布魯氏菌OMP10介導的小鼠骨髓源樹突狀細胞活化及其對小鼠T細胞增殖影響的研究

徐朕宇，王月麗，易繼海，童志霞，鄧肖玉，楊寧寧，徐明國，王 勇，孟 闖，苗玉和，陳創夫

（1.石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832000；2.綿羊健康養殖與人獸共患病防控協同創新中心，新疆 石河子 832000；3.江蘇省人獸共患病學重點實驗室，江蘇 揚州 225009；4.福建省圣維生物科技有限公司，福建 南平 350000）

布魯氏菌?。˙rucellosis）是由布魯氏菌（Brucella）感染引起的嚴重人獸共患病[1]。我國在90 年代中期以來該病發病率呈現連續增長態勢，尤其我國主要牧區該病疫情嚴峻，據統計，新疆地區約有80 縣/市和13 個兵團師局有不同程度的布魯氏菌病流行，部分羊場布魯氏菌病個體陽性率達40%以上[2-3]，防控任務艱巨。接種疫苗依然是預防布魯氏菌病的重要手段，然而目前的商用疫苗均存在不同程度的缺陷，如安全性差、有效性低、無法區別疫苗免疫和自然感染等[4]，因此開發布魯氏菌新型疫苗迫在眉睫，而新型疫苗研制的基礎需要了解病原微生物感染與宿主免疫應答的機制。

布魯氏菌作為革蘭氏陰性兼性胞內致病菌，其能夠利用宿主的先天免疫系統減少對模式識別受體（PRR）的刺激和減輕宿主炎性反應[5]。布魯氏菌細胞壁由外膜蛋白（Outer membraneproteins，OMP）與外膜緊密結合的肽聚糖層（Peptidoglycan，PG）組成[6]，OMP在菌體表面發揮著重要的免疫作用。其中OMP10 是布魯氏菌重要的外膜脂蛋白，具有較強的免疫原性[7]，有研究發現OMP10 基因缺失的流產布魯氏菌突變株在小鼠體內的毒力顯著減弱，且相較于野生株，該缺失株更易被清除[8]。Zwerdling 等研究發現布魯氏菌通過OMP 影響樹突狀細胞（DC）的活化和抗原遞呈效率[9]。未成熟的DC 具有較強的內吞作用，而成熟DC 內吞作用則會減弱[10]，相關的成熟表面分子（CD40、CD80、CD86、MHC-I、MHC-II 類分子）的表達顯著上調[11]，相關的炎性細胞因子（IL-12 和IFN-γ 等）大量分泌[12]。且成熟的DC 具有激活T 淋巴細胞增殖的能力。布魯氏菌侵入巨噬細胞后形成“布氏小體”，并與內質網相互作用，融合后產生內質網衍生型布氏小體，細菌在該衍生體中增殖，從而逃避宿主細胞的免疫殺傷作用[13]。但布魯氏菌OMP10蛋白是否能夠介導DC 活化，從而影響T 淋巴細胞增殖的機制，目前尚不清楚。因此，本研究體外分離培養BMDC，利用布魯氏菌OMP10 孵育BMDC，探究魯氏菌外膜蛋白OMP10 對小鼠骨髓源DC 活化的影響，及其在小鼠T 淋巴細胞增殖中的作用，為闡述布魯氏菌感染與宿主免疫機制奠定實驗基礎，為布魯氏菌新型亞單位疫苗研發提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料pET-30a-OMP10/E. coli原核重組表達菌[14]，為本實驗室前期構建并保存。雌性6周齡～8 周齡昆明小鼠，6 周齡～8 周齡雌性BALB/C 小鼠均購自新疆醫科大學動物實驗中心。胎牛血清FBS、RPMI-1640 細胞培養液、100×青霉素/鏈霉素雙抗溶液購自美國Gibco 公司；小鼠粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）、小鼠白介素4（IL-4）購自美國peprotech 公司；細胞用可溶性兩性霉素B 購自美國Amresco公司；；10×紅細胞裂解液購自美國BD公司；PE-anti-mouse CD11c、PE-anti-mouse CD80、PE-anti-mouse CD86 和PE-anti-mouse CD40 均 購 自Biolegend 公司；臺盼藍及MTT 細胞增殖及毒性檢測試劑盒、細胞因子檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；小鼠淋巴細胞分離試劑盒購自天津灝洋生物公司。

1.2 布魯氏菌重組OMP10 蛋白（rOMP10）的表達、純化及鑒定將重組菌pET-30a-OMP10/E. coli于含氨卞青霉素（1∶1 000）的LB 液體培養基中37 ℃培養至OD600nm值為0.6～0.8時，加入終濃度為1 mmol/L 的IPTG 誘導約6 h 后取1 mL 菌液，12 000 r/min 離心1 min，取沉淀加入80 μL 去離子水和20 μL 5×SDS Loading Buffer，混勻，煮沸10 min 后經SDS-PAGE 檢測布魯氏菌rOMP10 的表達及表達形式。進一步采用His-tag Ni 柱純化rOMP10，利用BCA 試劑盒測定純化蛋白濃度，采用ToxinEraserTM內毒素去除試劑盒去除目的蛋白的內毒素后備用。

1.3 小鼠骨髓源性樹突狀細胞（BMDC）的制備和鑒定取5 只6 周齡～8 周齡昆明小鼠，參考文獻[15,16]分離小鼠骨髓源樹突狀細胞。無菌取小鼠股骨和脛骨細胞置于RPMI-1640 完全培養基（含滅活的10%FBS，10 ng/mL GM-CSF 和10 ng/mL IL-4）中，采用GM-CSF 和IL-4 刺激骨髓原代細胞分化為未成熟的DC，每天觀察細胞形態，培養至第8 d 時通過顯微鏡對細胞形態鑒定后收集BMDC細胞，用PBS調整細胞濃度為1×106個/mL，分別加入1 μL PE-anti-mouse CD11c、PE-anti-mouse CD80、PE-anti-mouse CD86、PE-anti-mouse CD40，及其相應的同型抗體，4 ℃孵育20 min，利用流式細胞儀檢測細胞表型（CD11、CD40、CD80、CD86）。

1.4 流式細胞術檢測布魯氏菌rOMP10 對BMDC 表型的影響本實驗將1.3 中濃度1×106個/mL 的BMDC分為布魯氏菌rOMP10 組、PBS 陰性對照組。布魯氏菌rOMP10 組加入終濃度為50 μg/mL 純化的rOMP10，PBS 陰性對照組加入相同體積的PBS，37 ℃，5% CO2孵育24 h 后，參照1.3 方法，利用流式細胞儀檢測各組BMDC 細胞表型（CD40、CD80、CD86）的變化。

1.5 ELISA 檢測布魯氏菌rOMP10 對BMDC 細胞因子表達的影響收集1.4 中孵育24 h 后的兩組BM?DC，1 500 r/min、4 ℃離心5 min 后吸取上清液，采用細胞因子ELISA 檢測試劑盒檢測BMDC 細胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-12、IL-10 和IL-4 的表達水平。

1.6 qRT-PCR 檢測布魯氏菌rOMP10 對BMDC Toll 樣受體（TLR）及MHC-I、 MHC-II 類分子mRNA 轉錄水平的影響將1.4 中兩組細胞孵育48 h后，1 500 r/min、4 ℃離心5 min 收集細胞，采用TRIzol 法分別提取各組BMDC RNA 并測定其濃度，采用HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒反轉錄為cDNA，分別以其為模板，以GADPH 為內參基因，采用表1中相應引物，通過熒光定量PCR 檢測BMDC TLR（TLR2、TLR4、TLR9）和MHC-I、MHC-II 類分子mRNA 的轉錄水平，采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析布魯氏菌rOMP10 對BMDC TLR 和MHC 類分子的影響。反應條件：95 ℃30 s；95 ℃5 s、60 ℃10 s、72 ℃15 s，40個循環。在同樣的條件下試驗重復3次。

表1 引物和序列Table 1 Primers and sequences

1.7 MTT 法檢測rOMP10 對小鼠脾臟T 淋巴細胞增殖的影響收集1.6 中孵育48 h 后的兩組BMDC，1 500 r/min、4 ℃離心5 min 收集細胞，分別加入絲裂霉素C 終濃度為25 μg/mL 的RPMI-1640 培養液重懸細胞，以每孔100 μL 鋪于96 孔細胞培養板中作為刺激細胞。無菌條件下取小鼠脾臟，利用小鼠脾淋巴細胞分離試劑盒分離小鼠脾淋巴細胞，調節淋巴細胞終濃度分別為5.0×106個/孔、5.0×106個/孔、5.0×106個/孔，以每孔100 μL 鋪于96 孔細胞培養板，作為反應細胞。刺激細胞與反應細胞分別以1∶25、1∶50、1∶100 比例混合，每個比例設3 個重復孔，37 ℃、5% CO2孵育72 h 后檢測各組細胞OD570nm值，通過MTT 試劑盒檢測rOMP10 孵育后小鼠脾T 淋巴細胞的增殖情況，計算刺激指數（SI）=試驗孔OD570nm值/對照組OD570nm值。

2 結 果

2.1 布魯氏菌rOMP10 純化與鑒定將重組表達菌株經LB 液體培養基培養，經IPTG 誘導后進行SDSPAGE分析，結果顯示，在包涵體泳道10 ku附近出現目的條帶（圖1），與預期相符，表明布魯氏菌rOMP10 以包涵體形式表達。經純化后結果顯示純化效果較好，蛋白濃度達1.93 mg/mL。

圖1 SDS-PAGE檢測布魯氏菌rOMP10的表達及純化結果Fig.1 Expression and purification of Brucella rOMP10 detected by SDS-PAGE

2.2 小鼠BMDC 的形態學分析與表型鑒定結果經含GM-CSF 和IL-4 的RPMI-1640 刺激骨髓原代細胞培養后，于倒置顯微鏡觀察，可見誘導第1 d細胞貼壁生長（圖2A），誘導第3 d 出現少量細胞集落，輕輕搖晃培養板，部分細胞脫落，成半懸浮狀態（圖2B）；誘導第6 d 細胞集落增加，并疏松粘附于細胞上，此時為未成熟的BMDC 細胞（圖2C）；誘導第8 d 大部分細胞成懸浮狀態，細胞表面有明顯的樹突狀凸起，呈現明顯的DC 形態（圖2D），表明此時為成熟的BMDC。

圖2 培養不同時間點小鼠BMDC的形態特征Fig.2 Morphological characteristics of mouse BMDC at different time points under inverted microscope

采用流式細胞術對未成熟的BMDC 細胞表面CD11、CD40、CD80、CD86 進行鑒定，結果顯示，分離細胞中含有94.6%的CD11c+細胞、表達較低水平的CD40、CD80、CD86 細胞表面共刺激分子，與典型的未成熟BMDC 細胞表型特征一致（圖3），表明該細胞可用于后續試驗。

圖3 流式細胞術鑒定未成熟小鼠BMDC的表型Fig.3 Flow cytometry to identify the cell phenotype of mouse BMDC

2.3 布魯氏菌rOMP10 對小鼠BMDC 表型影響的檢測結果為了分析布魯氏菌rOMP10 對BMDC 表型的影響，采用流式細胞術檢測孵育24 h 的小鼠BMDC成熟度標志分子的表達。結果顯示，與PBS 陰性對照相比，布魯氏菌rOMP10 孵育BMDC 后能夠極顯著上調BMDC 成熟標志分子CD40、CD80、CD86 的表達水平（P＜0.001）（圖4）。表明布魯氏菌rOMP10 可誘導小鼠BMDC 的成熟。

圖4 流式細胞儀檢測rOMP10對BMDC表面標記分子（CD40、CD80、CD86）表達的影響Fig.4 Flow cytometric detection of the effect of rOMP10 incubation on the expression of marker molecules(CD40,CD80,CD86)on the surface of BMDC cells

2.4 布魯氏菌rOMP10 對小鼠BMDC 細胞因子分泌影響的檢測結果采用ELISA 檢測rOMP10 孵育24 h后BMDC 中TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-12、IL-10 和IL-4 的表達量，結果顯示，與PBS 陰性對照相比，布魯氏菌rOMP10 孵育BMDC 24 h 后，其誘導的細胞因子IL-6，IL-12，TNF-α 和IFN-γ 的表達量均極顯著增加（P＜0.01），而IL-4 和IL-10 的表達量極顯著減少（P＜0.001）（圖5）。表明布魯氏菌rOMP10 可誘導小鼠BMDC 的活化，促進Th1 型細胞因子的釋放。

圖5 ELISA檢測rOMP10對BMDC細胞因子的表達水平的影響Fig.5 ELISA to detect the effect of rOMP10 incubation on the secretion of BMDC cytokines

2.5 布魯氏菌rOMP10 對小鼠BMDC Toll 樣受體（TLRs）及MHC-I、MHC-II 類分子mRNA 轉錄水平影響的檢測結果采用熒光定量RT-PCR 檢測孵育24 h 后BMDC 的TLR2、TLR4、TLR9 mRNA 轉錄水平和MHC-I 和MHC-II 的轉錄水平，結果顯示，相比于對照組，實驗組細胞中TLR2 mRNA的轉錄水平極顯著升高（P＜0.001），TLR4 mRNA的轉錄水平顯著升高，TLR9 的轉錄水平無顯著變化（P＜0.05）（圖6）；MHC-I 和MHC-II 的轉錄水平均極顯著升高（P＜0.01）（圖7）。表明布魯氏菌rOMP10 可激活BMDC 的TLR2、TLR4 通路，并提高BMDC 的抗原遞呈能力。

圖6 qRT-PCR檢測rOMP10對BMDC中TLR-2、TLR-4、TLR-9 mRNA轉錄水平的影響Fig.6 Effect of rOMP10 incubation on the transcript levels of TLR-2,TLR-4,TLR-9 mRNA in BMDC by qRT-PCR

圖7 qRT-PCR檢測rOMP10對BMDC中MHC-I和MHC-II mRNA轉錄水平的影響Fig.7 Effect of rOMP10 incubation on the transcript levels of MHC-I and MHC-II mRNA in BMDC by qRT-PCR

2.6 布魯氏菌rOMP10 介導BMDC 對T 淋巴細胞增殖影響的檢測結果通過MTT 法檢測rOMP10 預刺激BMDC 與T 淋巴細胞共孵育后T 淋巴細胞的增殖效率，結果顯示，rOMP10 處理組比PBS 組的SI 升高2倍以上，且BMDC 與淋巴細胞的比值（DC∶T）為1∶50時rOMP10 預處理組的T 細胞增殖效率最高（圖8）。表明布魯氏菌rOMP10 介導的BMDC 活化可促進小鼠T 淋巴細胞的增殖。

圖8 MTT法檢測rOMP10對BMDC激活小鼠T淋巴細胞增殖能力的影響Fig.8 Effect of rOMP10 incubation on the ability of BMDC to activate T lymphocytes in mice by MTT

3 討 論

根據分子質量的大小可將布魯氏菌OMP 分為3組，第一組OMP大小為10 ku、18 ku、19 ku；第二組OMP 大小主要為36 ku～38 ku；第三組OMP 的大小為25 ku～27 ku 和31 ku～34 ku[17]。OMP10 作為布魯氏菌第一組OMP，是布魯氏菌在侵襲過程中重要的毒力因子，能夠刺激宿主機體產生免疫反應[18]。研究發現OMP10 的缺失將會降低布魯氏菌在巨噬細胞內的存活時間和布魯氏菌的致病性[19]；且OMP10 能被布魯氏菌疫苗免疫的小鼠血清所識別，具有良好的抗原性[20]。布魯氏菌作為胞內菌，細胞免疫反應依然是抑制細菌胞內生存最有效的手段，而DC 是溝通天然免疫與細胞免疫重要的“橋梁”。徐龍等研究發現布魯氏菌第3 組OMP BP26 可以活化BMDC 和增強BMDC 的抗原遞呈能力[21]，本研究也證實布魯氏菌OMP10 能夠顯著刺激BMDC 的活化，主要相關標志分子CD40、CD80、CD86 表達上調。未成熟的BM?DC 具有較強的吞噬能力，當攝取抗原后將逐步誘導BMDC 的成熟，其抗原遞呈能力也不斷增強。因此，可認為BMDC 吞噬布魯氏菌OMP10 是造成BM?DC 活化的主要原因。

TLR 屬于I 型跨膜模式識別受體，是識別病原菌參與抗原遞呈的主要受體。通過TLR 信號途徑激活DC，使DC 發揮抗原攝取、遞呈等功能，進而促進T 細胞的增值和分化，最終引起機體免疫應答反應。TLR 可以通過多種途徑啟動DC 的活化。研究發現TLR2 和TLR9 是通過髓樣分化因子88（MyD88）信號途徑激活DC，而TLR4 則可通過Toll 樣受體轉導途徑（TRIF）或MyD88 信號途徑激活DC，進而促進炎性細胞因子的分泌[22]。本研究證實rOMP10 能夠激活TLR2、TLR4 mRNA 的轉錄，但細胞信號轉導途徑復雜多樣，TLR 可能通過活化其下游通路，從而間接調控rOMP10 介導的BMDC 活化。此外，TLR9 在rOMP10 孵育后并無明顯變化，可能由于TLR9 僅存在DC 的內質網中，主要識別細菌DNA 中非甲基化的CpG（CpG-containingoligonucleotides）序列[20]。

IL-6，IL-12，TNF-α 和IFN-γ 等細胞因子的釋放，是成熟BMDC 介導宿主細胞免疫反應的關鍵。本實驗證實BMDC 吞噬rOMP10 后促進Th1 型細胞因子（IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ）的大量分泌。TNF-α 是宿主防御病原感染的重要分子[23]；IL-6 是免疫細胞活化并產生擴大炎癥反應的重要介質[24]；IL-12是機體誘導Th1 型免疫應答、介導細胞免疫、促進IFN-γ釋放的關鍵分子[25]；研究表明IFN-γ與IL-12介導的Th1 型反應是調控布魯氏菌胞內存活的重要原因[3]。MHC-I、MHC-II 的高表達是BMDC 發揮抗原遞呈作用的關鍵，布魯氏菌可以抑制IFN 誘導的巨噬細胞MHC-I、MHC-II 分子的表達能力[26-27]。成熟的DC是唯一能夠有效刺激初始T 淋巴細胞增殖的抗原遞呈細胞[9]，外源抗原被DC 吞噬攝取后高表達MHC-I、MHC-II分子，并以復合物的形式將抗原傳遞給T淋巴細胞，誘導T 淋巴細胞增殖、分化，產生細胞免疫應答。 本研究發現rOMP10 能夠顯著刺激BMDC 高表達MHC-I、MHC-II 分子，二者與rOMP10 形成復合物的能力增強。因此，為了進一步探究rOMP10 介導的Th1 型細胞因子釋放及抗原遞呈關鍵分子的高表達是否直接影響T 淋巴細胞的活化，本研究將rOMP10 預處理后的BMDC 與T 淋巴細胞共孵育，結果證實rOMP10 活化BMDC 后有效刺激了T 淋巴細胞增殖。而T 淋巴細胞的活化有利于清除胞內的布魯氏菌，可有效抑制細菌的復制從而降低布病的傳播速度。本研究后續工作還將進一步探究rOMP10 介導的細胞免疫對布魯氏菌胞內生存的影響。

綜上所述，本研究首次證實布魯氏菌rOMP10 能夠介導BMDC 的活化，提高BMDC 抗原遞呈的能力，誘導BMDC Th1 型細胞因子的釋放，激活T 細胞的增殖，該結果為闡述布魯氏菌感染與宿主細胞免疫反應機制奠定了實驗基礎，為開發布魯氏菌新型亞單位疫苗提供了數據支撐。