葛根護肝膠囊對酒精性肝損傷小鼠保護作用的研究

吉林吉春制藥股份有限公司技術研發中心 吉林四平 136504

1 材料與方法

1.1 受試樣品

葛根護肝膠囊，由吉林某保健食品公司生產，以葛根450g、黃芪300g、枳椇子200g、五味子150g、蜂膠粉50g、綠茶提取物50g，經提取、混合后，制成1000 粒膠囊，每粒重0.4g。推薦劑量為成人（體重以60kg 計）每次3 粒，每日2 次。

1.2 實驗動物和實驗環境

SPF 級ICR 種雄性小鼠50 只，體重18g～22g，于屏障動物房內飼養并開展實驗，溫度22°C～23°C，濕度54%～58%。

1.3 劑量選擇與受試物給予方式

按照人體推薦劑量的5、10、30 倍計算，預設置葛根護肝膠囊內容物低中高三個劑量組，分別為0.20、0.40、1.20g/kg.BW，同時設置空白對照組和單純肝損傷模型對照組，灌胃給藥；低中高劑量組的受試物溶液配制方法為：分別取葛根護肝膠囊內容物2.00g、4.00g、12.00g 加1%羧甲基纖維素至200ml。

1.4 主要儀器與試劑

BECKMAN COULTER AU680 全自動生化分析儀、722 可見光分光光度計、加樣器、離心機、恒溫水浴鍋、組織勻漿器、混懸器、載玻片、蓋玻片、尼康YS100 顯微鏡；丙二醛（MDA）測試盒、還原型谷胱甘肽（GSH）測試盒，甘油三酯（TG）測試盒、蘇丹Ⅲ染色劑。

1.5 實驗方法

受試物低中高劑量組按照上述劑量灌胃受試物，空白對照組、模型對照組給予等體積1%羧甲基纖維素溶液，灌胃體積均為0.2ml/10g·bw，每日1 次，連續30 天。第30 天灌胃結束后，各劑量組和模型對照組灌胃給予50%乙醇（12ml/kg.bw），造成急性酒精性肝損傷模型，空白對照組灌胃給予1%羧甲基纖維素，禁食16 小時后，處死動物，進行相關指標檢測及病理組織學檢查。

取部分肝臟組織，生理鹽水制成10%的肝勻漿，分別檢測GSH、MDA 和TG 的含量。

從肝左葉中部選取合適的橫切面進行取材，冰凍切片，以蘇丹Ⅲ染色。鏡檢時從肝臟的一端視野開始記錄細胞的病理變化，用40 倍物鏡連續觀察整個組織切片，觀察脂滴在肝臟的分布、范圍和面積，并按以下標準進行評分：0分，肝細胞內脂滴散在、稀少；1分，含脂滴的肝細胞不超過1/4；2 分，含脂滴的肝細胞不超過1/2；3 分，含脂滴的肝細胞不超過3/4；4 分，肝組織幾乎被脂滴代替。

1.6 結果判定

肝組織中丙二醛（MDA）、還原型谷胱甘肽（GSH）、甘油三酯（TG）三項檢測指標結果陽性，或肝組織中丙二醛（MDA）、還原型谷胱甘肽（GSH）、甘油三酯（TG）三項指標中任兩項指標陽性和病理檢測結果陽性，可判定受試樣品對化學性肝損傷具有輔助保護功能。

2 結果

2.1 葛根護肝膠囊對肝組織中MDA、GSH，TG 含量的影響

由表1 可見，與空白組相比，模型對照組的MDA、TG 含量均升高，GSH 含量降低，差異均有顯著性（P＜0.01）。而與模型組相比，高劑量組的TG 和MDA 含量明顯降低，GSH 含量明顯升高，差異有顯著性（P＜0.05）。

表1：葛根護肝膠囊內容物對小鼠肝勻漿中MDA、GSH、TG 含量的影響

2.2 葛根護肝膠囊對肝組織病理的影響

由表2 可見，與空白組相比，模型對照組肝臟脂肪變性的程度升高，差異有顯著性（P＜0.05）；與模型對照組相比，高劑量組肝臟脂肪變性的程度明顯降低，差異有顯著性（P＜0.05）。

表2：黃芪枳椇子膠囊內容物對小鼠肝臟組織病理學檢查結果

3 討論

谷胱甘肽（GSH）是肝細胞內存在的內源性抗氧化反應物質，具有清除異常自由基的作用，從而使肝細胞免于受到損害。研究表明，GSH 能根據機體的需要，調節細胞內氧化還原反應，且具有解毒功能。長期飲酒者肝細胞內GSH 含量明顯降低，線粒體嚴重受損，氧自由基增多，由于抗氧化物質活性和含量降低，來不及消耗多余的氧自由基，從而加劇氧化應激反應。肝組織中GSH含量和活性，能一定程度上反映肝臟健康情況。丙二醛（MDA）是自由基脂質過氧化反應的最終產物之一。肝臟MDA 的含量可以反映肝臟脂質過氧化的程度，也是常用的了解肝臟健康的指標。本研究結果顯示，與空白組相比，模型組小鼠肝臟組織中GSH 活性和含量明顯降低，MDA 明顯升高。實驗結果與前期查詢到的文獻論述相符，說明本次實驗造模成功。與模型組相比，葛根護肝膠囊高劑量組能顯著提高小鼠肝組織GSH 含量和活性、顯著降低肝組織中MDA 含量。說明葛根護肝膠囊可以緩解氧化應激對酒精性肝損傷小鼠肝臟的損傷。

甘油三脂(TG)是存在于血液和肝臟中重要的內源性脂類物質，其合成、分解、代謝都依賴于肝臟，分解產物能提供維持生理運轉的能量，研究表明，攝入大量酒精可導致TG 的代謝途徑遭到破壞，使得過多的TG 堆積于肝臟中，造成脂質代謝異常，引起肝臟中TG 含量的顯著上升。本研究結果顯示，模型組肝組織中TG 含量與空白組相比顯著升高，說明乙醇灌胃對肝臟造成了損害，導致TG 在肝臟內沉積，符合文獻報道，造模成功。與模型組比較，葛根護肝膠囊高劑量組肝組織中TG 含量顯著降低，表明本品對酒精性肝損傷小鼠肝臟具有保護作用。其原因可能是該方減少肝臟攝取游離脂肪酸、促進線粒體氧化、加速TG 轉運效率等。

生理狀態下，機體內的脂質代謝保持一種穩定的平衡狀態，當脂質代謝的重要器官受到損害時，平衡狀態被打破，就會出現脂質異常代謝。當長期大劑量飲酒時，肝臟不斷受到酒精的刺激，可造成肝細胞線粒體功能受損，肝組織內脂肪大量堆積，最終引起肝脂肪變性。本實驗采用50%乙醇灌胃，染色結果顯示模型組出現脂肪沉積，表明成功建立模型。與模型組相比，葛根護肝膠囊高劑量組小鼠肝組織脂肪變性評分降低，葛根護肝膠囊具有減輕酒精性肝損傷脂肪變程度的作用。

本配方是以葛根、黃芪、枳椇子、五味子、蜂膠、綠茶提取物為原料制成的保健食品，中醫理論認為，酒為濕邪，配方中，枳椇子、葛根為中醫常用的解酒毒藥物，枳椇子利尿，葛根升陽；黃芪則兼具升陽利尿的作用，且能補氣扶正，緩解了酒邪對人體正氣的損耗，三原料聯合使用，在解酒毒的同時，兼顧了濕易困脾的特點，升發脾之清氣，促使濕熱下行，兼可扶正，酒毒可解，此外，酒為陽邪，飲酒過量傷陰津，五味子在配方中的作用有二：1、五味子的生津作用，可有效緩解酒對陰津的傷耗，2、五味子的收斂作用，防止因黃芪、枳椇子利水太過對機體津液的傷耗，配伍增強功效的同時，在配方中對其他原料也起到制衡的作用。葛根、黃芪、枳椇子、五味子配伍使用，符合中醫對酒邪的處理原則即“從脾論治”為主，扶正、解毒、化濕為輔。

現代研究表明，蜂膠可通過增強肝組織清除氧自由基的能力，降低肝組織脂質過氧化反應而對慢性酒精性肝損傷產生保護作用，綠茶對CYP450 酶家族中誘導酒精性肝損傷發生的酶CYP2E1具有明顯抑制作用，其主要成分多酚類物質具有較好的清除自由基的作用，故能緩解酒精性肝損傷?？梢妰稍蠈凭愿螕p傷均具有保護作用，作用相對緩和，并富含多糖、多酚等對人體有益的營養物質，適用于保健食品，可長期服用。

本品組方前進行了大量的文獻查閱，組方綜合考慮傳統中醫和現代科學對酒精性肝損傷的認識，并結合保健食品注冊申報相關法律法規，最終確定了本品配方和用量，組方無配伍禁忌，前期配方論證工作和本實驗研究結果均支持葛根護肝膠囊各原料配伍及其日用量具有輔助保護化學性肝損傷的作用。