細胞計數板在顯微鏡下計數，調整細胞密度為2×104個細胞/mL，于37 ℃、5% CO2條件下培養48 h后離心收集細胞傳代。進行GCSF生物學活性檢測前，離心收集細胞，加入RPMI1640培養基(含10% FBS、1%雙抗、2 nmol/L β-巰基乙醇) 洗滌細胞3次后，加入終濃度為0、0.03、0.30、3.00、30.00、300 ng/mL GCSF或62 ng/mL hMCSF的RPMI1640培養基 (含10% FBS、1%雙抗、2 nmol/L β-巰基乙醇) 中用96孔細胞培養板培養48 h后，每孔分別再加入10 μL AlamarBlue? HS細胞活力試劑溶液在細胞培養箱內繼續孵育3 h，用EnVision?多標記微孔板檢測儀在Ex/Em分別為560 nm/590 nm進行吸光值檢測。

1.6 羊顆粒細胞的體外培養

從唐縣瑞麗肉食屠宰場收集1歲左右的小尾寒羊卵巢，分別用醫用酒精和生理鹽水各沖洗表面3次后，立即放入盛有約37 ℃的生理鹽水 (含1%的雙抗) 的保溫瓶中，3 h內帶回實驗室。將采回的卵巢用醫用酒精沖洗3次，再用37 ℃預熱的DPBS (Gibco) 緩沖液清洗3次，用已滅菌的小剪子剪掉卵巢外筋膜，將卵巢放在盛有37 ℃預熱的含10% FBS (Gibco)、1.5%雙抗 (Gibco) 的DMEM/F12 (Gibco) 培養基中，洗滌2次。用滅菌的刀片將卵泡直徑為3–7 mm的卵泡逐個割破，用滅菌的小鑷子將卵泡液擠壓出來，然后將全部培養液吸至15 mL離心管中，吹打后垂直靜置10 min，使卵母細胞和其他小組織沉淀，吸取上清液轉移至新的無菌15 mL離心管，100×g離心10 min，棄掉上清。加入DMEM/F12培養基 (含10% FBS、1%雙抗) 重懸細胞，離心洗滌 (100×g，10 min)后棄掉上清，重復3次。重懸浮細胞使之成為單細胞懸液，用白細胞計數板在顯微鏡下計數，調整細胞密度為2×104個細胞/mL，于37 ℃、5% CO2條件下培養，24 h后更換培養液，去除未貼壁的細胞。貼壁培養的細胞即為顆粒細胞，加入DMEM/F12培養基 (含10% FBS、1%雙抗) 繼續培養。

1.7 細胞增殖檢測

待顆粒細胞長滿至培養瓶的80%時用胰蛋白酶消化，并按1×105個細胞/mL分別接種于96孔板中，每孔100 μL，分成2個處理組：對照組 (不添加GCSF只添加DMEM/F12培養基) 和添加了不同濃度GCSF蛋白的DMEM/F12培養基稀釋液的試驗組 (600 ng/mL、60 ng/mL、6 ng/mL、0.6 ng/mL和0.06 ng/mL)，每組設3個重復孔，連續培養2 d，每天定時加入10 μL AlamarBlue?HS細胞活力試劑溶液后在細胞培養箱內繼續孵育3 h，用EnVision?多標記微孔板檢測儀在Ex/Em分別為560 nm/590 nm進行吸光值檢測。

1.8 細胞周期檢測

待顆粒細胞長滿至培養瓶的80%時用胰酶替代物 (不含EDTA) 消化，并按2×105個細胞/mL的密度接種4 mL于60 mm細胞培養皿中，分成2個處理組：對照組 (不添加GCSF只添加DMEM/F12培養基) 和添加了60 ng/mL GCSF蛋白的DMEM/F12稀釋液的試驗組，每組設3個重復。顆粒細胞處理24 h后，用胰酶替代物 (不含EDTA) 消化處理細胞3 min，100×g離心3 min收集細胞。PBS重懸細胞100×g離心3 min洗滌一次。細胞用1 mL的PBS重懸后，加入?20 ℃預冷的無水乙醇4 mL，邊加邊混勻，避免細胞結團。固定細胞過夜后，離心收集細胞，用含有2%FBS的PBS重懸細胞。加入終濃度為1 μg/mL的PI對細胞進行染色，避光室溫孵育15 min。用流式細胞儀進行檢測，每次計數最少2×104個細胞，結果用NovoExpress軟件進行細胞周期擬合分析。

1.9 細胞凋亡檢測

待顆粒細胞長滿至培養瓶的80%時用胰酶替代物 (不含EDTA) 消化，并按1×105個細胞/mL的密度接種2 mL于6孔板中，分成2個處理組：對照組 (不添加GCSF只添加DMEM/F12培養基)和添加了60 ng/mL GCSF蛋白的DMEM/F12稀釋液的試驗組，每組設3個重復孔，繼續培養24 h和48 h后，用胰酶替代物 (不含EDTA) 消化處理細胞3 min，加入含10% FBS的細胞培養液終止消化，將細胞輕輕吹打下來轉入無菌的2 mL離心管中，100×g離心5 min。用含2% FBS的PBS洗滌細胞2次，100×g離心5 min，棄上清。加入500 μL結合緩沖液使細胞懸浮，分別單獨或同時加入Annexin-V FITC 5 μL和PI染液5 μL，輕輕吹打混勻，室溫 (25 ℃) 避光反應15 min后采用流式細胞儀進行檢測。

1.10 統計分析

采用GraphPad 6.0軟件進行統計分析。試驗數據以表示。P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 羊GCSF的克隆、表達與純化

擴增得到的GCSF基因片段分別經雙酶切后，回收目的片段，連接到同樣經過雙酶切的pET28a載體上并轉化到E.coliXL1-blue宿主菌株中后，分別提取質粒進行PCR、酶切和測序鑒定，結果均與預期相符，其中測序結果與之前用L07939的序列繪制的質粒圖譜比對結果如圖1所示，測序得到的序列與預期序列完全一致。鑒定正確的質粒命名為pET28a-GCSF。

圖1 GCSF基因片段的測序比對結果Fig.1 Alignment of GCSF sequence.The residues that match the pET28a-GCSF were hidden as“.”.

經鑒定正確的pET28a-GCSF轉化到E.coliBL21(DE3) 中，將重組菌命名為BL21(DE3)/pET28a-GCSF。分別培養重組菌OD600達到0.6后，用IPTG誘導目的蛋白表達并純化后進行SDS-PAGE和Western blotting檢測 (圖2)。

圖2 SDS-PAGE和Western blotting檢測純化的GCSF蛋白Fig.2 SDS-PAGE and Western blotting analysis of purified GCSF protein.

2.2 羊GCSF的生物學活性檢測

羊GCSF的生物學活性如圖3所示。在0.03–300.00 ng/mL的終濃度范圍內，隨著加入GCSF蛋白濃度的增加，M-NSF60細胞的熒光強度逐漸升高。添加了羊GCSF的試驗組中的M-NSF60細胞的熒光強度與陽性對照組趨勢一致。證明本研究純化的蛋白有GCSF生物學活性。

圖3 GCSF蛋白的生物學活性檢測結果Fig.3 Bioassay of GCSF protein.The data were averaged across subjects and tested for significance by pair-samples t-test.The P value of GCSF group vs PBS group.**:P<0.01.

2.3 GCSF對綿羊顆粒細胞增殖的影響

本實驗室前期研究顯示，體外培養的綿羊卵巢顆粒細胞，第1天顆粒細胞處于貼壁生長期，細胞緩慢生長，培養第2–4天細胞處于分裂高峰期，細胞開始大量增殖進入對數生長期，第4–5天之后，細胞開始走向衰老退化[17]。本研究中，顆粒細胞中添加了不同濃度的GCSF后，連續2 d，每天定時加入10 μL AlamarBlue?HS細胞活力試劑溶液后在細胞培養箱內繼續孵育3 h，用EnVision?多標記微孔板檢測儀在Ex/Em分別為560 nm/590 nm進行檢測。結果如圖4所示，在培養時間24 h和48 h、GCSF濃度0.06–600.00 ng/mL的范圍內，隨著加入的GCSF終濃度增加，熒光強度增大。其中在24 h添加GCSF濃度為6.00 ng/mL和60.00 ng/mL時與對照組相比差異極顯著 (P<0.01)，濃度為 0.60 ng/mL和600.00 ng/mL時與對照組相比差異顯著 (P<0.05)；48 h添加GCSF濃度為60.00 ng/mL和600.00 ng/mL時與對照組相比差異顯著(P<0.05)。細胞活力與熒光強度成正比。

圖4 GCSF對綿羊顆粒細胞增殖的影響Fig.4 The effection of GCSF on proliferation of sheep granulosa cells.The data were averaged across subjects and tested for significance by pair-samples t-test.The P value of GCSF group vs Ctr group.*:P<0.05;**:P<0.01.

2.4 GCSF對綿羊顆粒細胞周期的影響

外源添加GCSF培養顆粒細胞24 h后，細胞周期擬合結果如圖5所示，與對照組相比試驗組G1期細胞比例由 (63.98±1.32)%變為 (65.45±2.39)%，略有增加，差異不顯著；S期細胞比例由(26.88±2.62)%變為 (15.53±1.72)%，顯著減少(P<0.05)，G2/M期細胞比例由 (9.37±0.84)%變為(16.94±2.06)%，顯著增多 (P<0.05)。

圖5 細胞周期比較圖Fig.5 Cell cycles analysis.(A) Cell cycle histogram of the flow cytometry.(B) The statistical analysis of GCSF group vs Ctr group was based on the values of each phase.Note:The data were averaged across subjects and tested for significance by pair-samples t-test.The P value of GCSF group vs Ctr group.* P<0.05.

2.5 GCSF對綿羊顆粒細胞凋亡的影響

顆粒細胞經GCSF處理后，經過AnnexinVFITC/PI染色如圖6所示，檢測結果將凋亡細胞(早期凋亡和晚期凋亡)、正?；罴毎蛪乃兰毎麉^分開。24 h時對照組 (Ctr) 和試驗組 (GCSF) 的凋亡率分別是 (7.02±0.35)%和(6.49±0.32)%。48 h時對照組和試驗組的凋亡率分別是 (10.25±0.51)%和(8.09±0.41)%。試驗組凋亡率和對照組相比，24 h檢測時凋亡率差異不顯著，48 h檢測時凋亡率顯著降低 (P<0.05)。

圖6 GCSF處理后綿羊顆粒細胞凋亡圖Fig.6 Treatment with GCSF on apoptosis in cultured sheep granulosa cells.Q2-4:early apoptotic cells;Q2-2:late stage apoptotic cells;Q2-3:normal living cell;Q2-1:dead cells.

3 討論

GCSF可刺激粒細胞分化，延長中性粒細胞系各個階段的祖細胞的存活時間，誘導成熟中性粒細胞增殖并提高其存活率，維持其表型，但是該蛋白的半衰期較短，體內研究中其他物種來源的GCSF半衰期一般在24 h以內[1-6]。持續時間越長，添加到培養基中的GCSF的剩余濃度越小，相對應的生物學活性也會隨之降低。本研究表達純化的羊GCSF蛋白用于活力檢測時，參考了以往的研究報道[6]，選擇了在培養基中添加羊GCSF蛋白后的48 h這一時間點進行檢測；在對顆粒細胞的影響的研究中，也選擇了48 h以內的時間點進行檢測。GCSF對綿羊顆粒細胞增殖的影響中，24 h結果中GCSF組與對照組相比有兩對是差異極顯著的，而48 h結果中僅為差異顯著，這也很可能是由于添加到培養基中的GCSF蛋白被代謝消耗后濃度降低造成的。GCSF作為一種生物大分子，需要與其受體GCSF-R (granulocyte colony stimulating factor receptor) 結合，相互作用后將信號傳導進入細胞。羊GCSF-R在羊顆粒細胞表面是否存在及存在量多少尚未得到驗證，有待繼續研究。本研究中使用的顆粒細胞為同一羊的卵巢中統一條件下分離用于后期實驗，可以排除細胞實驗條件的差異。此外，細胞增殖、凋亡和周期檢測的結果可以互相印證羊GCSF促進細胞增殖，抑制細胞凋亡活性。

有研究表明GCSF有助于由化療引起的大鼠卵泡嚴重損失的恢復[22-23]。卵泡從生長到成熟期包括募集、選擇、優勢化和閉鎖幾個重要環節，僅有少部分卵泡可以在發育過程之后成熟，大部分在卵泡發育的不同階段逐漸閉鎖退化[24]。在哺乳動物卵泡發育的各個時期受到一些與之相關的分子及信號通路的調控[24]。吳正中等發現使用GH組與未使用GH組卵相比，泡液GH與IGF-1含量及卵泡液E2濃度和卵巢顆粒細胞上GHR mRNA、IGF-1R mRNA和STAR mRNA的表達水平均顯著正相關[25]。本研究結果表明GCSF的添加促進顆粒細胞的增殖。作為集落刺激因子的糖蛋白生長因子中的一員，可能以與GH相同的方式發揮作用，需要進一步驗證。

細胞進入分裂期后，會嚴格執行細胞周期各階段的程序及分子事件。細胞分裂周期主要分為3個階段，包括：G1期，主要是細胞器的復制，細胞增大；接著，細胞進入S期，主要是DNA的復制；最后細胞進入G2/M期，細胞將各組分平均分配到各個子細胞中。通過流式細胞術可以很容易地檢測細胞周期的不同階段。如本研究圖3所示，顆粒細胞經GCSF處理后，流式細胞儀結果顯示，S期細胞顯著減少，G2/M期細胞顯著增加，處于分裂狀態的細胞顯著增加，在GCSF的動員下，顆粒細胞分裂速度加快，細胞周期的分布顯著改變。

卵巢顆粒細胞的增殖和凋亡在卵泡閉鎖中起重要的作用[26]。在發育卵泡中，10%的顆粒細胞凋亡將注定卵泡閉鎖[23]。細胞凋亡是一種程序化的細胞自主死亡過程，在細胞凋亡的不同階段具有不同的生物化學變化和細胞形態特征[27]。細胞凋亡有死亡受體通路、線粒體通路和內質網通路3條信號轉導通路。顆粒細胞的凋亡主要參與兩個途徑(線粒體途徑和死亡受體途徑)，這兩個途徑都能交匯Caspase家族的信號分子。顆粒細胞凋亡是由Caspase-3酶的活性、促凋亡和抗凋亡蛋白決定的[21]。有研究顯示，GCSF可以在大鼠腦溢血模型中通過PI3K/AKT通路顯著調高抗凋亡因子B細胞淋巴瘤-2 (B cell lymphoma-2，Bcl-2) 和血管內皮生長因子 (Vascular endothelial growth factor，VEGF) 的表達，抑制促凋亡因子Caspase-3的表達，從而影響細胞生長和凋亡[20,28-29]。本研究的結果顯示，外源添加的GCSF可能以相同的方式影響細胞周期的分布，促進了顆粒細胞的增殖，抑制了顆粒細胞的凋亡，進而可能影響卵泡的發育及排卵，其分子機制還有待于進一步研究驗證。