基于網絡藥理學與分子對接探究甘草-澤瀉藥對治療室性早搏的分子機制

岑崇民 唐玉玲

摘要：目的：探討甘草-澤瀉藥對治療室性早搏（premature ventricular contractions，PVCs）的潛在分子機制。方法：運用中藥系統藥理學分析平臺TCMSP數據庫、PubMed數據庫、UniProt數據庫篩選出甘草-澤瀉藥對的化合物成分以及靶點，利用GeneCards、OMIM、PharmGKB、DrugBank以及TTD數據庫檢索PVCs相關靶點，并運用Venny 2.1.0在線獲取成分-疾病的交集靶點;采用STRING數據庫構建成分-疾病交集靶點基因的蛋白質相互作用關系（PPI）網絡并導入Cytoscape3.8.2軟件進行拓撲學分析，篩選出每個條件大于中位值的靶點，即核心靶點;使用R語言Bioconductor程序包對成分-疾病共有靶點進行GO富集分析和KEGG通路富集分析。以核心靶點所編碼蛋白為受體、主要有效成分為配體，采用AutoDock Vina 1.1.2軟件進行分子對接。結果：共挖掘出甘草-澤瀉藥對相關靶點206個、PVCs相關靶點3997個，兩者共有靶點159個，其中核心靶點共4個。最終富集到GO功能條目2491個，KEGG信號通路186條。將受體與配體進行分子對接，任意兩者結合能均低于-7 kcal/mol，有較強的結合活性。結論：甘草-澤瀉藥對治療PVCs可能是槲皮素、山柰酚、甘草酮A、柚皮素、甲素通過調控TP53、JUN、MAPK1、MAPK3等核心靶點，作用于IL-17信號通路、TNF信號通路等而實現的。

關鍵詞： ?甘草-澤瀉藥對;室性早搏;網絡藥理學;分子對接;分子機制

【中圖分類號】R28 ? ? ? ? ? ? 【文獻標識碼】A ? ? ? ? ? ? 【文章編號】2107-2306（2021）09--05

0 引言

室性早搏又稱為室性前期收縮，是一種最常見的心律失常，是指房室束分叉以下部位過早發生提前心室肌除極的心搏。正常人也會引起室性早搏，大部分患者在生活中沒有任何臨床表現，部分患者可表現出心慌、胸悶、心跳停搏。室性早搏也可以見于一些藥物中毒、過量飲酒、電解質紊亂的患者。目前傳統的治療方法主要有導管消融治療以及西醫藥物治療，西醫藥物治療包括β受體阻滯劑、胺碘酮等。室性早搏在祖國醫學中屬“心悸”范疇，中醫治療以補氣養血、滋陰溫陽、祛痰行瘀、清火為基本原則。但中醫藥治療室性早搏的相關分子機制并未完全闡明，這制約中醫藥理論向臨床實踐的轉化。

生物信息分析是從大量的基因數據庫中篩選出與疾病發生的相關基因。兩者的相結合，解析藥物與治療對象之間的分子關聯規律、整體作用機制的闡釋。本文章主要是通過此方法探索甘草-澤瀉藥對治療室性早搏的分子機制，促使人們發現更多中醫藥對治療PVCs的新思路。

1 資料和方法

1.1 ?中藥有效成分篩選及靶點篩選

通過TCMSP數據庫分別提取甘草、澤瀉所含化合物成分。以口服生物利用度（OB）≧30%并且類藥性（DL）≧0.18為篩選條件，選出甘草、澤瀉藥效成分以及相對應靶點，并采用SwissTargetPrediction數據庫對藥物靶點進步補充。根據Uniprot數據庫對靶點進行基因名轉化以及標準化，刪除無基因名的靶點，將兩者化合物成分以及靶點分別進行合并、去重，將結果導入Cytoscape3.8.2軟件中進行數據分析，獲得核心化合物成分。

1.2 ?疾病靶點篩選

基于Genecards、Drugbank、Omin、TTD以及Pharmgkb數據庫，物種設定為“Homo sapiens”，以“premature ventricular contractions”為關鍵詞檢索相關疾病靶點，合并、去重后獲得疾病靶點。

1.3 ?獲取藥物-疾病交集靶點

利用在線網站Venny2.1.0繪制藥物-疾病靶點韋恩圖，其交集靶點即為藥物對治療PVCs潛在作用靶點。

1.4 ?構建蛋白相互作用PPI網絡圖

將交集靶點導入string 11.5數據庫中進行蛋白相互作用分析，設置最高置信度為0.9，隱藏網絡中游離節點，利用Cytoscape3.8.2軟件中CytoNCA工具篩選出核心作用靶點。

1.5 ?GO和KEGG富集分析

基于R語言中Bioconductor程序包對“1.3”獲得的交集靶點進行基因本體功能分析（GO）、京都基因與基因組百科全書富集分析（KEGG），并繪制柱形圖、氣泡圖、通路圖。

1.6 ?分子對接

以“1.1”獲得的核心化合物成分為配體，核心靶點編碼蛋白為受體進行分子對接。從PubChem數據庫下載核心化合物的2D結構，并對其進行優化。采用AutoDockTools 1.5.6軟件將“.mol2”格式轉換為“.pdbqt”格式。從PDB數據庫中下載核心靶點編碼蛋白的3D結構，并利用PyMol軟件去除受體蛋白結構中的配體分子以及水分子。使用AutoDockTools 1.5.6對蛋白結構進行預處理。采用AutoDock Vina 1.1.2軟件分別對受體和配體分別進行對接，以最低結合能作為評判分子對接結果標準。兩者結合能越低，表明結合力越強，配體與受體能夠自發結合，且其值越小表示兩者的結合活性越高。利用在線分析網站PLIP對結果進行蛋白配體非共價相互作用分析，最后使用PyMOL 2.3軟件進行部分對接結果可視化展示。

2 結果

2.1 ?中藥有效成分篩選及靶點處理

通過TCMSP數據庫檢索共收集到甘草-澤瀉藥對有效成分290個，對應靶點基因 1770個，通過Uniprot數據庫對把靶點進行基因名標準化，并刪除重復項，得到206個中藥靶點。將“中藥-化合物成分-靶點”導入Cytoscape3.8.2軟件中進行數據分析，以“degree”為篩選標準，篩選出核心化合物成分（圖1）。

2.2 ?疾病靶點處理

以“premature ventricular contractions”為檢索關鍵詞，物種條件設定為“Homo sapiens”，通過Genecards數據庫檢索，獲到3080個靶點基因;通過 Drugbank數據庫檢索，得到4個靶點基因;通過Omin數據庫檢索，獲得59個靶點基因; 通過Pharmgkb數據庫，獲得1519個靶點基因。將所獲得靶點基因進行合并、去重，最終獲得3997個疾病靶點，并利用在線網站Venny2.1.0繪制疾病靶點韋恩圖。（圖2）。

2.3 ?疾病靶點與中藥化合物成分靶點韋恩圖

利用在線網站Venny 2.1.0將“1.1”“1.2”所獲得數據進行映射，獲得中藥-疾病共同靶點159個，并繪制中藥-疾病韋恩圖（圖3）。

2.4 ?共同靶點的蛋白質相互作用關系網絡（PPI）的構建及拓撲學分析

將“2.3”獲得的共同靶點基因導入string 11.5數據庫進行分析，物種設定為“homo sapiens”，最高置信度設為0.9，隱藏網絡中游離節點，構建蛋白質相互作用網絡關系圖（圖4），該圖共有158個節點，575條邊，平均節點7.28。將構建結果導入Cytoscape 3.8.2軟件中進行數據分析，利用CytoNCA工具，將“Betweenness”、“Closeness”、“Degree”、“Eigenvector”、“LAC”、“Network”設為過濾條件，過濾3次，每次篩選出每個條件大于中位值的基因。最終TP53、MAPK3、JUN、MAPK1各個篩選條件均大于中位值，即為核心靶點基因（圖5）。

2.5 ? GO富集分析及KEGG通路富集分析

基于R語言中Bioconductor程序包對中藥-疾病共同靶點基因進行GO、KEGG富集分析。GO分析包含分子功能（MF）、生物過程（BP）、細胞成分（CC）等功能，最終富集到GO功能條目2491個。其中，生物過程（Biological Process，BP）2212個，包含對藥物的反應、對脂多糖的反應、對細菌源分子的反應、對金屬離子的反應、對細胞外刺激的反應等;分子功能（Molecular Function，MF）197個，包含DNA結合轉錄因子結合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉錄因子結合、泛素樣蛋白連接酶結合、絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、內肽酶活性等;細胞成分（Cellular Component，CC）82個，包含膜筏、膜微區、質膜外側、神經元胞體質、膜筏等。將富集結果以P<0.05為篩選條件，按校正后P值依次從小到大排序，選取排名前10個條目進行繪制GO富集分析柱形圖（圖6）、氣泡圖（圖7）。

富集到KEGG信號通路186條，包含IL-17信號通路、TNF信號通路等。將富集結果以P<0.05為篩選條件，按校正后P值依次從小到大排序，選取排名前10個條目進行繪制KEGG富集分析柱形圖（圖8）、氣泡圖（圖9），并以“IL-17 signaling pathway”繪制通路圖（圖10）。

2.6 ?分子對接驗證結果

使用AutoDock Vina 1.1.2軟件將“2.4”中獲得的核心靶點基因編碼蛋白（TP53（1YC5）、MAPK3（4QTB）、JUN（5T01）、MAPK1（2Y9Q））與“2.1”中的得到的核心有效成分槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、甘草酮A（licochalcone a）、柚皮素（naringenin）、甲素（formononetin）分別進行對接，結果顯示任意兩者對接結合能均小于-7.0 kcal/mol（圖11）。其中，MAPK3與所有配體分子對接，結合能均小于-9.0 kcal/mol，表明所有配體分子對MAPK3具有較強結合力，結合最穩定。PLIP （Protein-Ligand Interaction Profiler） 是蛋白配體非共價相互作用的分析工具，利用在線網站PLIP對蛋白配體進行分析，通過PyMol對部分結果進行數據可視化（圖12-15）。圖中formononetin與MAPK1中的氨基酸殘基ASP106、MET108形成氫鍵，與氨基酸殘基ILE31、VAL39、ALA52、LYS54、LEU156形成疏水作用;formononetin與MAPK3中的氨基酸殘基ILE48、ALA69、LYS71形成疏水作用，與氨基酸殘基MET125、ASP184形成氫鍵作用。Kaempferol與MAPK3中的氨基酸殘基ILE48、LEU173、LYS71形成疏水作用，與氨基酸殘基MET125、ASP184、LYS71、SER170形成氫鍵作用。naringenin與MAPK3中的氨基酸殘基ILE48、LEU173、LYS71、ALA69形成疏水作用，與氨基酸殘基MET125、ASP184、LYS71形成氫鍵作用。Formononetin、Kaempferol、naringenin均與MAPK3中氨基酸殘基TYR53形成π堆積作用。以上結果間接證明，甘草-澤瀉藥對主要有效成分對核心靶點起到調控作用。

3 討論

室性早搏在中醫學中屬“心悸”范疇，源由年老體虛、感受外邪、七情所傷、藥食不當等因素引起，治療當以補氣養血、滋陰溫陽、祛痰行瘀、清火為原則，辨證施治。古籍中有關甘草、澤瀉治療實性早搏的記載由來已久。陶弘景《本經別錄》中有甘草具有“通經絡，利氣血”之能。臨床上也有運用中藥甘草、澤瀉治療室性早搏案例，均取得比較好的臨床療效。

本研究篩選出甘草-澤瀉有效化合物成分290個，對應靶點1770個，根據Cytoscape3.8.2軟件分析可知槲皮素、山柰酚、甘草酮A、柚皮素、甲素可能為核心化合物靶點。研究表明，槲皮素是一種有多種活性的多酚類黃酮物質，具有抗心律失常、抗氧化、抗血小板聚集、抗病毒等作用，被廣泛應用于醫藥領域[1]。動物實驗得出槲皮素具有對大鼠以及豚鼠心律失常模型具有縮短持續時間以及改善心肌細胞氧化代謝的作用，其作用機制可能與降低心肌細胞自律性相關[2]。徐長慶等[3]研究發現槲皮素能通過延長心肌細胞不應期、保護膜上的Na+-K+-ATP酶、阻斷外鈣內流等起到抗心律失常作用，國外也有報道[4]通過構建大鼠缺血后心臟再灌注模型，進一步證實槲皮素具有抑制心室異位搏動作用。山柰酚與槲皮素作用類似，具有抗氧化、抗炎、保護心肌細胞、抗病毒等，有研究[5]發現山柰酚抗氧化、抗炎作用可能通過NF-κB和PI3K/AKT/GSK3B通路實現，而其心肌細胞保護作用主要是通過對Akt/GSK-3β信號通路調節發揮作用[6]。甘草酮A是甘草中的主要酚類成分具有抗炎、抗氧化和抗癌等活性[7]，有研究證明[8]甘草酮A可以降低核因子蛋白NF-κB信號傳導和前列腺素分泌，從而達到降低炎癥反應效果。柚皮素是一種二氫黃酮類化合物，廣泛存在于水果中?，F代研究證明[9]柚皮素具也被證實具有抗保護心肌細胞、心律失常、降血脂、抗氧化及抗動脈粥樣硬化等作用，柚皮素主要通過激活c GMP-PKGIα通路抑制氧化應激從而起到保護心臟作用[10]。楊穎等[11]通過對高脂飼養大鼠研究發現，柚皮素不僅可以降低大鼠的TG水平，還可降低主動脈粥樣硬化斑塊風險。但目前尚無柚皮素與心律失常相關的基礎研究，值得在后續深入探索。甲素是一種7-羥基異黃酮類化合物，有研究通過對甲素與豚鼠心肌細胞研究，發現甲素抗心律失常作用機制可能與對鈣離子、鈉離子[12]的阻斷作用相關，同時，甲素可逆轉血清中血脂水平[13]，減少內皮細胞損傷，降低動脈粥樣硬化風險。分子對接結果顯示，槲皮素、山柰酚、甘草酮A、柚皮素、甲素可能通過調控TP53、MAPK3、JUN、MAPK1等對PVCs起到治療作用，可見甘草-澤瀉藥對活性成分多具有抗心律失常、保護心肌細胞、抗氧化、抗炎等功能。

根據GO富集分析結果得出甘草-澤瀉藥對治療PCVs主要涉及生物過程包含對藥物、脂多糖、細菌源分子、金屬離子、細胞外刺激的反應。代麗[14]認為不同的心律失常電生理機制可能與細胞對藥物反應有關，取決于心肌細胞對藥物的反應。內源性脂多糖是心律失常的常見的化學調節因子。動物實驗[15]也進一步證明小劑量脂多糖能發揮心肌細胞保護作用，減少心肌細胞再灌注損傷。細菌感染是導致PVCs因素之一。王剛等[16]研究發現肺部感染后，部分患者出現心律失常，其中以PVCs為主，經常規抗心律失常無效果，予調整抗生素后好轉。研究[17]發現金屬離子可通過干預HERD通道，從而導致心律失常的產生。相關研究[18]通過天然藥物?；撬崤c金屬鎂離子的結合物與對烏頭堿誘發大鼠心律失常發現，?；撬徭V實驗組比對照組可推遲大鼠心律失常出現時間。心肌炎、組織缺血、缺氧、物理因素、化學因素等外界刺激均可導致心律失常的產生，其中以PVCs為主。KEGG通路富集分析結果顯示甘草-澤瀉藥對治療PVCs主要涉及IL-17信號通路、TNF信號通路等。有研究[19]指出TNF信號通路在室性心律失常疾病中起到重要作用，動物研究[20]表明大鼠急性梗死后TNF通路表達與室性心律失常相關，產生機制可能與細胞內鈣增加有關。有研究證實[21]TNF信號通路所介導的炎癥反應使心肌膜電位產生變化，從而誘發心律失常。IL-17是種強效促炎因子，能介導多種炎癥因子的分泌，與室性心律失常發生密切相關。動物實驗證明[22]，給正常家兔注射IL-17后對誘導心肌纖維化和心室重塑起到關鍵作用，可增加室性心律失常的風險。郝瑞等[23]通過動物實驗證明大鼠心律失常發生的概率與體內IL-17水平相關。同時， IL-17信號通道與TNF信號通道具有協同作用，進一步增加室性心律失常風險，其發生機制可能與離子通道電流的變化有關[24]。

分子對接結果顯示，核心化合物成分與核心疾病靶點所編碼的蛋白結合能均小于-7kcal/mol，二者結合穩定，可形成氫鍵、疏水作用以及π堆積作用。說明核心化合物能與核心靶點所編碼的蛋白結合有效。

綜上所述，甘草-澤瀉藥對治療PVCs具有“多成分、多靶點、多通路”特點。其槲皮素、山柰酚、甘草酮A、柚皮素、甲素可能通過調控TP53、MAPK3、JUN、MAPK1等靶點干預IL-17信號通路、TNF信號通路等，從而對PVCs起到治療作用。本研究為甘草-澤瀉藥對的臨床應用提供一定的理論基礎，但網絡藥理學以及分子對接技術存在一定局限性，尚有待進一步通過相關實驗加以驗證。

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作者簡介：姓名：岑崇民，出生年：（1995-），性別：男，民族：壯族，籍貫：廣西百色，單位全稱：廣西中醫藥大學第一附屬醫院，職稱：住院醫師，學位：學士學位，研究方向：老年病防治研究