β-甘露聚糖酶Man5A和木聚糖酶Tlxyn11B的融合表達

孔海洋，蔣肖，王苑，黃火清，羅會穎

中國農業科學院飼料研究所，北京 100081

半纖維素這一概念于1891年由Schulze提出，表示植物中能夠用2%–20%的NaOH溶出的酸性多糖，通常占植物干重的15%–30%[1]，硬質木材和禾本科植物中半纖維素的主要成分為木聚糖[2]，而植物的種子和果實中半纖維素主要成分為甘露聚糖[3]。木聚糖酶、甘露聚糖酶在半纖維素的生物轉化過程中發揮重要作用[4]。在半纖維素的水解中甘露聚糖酶和木聚糖酶通常聯合使用[3]，且兩種酶在降解半纖維素方面存在協同效果[5]。木聚糖酶 (Endo-1,4-β-xylanase，EC 3.2.1.8) 能夠作用于含有β-1,4木糖苷鍵的木聚糖的主鏈并將其降解為木二糖及木二糖以上的寡聚和少量木糖[6]。主要分布在糖苷水解酶 (Glycoside hydrolase，GH)第5、7、8、10、11和43家族[7]，其中GH10和GH11家族研究最多，GH10家族木聚糖酶采用(β/α)8桶狀結構，而GH11家族木聚糖酶為β-果凍卷結構，它們均以雙保留機制對底物進行降解(催化氨基酸為兩個谷氨酸)。β-甘露聚糖酶(β-1,4-mannanase，EC 3.2.1.78) 能夠水解含有β-1,4-D-甘露糖苷鍵的甘露聚糖，主要分布在糖苷水解酶GH5和GH26家族[8-10]，兩個家族序列相似性通常不足20%，但它們均為規則的TIM桶結構且采用相同的雙保留機制 (催化氨基酸通常為位于第4個和第7個β-折疊片上的谷氨酸)[11-12]，此外在GH113和GH134等家族甘露聚糖酶也有少數分布。糖苷水解酶除了含有一個成熟的催化結構域，通常還含有一個碳水化合物結合結構域，目前根據氨基酸序列，結合特異性和結構被分為86個家族 (CAZy數據庫：www.cazy.org)，它們之間通常借助一個較短的連接區進行連接，CBM通常與底物的水解和酶的穩定性相關，已有報道的甘露聚糖酶中含有的CBM結構域分布在CBM1、2、27、35等家族中，通常由β折疊片構成三明治結構[13-16]。

有的糖苷水解酶具有雙功能或多功能，但天然存在的多功能酶普遍存在活性低、耐酸堿及高溫能力差等特點[17-20]。蛋白質融合技術作為一種具有簡化生產工藝、節約生產成本、改善酶學性質等優點的基因工程技術，近年來在蛋白的表達、純化、性質改良、獲得雙功能或多功能蛋白、功能特異性的多功能抗體和蛋白的表面展示等方面均有應用[21]。在植物生物質的酶解方面蛋白質融合也得到了廣泛的應用，Elleuche等將耐寒基因與木聚糖酶基因進行融合，獲得的酶的耐低溫能力大幅提升[22]。Lu 等融合了葡聚糖酶和木聚糖酶，極大改善了融合酶的催化效率[23]。張獻偉等通過將黑曲霉來源的木聚糖酶和甘露聚糖酶借助連接肽進行融合并在豬腎細胞 (pK15) 中進行表達，融合酶中的木聚糖酶和甘露聚糖酶的活性分別比單獨表達時提高了54.0%和104.4%[24]。Adlakha 等把從昆蟲腸道中獲得的木聚糖酶與纖維素酶融合表達，融合酶較親本酶活性也都有一定提高[25]。

藍狀菌T.leycettanusJCM12802是一株耐熱真菌，最適生長溫度為40 ℃，目前已經從該菌株克隆獲得了大量的生物質降解酶資源，且多數具有耐高溫的特性[26]，本實驗室先前從該菌株中克隆獲得了一個GH5家族甘露聚糖酶Man5A，其最適溫度為90 ℃，且在80 ℃條件下穩定，同時獲得了一個GH11家族木聚糖酶Tlxyn11B，最適溫度為65 ℃，比活高達8 300.0 U/mg，但其熱穩定性較差。本研究將木聚糖酶基因Tlxyn11B成熟蛋白編碼區序列與去除CBM區的甘露糖酶基因man5A通過甘露糖酶連接區相融合，并在畢赤酵母當中進行表達和性質測定，最終融合酶同時具有較高的甘露聚糖酶和木聚糖酶活性，木聚糖酶的熱穩定性得到了明顯的提升。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體

帶有木聚糖酶基因的質粒pPIC9-Tlxyn11B和帶有甘露聚糖酶基因的質粒pPIC9-man5A均由本實驗室保存[27-28]。質粒 pEASY-T3和宿主菌大腸桿菌Escherichia coliTrans1-T1購自北京全式金生物技術有限公司，用于目的基因的克隆。質粒pPIC9和表達宿主畢赤酵母Pichia pastorisGS115購自Invitrogen，用于表達載體的構建和外源基因的表達。

1.1.2 試劑和試劑盒

限制性內切酶購自TaKaRa有限公司；重組酶和DNA純化試劑盒購自南京諾唯贊生物公司；質粒提取試劑盒購自OMEGA公司；底物角豆膠和櫸木木聚糖購自Sigma-Aldrich；蛋白Marker購自Genestar 生物公司；DNA高保真聚合酶FastPfuDNA Polymerase購自北京全式金生物技術有限公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.1.3 主要培養基及培養條件

實驗中所用的培養基有LB (Luria-Bertani)液體培養基和固體培養基、YPD (Yeast extract peptone dextrose medium) 液體培養基和固體培養基、MD (Minimal dextrose) 固體培養基、BMGY(Buffered glycerol-complex medium) 培養基、BMMY (Buffered methanol-complex medium) 培養基。其詳細制備方法可參照文獻[19]。

1.2 甘露聚糖酶和木聚糖酶融合基因的獲得

以帶有木聚糖酶TlXYN11B編碼基因Tlxyn11B的質粒pPIC9-Tlxyn11B為模板，以xyn11-F1和xyn11-R1為引物進行PCR擴增，獲得木聚糖酶成熟區編碼基因Tlxyn11B；以質粒pPIC9-man5A為模板，以man-F1和man-R1為引物進行PCR擴增，獲得去除了CBM區的甘露聚糖酶基因man5A。PCR反應程序為：95 ℃保溫5 min；95 ℃保溫30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃保溫10 min。引物序列見表1，下劃線部分代表限制性酶切位點EcoRⅠ和NotⅠ，其中man-F1和xyn11-R1含有15 bp的同源序列以便于后續通過重疊延伸PCR進行木聚糖酶與甘露聚糖酶基因的融合。

表1 構建木聚糖酶-甘露聚糖酶融合基因的引物序列Table 1 Primer sequences for constructing xylanase-mannanase fusion gene

上述PCR擴增產物進行凝膠電泳并分別回收目標條帶，以回收條帶混合物為模板，以xyn11-F1和man-R1為引物進行PCR擴增，反應條件同上。PCR擴增產物連接pEASY-T3熱激轉化到Trans1-T1感受態細胞，并涂布氨芐青霉素抗性的LB固體培養基平板，37 ℃過夜培養后進行菌落PCR驗證，并挑選陽性轉化子進行測序驗證。The underline represents the restriction enzyme cleavage site.

1.3 融合表達質粒pPIC9-Tlxyn11B-man5A的構建、轉化與陽性克隆篩選

測序正確的克隆進行質粒提取經EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后回收基因片段，連入同樣經EcoRⅠ和NotⅠ處理的pPIC9載體，轉化Trans1-T1大腸桿菌感受態，挑選陽性克隆并測序驗證。獲得重組載體pPIC9-Tlxyn11B-man5A用于畢赤酵母的轉化。

重組載體pPIC9-Tlxyn11B-man5A用限制性內切酶BglⅡ線性化處理，經凝膠電泳純化后回收線性化產物，利用電擊轉化畢赤酵母GS115感受態細胞，用1 mol/L 的山梨醇重懸，30 ℃靜置孵育1 h使細胞復蘇，然后涂布于組氨酸缺陷型MD平板，30 ℃恒溫箱內倒置培養2–3 d至長出肉眼可見的單菌落，隨機用牙簽挑選48個克隆子后點種到標有數字1–100的MD和MM平板上30 ℃恒溫箱內倒置培養1–2 d，用牙簽挑取克隆接種于有相應標號的含有3 mL BMGY培養基的15 mL酵母管中，30 ℃、220 r/min培養48 h后離心去除上清液，菌體用1 mL BMMY培養基重懸，誘導培養48 h后離心收集上清液進行酶活測定，篩選出高活性的轉化子。

1.4 重組酶的獲得和純化

篩選獲得的活性高的轉化子進行搖瓶培養。將陽性轉化子在YPD培養基活化后按1%接種量接種于300 mL BMGY液體培養基中，30 ℃、220 r/min培養48 h，4 500 r/min離心5 min棄上清，菌體重懸于150 mL含有0.5%甲醇的BMMY液體培養基繼續培養48 h，期間每隔12 h補加0.5%的甲醇。培養結束后離心收集上清液，經截留分子量10 kDa的膜包濃縮，用10 mmol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液 (pH 6.5) 進行過夜透析以去除多余的鹽分。透析處理后的酶液加載到經過平衡的HiTrap QXL陰離子交換層析柱中，并用10 mmol/L的pH 6.5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液的配制的1 mol/L NaCl進行梯度洗脫，收集相應的峰所對應的蛋白并進行酶活性的測定和SDS-PAGE分析。

1.5 酶活力的測定

木聚糖酶及甘露聚糖酶的酶活性測定均采用3,5-二硝基水楊酸 (DNS) 法，具體參照Miller等[29]的方法并有所改進。具體反應體系為：100 μL適當稀釋的酶液，900 μL質量體積比為1%的櫸木木聚糖 (用于木聚糖酶酶活的測定) 或0.5%角豆膠 (用于甘露聚糖酶酶活的測定) 的檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液，恒溫反應10 min后加入1.5 mL DNS終止反應，沸水浴中煮沸5 min后立即置于冷水中冷卻，取250 μL反應終止液于540 nm下測定吸光值，并根據相應的標準曲線計算出酶活力。木聚糖酶活力在pH 4.0、70 ℃條件下測定，甘露聚糖酶活力在pH 5.0、90 ℃條件下測定。酶活定義為：在上述條件下，每分鐘產生1 μmol還原糖所需的酶量為1個單位 (U)。

1.6 酶學性質分析

最適溫度及熱穩定性的測定：將純化后的融合酶進行適當稀釋，在30 ℃–95 ℃溫度條件下及pH 4.0或pH 5.0的條件下分別測定木聚糖酶和甘露聚糖酶的酶活，以確定融合酶中木聚糖酶和甘露聚糖酶的最適溫度。將稀釋酶液 (100 ng/μL)分別在60 ℃、70 ℃、80 ℃ 三個不同溫度下處理2、5、8、10、20、30、60 min后立即置于冰上，之后稀釋合適的倍數并在最適條件下測定處理過的酶液的剩余酶活。以未經處理的酶的酶活力為100%，分別計算不同溫度條件、處理不同時間后樣品的剩余酶活以測定酶在不同溫度下的穩定性。

最適pH及pH穩定性的測定：分別在甘露聚糖酶和木聚糖酶的最適溫度條件下測定不同pH(1.0–12.0)條件下的酶活力來確定最適pH；將酶用不同pH的緩沖液進行稀釋，37 ℃恒溫孵育1 h，在最適條件下測定剩余酶活力，并以未處理酶液的酶活力為100%，計算不同pH處理下的相對剩余酶活以測定酶在不同pH下的穩定性。

動力學常數的測定：分別以濃度范圍為0.1–10.0 mg/mL的櫸木木聚糖和0.5–5.0 mg/mL的角豆膠為底物，在pH 4.0、70 ℃條件下測定木聚糖酶活性，在pH 5.0、90 ℃條件下測定甘露聚糖酶活性，反應時間均為5 min，利用雙倒數法作圖并計算得到Km及Vmax的值。

金屬離子及化學試劑對酶活性的影響測定：將5 mmol/L的不同的金屬離子和化學試劑添加到酶促反應體系中，以不添加任何離子和化學試劑作為對照，在酶的最適條件下測定它們對酶活性的影響。

2 結果與分析

2.1 重組載體的構建與融合蛋白的表達與純化

通過PCR將594 bp的木聚糖酶成熟區編碼基因Tlxyn11B和1 131 bp的甘露聚糖酶基因man5A(不含N端CBM區) 進行拼接，獲得1 725 bp的融合基因Tlxyn11B-linker-man5A，融合基因編碼的蛋白理論分子量為62.6 kDa，理論等電點為4.82。融合基因Tlxyn11B-linker-man5A在畢赤酵母GS115中實現了分泌表達，獲得融合蛋白Tlxyn11B-Man5A。其表觀分子量約為70 kDa，較理論分子量稍大 (圖1)，該融合酶有2個可能的N糖基化位點，在畢赤酵母中表達可能發生了糖基化從而造成表觀分子量大于理論分子量。

圖1 融合蛋白Tlxyn11B-Man5A的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of fusion protein Tlxyn11B-Man5A.Lane M:the standard modecule weight;lane 1:concentrated Tlxyn11B-Man5A;lane 2:purified Tlxyn11B-Man5A.

2.2 融合酶的酶學性質

2.2.1 融合酶的最適pH及pH穩定性

在pH 1.0–8.0 范圍內測定甘露聚糖酶和木聚糖酶的最適pH，結果顯示融合酶的木聚糖酶的最適pH (圖2A) 為4.0，在pH 3.0–5.0范圍內能夠維持60%以上的酶活力。融合酶中的甘露聚糖酶的最適pH (圖2B) 為5.0，在pH 3.0–5.5范圍內甘露聚糖酶的相對酶活力維持在50%以上。在pH 1.0–12.0范圍內測定融合酶的pH穩定性，結果顯示木聚糖酶在pH 2.0–9.0時穩定，pH 2.0時剩余酶活仍達90% (圖2C)。甘露聚糖酶 (圖2D)在pH 2.0–9.0范圍內，剩余酶活力能夠維持在60%以上 (圖中Tlxyn11B-W和TlxyB分別代表融合前后的木聚糖醇，Man5A-W和Man5A分別代表融合前后的甘露聚糖醇)。

圖2 融合前后木聚糖酶和甘露聚糖酶的最適pH及pH穩定性Fig.2 Optimum pH and pH stability of xylanase and mannanase before and after fusion.(A) Effect of pH on the activities of xylanase Tlxyn11B-W and Tlxyn11B.(B) Effect of pH on the activities of mannanase Man5A-W and Man5A.(C) pH stabilities of xylanase Tlxyn11B-W and Tlxyn11B.(D) pH stabilities of mannanase Man5A-W and Man5A.

2.2.2 融合酶的最適溫度及溫度穩定性

分別在pH 4.0和pH 5.0條件下測定融合酶的木聚糖酶和甘露聚糖酶在不同溫度 (30–95 ℃)的酶活力，結果顯示 (圖3A–B) 融合酶中木聚糖酶和甘露聚糖酶分別在70 ℃和90 ℃時具有最高酶活力。甘露聚糖酶在80–95 ℃范圍內維持在50%以上酶活力。木聚糖酶在低于70 ℃時酶活隨溫度升高而升高，70 ℃以上酶活急劇下降。在最適pH 4.0的條件下將酶液分別在60 ℃、70 ℃條件下處理不同時間測定木聚糖酶的熱穩定性，結果顯示 (圖3C)，60 ℃處理1 h還剩余48%的酶活力，70 ℃處理2 min還剩60%的酶活力，70 ℃處理5 min還剩23%的酶活力。在最適pH 5.0的條件下將酶液分別在70 ℃、80 ℃條件下處理不同的時間測定甘露聚糖酶的溫度穩定性，結果表明 (圖3D)，70 ℃處理2 min還剩余77.5%的酶活，80 ℃處理2 min還剩余71.26%的酶活。

圖3 融合前后木聚糖酶和甘露聚糖酶的最適溫度及熱穩定性Fig.3 Optimum temperature and thermostability of xylanase and mannanase before and after fusion.(A) Effect of temperature on the activities of xylanase Tlxyn11B-W and Tlxyn11B.(B) Effect of temperature on the activities of mannanase Man5A-W and Man5A.(C)Thermostability of xylanase Tlxyn11B-W and Tlxyn11B.(D) Thermostability of mannanase Man5A-W and Man5A.

2.2.3 融合酶的動力學參數測定

分別在甘露聚糖酶和木聚糖酶的最適條件下以角豆膠和櫸木木聚糖為底物進行測定，經Michaelis-Menten 模型計算出融合酶中甘露聚糖酶和木聚糖酶的動力學參數 (表2)，最終得到融合酶的甘露聚糖酶的Km和Vmax分別為1.7 mg/mL、2 831.6 μmol/(min·mg)，木聚糖酶的Km和Vmax分別為1.2 mg/mL、2 000.0 μmol/ (min·mg)。

表2 木聚糖酶和甘露聚糖酶融合前后的動力學參數Table 2 Kinetic parameters before and after fusion of xylanase and mannanase

2.2.4 金屬離子及化學試劑對酶活性的影響

如表3所示，融合前后金屬離子和化學試劑對酶的活性的影響基本無變化，對于甘露聚糖酶Cr3+、Cu2+、Fe3+、SDS能夠抑制酶活，而其他離子和化學試劑對酶活幾乎沒影響。對于木聚糖酶Pb2+、Cu2+、Fe3+、SDS能夠抑制酶活，其余離子和化學試劑對其無明顯影響。

表3 不同金屬離子和化學試劑對融合前后甘露聚糖酶和木聚糖酶活性的影響Table 3 Effects of different metal ions and chemical reagents on mannanase and xylanase activities before and after fusion

3 討論

研究通過甘露聚糖酶自身的連接區將木聚糖酶和甘露聚糖酶相連，從而實現了融合表達，獲得了具有高活性的木聚糖酶和甘露聚糖酶的雙功能融合蛋白，為半纖維素的降解及飼料和食品中的應用提供了便利?；诘鞍踪|融合來獲得多功能酶的研究不乏報道[30-31]，但融合設計并非都能成功，如涉及纖維素酶-木聚糖酶的研究中，與淀粉酶C末端融合的葡聚糖酶失去活性[32]。融合酶的種類、來源、結構、融合順序、連接肽的長短和種類對融合酶的性質都可能有重要的影響[24,32-33]。多數糖苷水解酶從結構上來看其N端和C端相距較近并發生相互作用，任意一端的變動都可能影響酶的整體結構進而影響酶學性質。本研究中甘露聚糖酶Man5A的CBM區屬于CBM1家族，主要是由β折疊片構成的三明治結構，而木聚糖酶Tlxyn11B從三維結構上來看同樣主要是由β折疊片構成，在結構上與CBM1有一定的相似度，從而保證了酶結構功能的正常，該項工作為融合酶的選擇提供了一定的指導。

甘露聚糖酶Man5A有非常好的熱穩定性[27]，而木聚糖酶Tlxyn11B熱穩定性相對較差。當將Man5A的CBM替換為木聚糖酶Tlxyn11B進行融合時，使木聚糖酶的熱穩定性明顯提高[28]，而甘露聚糖酶熱穩定性有所降低，但優于去掉CBM的Man5A (Man5AΔCBM) 熱穩定性[27]。Wang等報道Man5A在80 ℃ 處理60 min后，仍然保留50%的酶活力，而Man5A-CBM在80 ℃ 處理30 min后完全失活。Tlxyn11B-Man5A的穩定性處于Man5A和Man5A-CBM之間，可見CBM在甘露聚糖酶Man5A熱穩定性的維持中發揮重要的作用，且與CBM的結構相關。木聚糖酶Tlxyn11B熱穩提高的機制尚不明確，推測與連接區對木聚糖酶的保護相關。同時，我們發現木聚糖酶Tlxyn11B作用的pH范圍在融合表達后也得到了拓寬。而融合前后木聚糖酶和甘露聚糖酶對不同金屬離子和化學試劑的抗性沒有明顯區別，Cu2+、Fe3+、SDS能夠同時抑制兩種酶的活性，此外Cr3+對甘露聚糖酶，Pb2+對木聚糖酶也有部分抑制作用，說明融合表達并不影響兩種酶對金屬離子和化學試劑的抗性。動力學參數方面，融合后甘露聚糖酶和木聚糖酶的Km值均降低，說明融合后有利于酶與底物的結合，從融合后Kcat/Km值均增加來看，融合后兩種酶的催化效率也都有提高。這類通過蛋白質融合改變酶的活力和熱穩定性的研究，目前大多認為是連接肽的種類和長短影響了融合后蛋白單個結構域及各結構域間相互作用[23,34]。

綜上，通過不同活性酶編碼基因的融合表達，我們獲得了一個同時具有高的甘露聚糖酶和木聚糖酶的雙功能蛋白，并提高了木聚糖酶的熱穩定性。這為后續的應用提供了便利、節約了成本，也為酶性能的改良提供了思路。