miR-153通過戊糖磷酸途徑抑制膠質母細胞瘤干細胞增殖研究

鄧一帆

【摘要】目的：研究 miR-153通過戊糖磷酸途徑抑制膠質母細胞瘤干細胞增殖的情況。方法：從惠州市中心人民醫院收集手術切除的膠質母細胞瘤組織樣本，原代培養為膠質母細胞瘤干細胞，分為 miR-153組、空白對照組（無意義寡核苷酸鏈）。分析轉染 miR-153對膠質母細胞瘤干細胞增殖、凋亡的影響。結果：轉染后1.d、5.d， miR-153組和空白對照組的細胞存活率對比差異不顯著（P>0.05）;轉染后2.d、3.d、4.d， miR-153組的細胞存活率低于空白對照組（P<0.05），其中轉染后4.d 出現最小細胞生存率。miR-153組的細胞凋亡率高于空白對照組（P<0.05）。結論：miR-153可以抑制膠質母細胞瘤干細胞增殖，是膠質母細胞瘤治療的靶點，具有臨床應用價值。

【關鍵詞】miR-153;戊糖磷酸途徑;膠質母細胞瘤;干細胞;增殖;凋亡

【中圖分類號】R739.41【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-5249（2022）05-0038-03

膠質瘤是臨床上膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）的最常見的一種類型，也是四級膠質瘤，同時也是膠質瘤中惡性程度最高的一種。其主要發生在40～60歲的中年人群。腦膠質瘤是中樞神經系統中最常見的原發性腫瘤，而其中過半數是高度惡性的GBM，它的總體預后并不十分理想[1]。目前成人GBM 規范化治療后的中位生存期僅14.2個月[2]。在GBM中存在廣泛的糖代謝改變，其中即包括戊糖磷酸途徑（pentose phosphate pathway，PPP）。 PPP為細胞增殖提供物質基礎并維持細胞氧化還原狀態。在GBM 中， PPP起到促進增殖和侵襲的作用，但其調控機制有待闡明。 miRNAs 是一類內源性非編碼單鏈RNA，在進化上高度保守，長度為22個核苷酸作用，抑制mRNAs翻譯或降解靶mRNAs 的途徑，主要為與靶mRNAs3’末端非編碼區（3’UTR）不完全互補結合，從而在個體發育、細胞增殖、凋亡等生理過程中參與。有研究表明[3]，miRNAs 能夠對信號通路造成影響，途徑為對重要靶基因進行調控，從而將與癌基因或抑癌基因類似的功能發揮出來。膠質瘤等多種腫瘤的發生均和miRNAs 表達異常關系密切。因此， miRNAs 能夠將新的認識提供給膠質瘤發病機制與治療靶點的研究。本研究為闡明miR-153通過PPP 影響 GBM增殖的分子機制，提供GBM治療的靶點具有臨床應用價值，報道如下。

1 材料與方法

1.1主要材料

從惠州市中心人民醫院收集手術切除的 GBM 組織樣本，原代培養為GBM干細胞，所有患者均為首診首治。購買美國 Invitrogen 公司生產的細胞培養所需試劑、 DMEM高糖培養基、美國 Abcam 公司生產的抗體、日本Dojindo公司生產的 CCK-8、美國BD 公司生產的 Annexin V-FITC。

1.2方法

1.2.1 GBM干細胞的培養

收集GBM組織，剪碎，消化后吹打成單細胞懸液。過濾、離心，在干細胞培養基中將細胞重懸，干細胞培養基包含4μg/L 肝素+20μg/L 表皮細胞生長因子+20μg/L 成纖維細胞生長因子+10μg/L 白血病抑制因子+1∶50B27添加劑+1∶100雙抗+Neurobasal 培養基。在37℃、5%二氧化碳細胞孵箱中放置培養，用 DMEM高糖培養基（含10%胎牛血清）對細胞分化進行誘導。并分為 miR-153組、空白對照組（無意義寡核苷酸鏈）。

1.2.2 GBM干細胞的鑒定

免疫熒光染色對分選后細胞巢蛋白（nestin）、CD133表達進行檢測，用DMEM高糖培養基（含10%胎牛血清）對細胞分化進行誘導。免疫熒光染色對神經元標志物微管相關蛋白2（microtubule-associated protein 2， MAP2）、分化星形膠質細胞標志物神經膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）表達進行檢測，即用40 g/L 多聚甲醛將細胞固定下來，漂洗后將0.4%Triton X-100加入。將1∶500鼠抗人MAP2單克隆抗體、1∶200鼠抗人巢蛋白單克隆抗體、1∶5000兔抗人GFAP 單克隆抗體、1∶200兔抗人CD133多克隆抗體一抗加入后，將1：200羊抗兔IgG（Alexa ?uor488標記）、1∶300羊抗鼠IgG（Alexa ?uor 594）熒光二抗加入，充分混合后對細胞核進行DAPI 染色。

1.2.3 miR-153對GBM干細胞增殖的影響

構建TTN-AS1的野生型、突變型熒光素酶表達載體，合成miR-153擬似物，通過熒光素酶實驗驗證 TTN-AS1與miR-153的結合作用和結合位點。構建過表達和表達沉默TTN-AS1的GBMCs，檢測miR-153表達水平變化。過表達或沉默TTN-AS1后，檢測PPP 相關分子的表達變化，包括G6PD、NADPH/NADP+、 GSH/GSSG、ROS、R5P。檢測過表達或沉默TTN-AS1后， GBMCs增殖、線粒體膜電位、細胞凋亡水平、 DNA 合成情況的變化。構建G6PD 的3’UTR 野生型、突變型熒光素酶表達載體，通過熒光素酶實驗驗證 miR-153與G6PD的結合作用和結合位點。過表達或沉默miR-153后，檢測PPP相關分子的表達變化，包括G6PD、 NADPH/NADP+、GSH/GSSG、ROS、R5P。檢測過表達或沉默miR-153后， GBMCs增殖、線粒體膜電位、細胞凋亡水平、DNA 合成情況的變化。運用CCK-8法檢測，轉染后1d、2 d、3 d、4 d、5 d分別將CCK-8液加入miR-153組、空白對照組細胞中作用4 h，采用BIO-EEK 酶標儀在450 nm處對各培養孔的吸光度（A）值進行測定，依據A值對細胞增殖情況進行判斷。

1.2.4細胞凋亡檢測

轉染后3 d將 Annexin V-FITC 加入 miR-153組、空白對照組細胞中，采用流式細胞儀檢測，采用 Cell? Quest 3.3分析軟件分析數據。

1.3統計學分析

采用 SPSS 21.0軟件進行數據處理。計數資料用[ n（%）]表示，用χ2檢驗;計量資料用（±s）表示，用 t 檢驗。以 P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-153對GBM干細胞增殖的影響

轉染后1 d、5 d，miR-153組和空白對照組的細胞存活率對比差異不顯著（P>0.05）;轉染后2 d、3 d、4 d， miR-153組的細胞存活率低于空白對照組（P<0.05），其中轉染后4 d 出現最小細胞生存率，見表1。

2.2 miR-153對GBM干細胞凋亡的影響

進行流式細胞檢測發現， miR-153組的細胞凋亡率高于空白對照組[（9.40±1.97）%比（4.27±0.30）%， t=4.000，P=0.024]。

3 討論

GBM是膠質瘤中級別最高的一種類型。膠質瘤在世界衛生組織中被分為4個級別，Ⅰ級和Ⅱ級的膠質瘤屬于偏良性的膠質瘤，也是較低級別的膠質瘤;Ⅲ級和Ⅳ級的膠質瘤屬于偏惡性的膠質瘤，臨床稱為高級別的膠質瘤。Ⅳ級膠質瘤即 GBM，可分為原發性和繼發性。原發性 GBM。屬于Ⅳ級膠質瘤，術后可能較快復發，二次切除后預后也不佳。繼發性GBM 是Ⅱ級或Ⅲ級膠質瘤，經過一次手術后再次復發，但繼發性 GBM可能復發的間隔時間稍長，預后比原發性GBM 稍好。所以，針對不同類型的GBM，預后不同。

GBM早期可能沒有任何癥狀，但隨著腫瘤的生長，會產生相應的癥狀，可以分為兩類。（1）不同部位的 GBM產生不同的癥狀，如偏癱、感覺麻木、癲癇、患者智力的改變等。（2）腫瘤長得比較大時，可能會引起顱內壓增高的癥狀。 GBM是一種惡性膠質瘤，它是在 WHO 分級里面屬于最惡性的腫瘤之一。目前針對 GBM 的治療原則還是以手術為主，放化療為輔的一個原則。 GBM 目前還是神經外科難以攻克的一種腫瘤，因為其是最惡性的腫瘤。之所以綜合治療是因為任何一個單獨的治療都不能達到一個很好的效果，所以綜合治療就是手術為主，輔助的放療和化療，愈后相比較其他腫瘤差。從目前來看，其生存期大概14個月多一點。最近幾年來，越來越多的研究表明，腫瘤干細胞在腫瘤的發生、侵襲、轉移、復發和對治療的抵抗中發揮著重要作用[4]。正因為如此，腫瘤干細胞是非常好的抗腫瘤治療靶標。 GBM 干細胞被不同的研究團隊分離出來，它們具有干細胞特性，包括自我更新和多向分化能力。與此同時，它們還具有很強的腫瘤形成能力和更強的對化療放療的抵抗能力[5]。

microRNAs（miRNAs）是一類小單鏈RNA分子，非編碼，內源性，長度為12～25個核苷酸，雖然由轉錄而來，但是并不對蛋白進行編碼，而是通過不完全互補結合同源mRNA、序列特異性的方式對mRNA 進一步翻譯蛋白合成進行抑制或剪切降解mRNA。生物信息學手段證實，每個miRNA 可對上百個靶基因進行調控，而這些受控基因在所有信號通路廣泛分布，好多個 miRNA 也調控著1個靶基因，從而促進復雜的miRNA

信息網絡的形成。在癌癥等很多生理調節與發病過程中，該類分子均發揮著極為重要的作用。有研究表明[6]，很多miRNAs 和人類各種惡性腫瘤的發病機理關系密切，患者預后和特殊的miRNAs 表達量特異性相關。在中樞神經系統腫瘤中，膠質瘤最為常見，其是一種惡性腫瘤，患者具有較差的預后，原因主要為腫瘤的浸潤性生長速度快，臨床無法將腫瘤完全切除。膠質瘤本身的異質性導致其對臨床藥物具有較強的抵抗性，同時腫瘤本身在腦內分布，藥物的有效作用無法在血腦屏障的限制下發揮出來。但是這種現狀在癌基因組阿特拉斯計劃、基因表達譜、腫瘤干細胞理論等作用下顯著改變?，F階段雖然在膠質瘤研究中miRNA 仍然處于起步階段，但是已經確定了特異miRNA 在神經膠質瘤中的表達譜，將新的依據提供給了臨床診斷和治療神經膠質瘤的工作。近年來，有研究表明[7]，在腦腫瘤的診斷中， miRNA 表達譜可能能夠作為有用的生物標記，并成為新的藥物將腫瘤上漲阻止。

miRNAs 的生物合成機制為 miRNAs 基因在人類所有染色體中分布， Y染色體除外。 RNA聚合酶Ⅱ轉錄對 miRNA 進行首先編碼的基因為原始 miRNA，通常情況下，其核苷酸序列較長，達到了幾百到一千個。之后，原始 miRNA 將莖-環二級結構形成，呈發夾形狀， RNA酶Ⅲ在細胞核中對其進行加工，促進前體 miRNA 的形成，長度為60～70nt左右，最后，在轉運蛋白 Exprorin-5的作用下，原始 miRNA 被從核內向胞質中運輸，在 Dicer 酶作用下向短雙鏈 miRNA 進一步加工，解旋酶解開雙鏈為成熟 miRNA、miRNA*，前者被引導向沉默復合體中進入，翻譯抑制或降解mRNA，后者以較快的速度被降解[8]。

長鏈非編碼 RNA（Long non-coding RNA，LncR-NA）是一類長度大于200nt的非編碼 RNA，其在轉錄沉默、轉錄激活、染色體修飾、核內運輸等均具有重要的功能。LncRNAs在多種惡性腫瘤，包括GBM 中發揮重要調控作用。此外，LncRNAs還是比較靈敏的腫瘤標志物，能夠用于腫瘤的早期診斷和預后評價。 TTN-AS1起到促進食管癌細胞增殖、轉移的作用。但TTN-AS1在 GBM 中的表達水平及功能尚未見報道。 miRNA 是由大約23個核苷酸組成的非編碼單鏈RNA，它與目標mRNA 的（3’UTR）互補配對結合，在轉錄后水平調控成百上千個基因的表達，具有廣泛的生物學功能[9]。由于存在 miRNA的結合位點， LncRNA 可以作為內源性競爭性RNA，通過競爭性結合 miRNA，在細胞中起到 miRNA 海綿的作用，進而解除 miRNA 對其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表達水平。前述TTN-AS1和 G6PD 并不存在直接作用。 TTN-AS1可能作為某些 miRNAs 的ceRNA發揮作用，并間接調控PPP。綜上所述，申報人提出科學假說：由于與 miR-153存在結合位點， TTN-AS1減弱了 miR-153對下游靶基因的負調控作用，最終促進PPP 及 GBMCs 惡性增殖。 miRNAs 廣泛參與著腫瘤發生發展的調控，在GBM 中，有些過表達的 miRNAs 起到了癌基因的作用，而另一些降低表達的 miRNAs 則起到抑癌基因的作用[10-11]。與此同時， miRNAs 還廣泛參與對 GBM 干細胞的干細胞特性的調控[12]。

GBM 中存在著顯著的糖代謝異常，其中即包括 PPP[13]。顯著上調的PPP是GBM快速生長的重要因素，也是 GBM治療的有效切入點，但調控PPP 的確切機制有待闡明[14-15]。前期研究發現，TTN-AS1在 GBM 中高表達，起到促進PPP 和 GBM 增殖的作用。 TTN- AS1負調控 miR-153，從而減弱 miR-153對 PPP的關鍵限速酶 G6PD 的抑制作用，最終促進PPP 及 GBM 惡性增殖。為了闡明TTN-AS1、miR-153、G6PD 在調控軸中的調控機制，本研究需要對不同節點的兩兩結合調控關系進行驗證。在前期研究中，我們已經初步研究了TTN-AS1對 miR-153、miR-153對 G6PD 的調控作用。本研究闡述miR-153通過戊糖磷酸途徑抑制 GBM干細胞增殖的情況，結果表明，轉染后1 d、5 d， miR-153組和空白對照組的細胞存活率對比差異不顯著（P>0.05）;轉染后2 d、3 d、4 d，miR-153組的細胞存活率低于空白對照組（P<0.05），其中轉染后4 d出現最小細胞生存率。 miR-153組的細胞凋亡率高于空白對照組（P<0.05），說明 miR-153顯著抑制 GBM 干細胞增殖，并驗證了 miR-153可以作為 GBM 治療的新靶點，具有潛在藥物開發價值。

綜上所述，此次研究 miR-153通過 PPP抑制 GBM 增殖的分子機制，提供GBM治療的靶點，具有臨床應用價值。

參考文獻

[1]? Qiao J，Zhao J，Chang S，et al. MicroRNA-153 improves theneurogenesis of neural stem cells and enhances the cognitive ability of aged mice through the notch signaling pathway[J].Cell Death Di?er，2020，27（2）：808-825.

[2]? Diana A ，Gaido G ，Maxia C ，et al. MicroRNAs at thecrossroad ofthe dichotomic pathway cell death vs. stemness in neural somatic and cancer stem cells：implications and therapeutic strategies[J]. Int J Mol Sci，2020，21（24）：9630.

[3]? Buruian? A，Florian ?I，Florian AI，et al. The roles ofmiRNAin glioblastoma tumor cell communication：diplomatic and aggressive negotiations[J]. Int J Mol Sci，2020，21（6）：1950.

[4]? Zhou Z，Lai Y，Cao S，et al. Long non-coding RNA HHIP-AS1 inhibits lung cancer epithelial-mesenchymal transition? and stemness by regulating PCDHGA9[J]. Mol Med Rep，2021，24（6）：845.

[5]? Ashrafizadeh M，Ang HL，Moghadam ER，et al. MicroRNAsand their influence on the ZEB family：mechanistic aspects and therapeutic applications in cancer therapy[J]. Biomolecules，2020，10（7）：1040.

[6]? Iaquinta MR，Lanzillotti C，Mazziotta C，et al.The roleof microRNAs in the osteogenic and chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells and bone pathologies[J]. Theranostics，2021，11（13）：6573-6591.

[7]? Tseng AM，Chung DD，Pinson MR，et al. Ethanol exposureincreases miR-140 in extracellular vesicles：implications for fetal neural stem cell proliferation and maturation[J]. Alcohol Clin Exp Res，2019，43（7）：1414-1426.

[8]? Zhang J，Li Y，Liu Y，et al. Long non-coding RNA NEAT1regulates glioma cell proliferation and apoptosis by competitively binding to microRNA-324-5p and upregulating KCTD20 expression[J]. Oncol Rep，2021，46（1）：125.

[9]? Zuo Z ，Ye F ，Liu Z ，et al. MicroRNA-153 inhibitscell proliferation ，migration ，invasion and epithelial- mesenchymal transition in breast cancer via direct targeting ofRUNX2[J]. Exp Ther Med，2019，17（6）：4693-4702.

[10]? Mazurek M，Grochowski C，Litak J，et al. Recent trends ofmicroRNA significance in pediatric population glioblastomaand current knowledge ofmicro RNA function in glioblasto- ma multiforme[J]. Int J Mol Sci，2020，21（9）：3046.

[11]? Baliou S，Kyriakopoulos AM，Spandidos DA，et al. Roleof taurine，its haloamines and its lncRNA TUG1 in both ?inflammation and cancer progression. On the road to? therapeutics？（Review ）[J]. Int J Oncol，2020，57（3）：631-664.

[12]? Humphries BA，Wang Z，Yang C. MicroRNA regulationof the small rho GTPase regulators— complexities and opportunities in targeting cancer metastasis[J]. Cancers （Basel ），2020，12（5）：1092.

[13]? Qiu T ，Yin H ，Wang Y ，et al. miR-153 attenuates thein?ammatory response and oxidative stress induced by spinal? cord injury by targeting ofNEUROD2[J]. Am J Transl Res，2021，13（7）：7968-7975.

[14]? Thomas L，Florio T，Perez-Castro C. Extracellular vesiclesloaded miRNAs as potential modulators shared between glioblastoma，and parkinson’s and alzheimer’s diseases[J]. Front Cell Neurosci，2020，14（11）：590034.

[15]? Yang L，Chen Y，Liu N，et al. Low expression ofTRAF3IP2-AS1 promotes progression ofNONO-TFE3 translocation renal cell carcinoma by stimulating N6-methyladenosine ofPARP1 mRNA and downregulating PTEN[J]. J HematolOncol，2021，14（6）：46.

（收稿日期：2021-10-25）