LINC00710靶向miR-367/PTEN軸抑制肺癌A549細胞的增殖、遷移和侵襲

莫靜欣，馮 莉，楊 力

（十堰市人民醫院呼吸內科重癥監護室，十堰 442000）

肺癌已成為中國癌癥死亡的主要原因。由于缺乏早期診斷標志物，超過50%肺癌患者確診時已經處于晚期，使患者錯過最佳治療時機，導致5年生存率未超過15%[1-2]。因此，探討肺癌的分子機制對尋找肺癌診斷和治療靶點有重要的意義。長鏈非編碼RNA（lncRNAs）是長度超過200 nt 的非編碼RNA轉錄本，其通過直接或間接與miRNA、蛋白質相互作用等參與腫瘤的發展[3-4]。Zhao 等[5]采用lncRNA芯片技術和熒光定量PCR分析發現肺腺癌組織中LINC00710表達顯著降低，但LINC00710在肺癌細胞中的具體生物學作用尚未可知。微小RNA（miR）-367是一種腫瘤相關因子，miR-367高表達與肺癌患者較差的預后、腫瘤大小、腫瘤分期、轉移相關，抑制miR-367能促進肺癌細胞增殖和侵襲，并誘導細胞凋亡，進而促進肺癌發生和發展[6]。第10 號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源等位基因（PTEN）是一種抑癌基因，PTEN低表達對肺癌的發生、浸潤及轉移具有促進作用。生物信息學分析發現，LINC00710 與miR-367、miR-367 與PTEN 之間存在互補結合位點，但LINC00710 是否靶向miR-367/PTEN 軸參與肺癌進展尚未可知。本研究以miR-367、PTEN 為關鍵點，旨在探討LINC00710 對肺癌細胞惡性行為的影響和可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗組織

收集2017 年12 月至2018 年12 月于本院確診為肺癌的33 例患者，其中男15 例，女18 例；所有患者術前均未接受化療、放療或其它治療；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期17 例，Ⅲ期16 例；淋巴結轉移20 例，未轉移13 例。將切除的肺癌患者的癌組織及癌旁組織分割成小塊，生理鹽水漂洗去除血漬和污物，置于液氮中冷凍，置于-80 ℃冰箱中保存。本研究符合倫理委員會的規定，并在患者知情同意的情況下進行。

1.2 細胞和試劑

肺癌A549 細胞購自中國科學院上海生物科學研究所。青/鏈霉素雙抗、DMEM培養基、胎牛血清購于美國Gibco 公司；TRIzol 試劑、Opti-MEM 培養基、Lipofectamine 2000 購于美國Invitrogen 公司；LINC00710 過表達質粒（pcDNA3.1-LINC00710）、空載體質粒（pcDNA3.1）、miR-367 模擬物（miR-367 mimic）、雙熒光素酶報告基因載體購于上海吐露港生物技術公司；miRNA熒光定量PCR試劑盒和逆轉錄試劑盒購于北京百奧萊博生物公司；Prime-ScriptTMRT 試劑盒、2×SYBR Premix ExTaq 試劑盒購于大連TAKARA 生物；細胞增殖檢測試劑盒（CCK-8）購于上海晶抗生物公司；基質膠、Transwell培養板購于美國BD 公司；兔源Ki67 抗體、羊抗兔IgG 二抗、兔源PTEN 抗體、兔源上皮細胞鈣粘蛋白（E-cadherin）抗體和兔源神經鈣黏素（N-cadherin）抗體、兔源磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體購于上海賽信通公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 A549 細胞培養于DMEM 中（含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素與100 μg/mL 鏈霉素）。當細胞80%匯合時進行0.25%胰蛋白酶消化，1∶3 比例傳代，每3～4 d 傳代一次。培養箱環境為37 ℃、5%CO2。

1.3.2 RT-qPCR檢測LINC00710和miR-367表達 用TRIzol 試劑從肺癌組織和癌旁組織中提取總RNA。為檢測LINC00710和miR-367表達，分別用PrimeScriptTM和miRNA 逆轉錄試劑盒合成cDNA，再分別用2×SYBR Premix ExTaq熒光定量PCR試劑盒進行RT-qPCR。LINC00710 上游引物：5’-AGCACCTGTTCCCCTCTACT-3’，下游引物：5’-CCAGGGTGAATGGAAACCCA-3’；miR-367 上游引物：5’-TCCACCACCCAGTTGCTGTA-3’，下游引物：5’-CGAGCAATTGCACTTTAGCAAT-3’；GAPDH 上游引物：5’-CCCACATGGCCTCCAAGGAGTA-3’，下游引物：5’-GTGTACATGGCAACTGTGA-GGAGG-3’；U6 上游引物：5’-GGTCGGGCAGGA-AAGAGGGC-3’，下游引物：5’-GCTAATCTTCTCTGTATCGTTCC-3’。采用2-ΔΔCT方法計算LINC00710（GAPDH 為內參）和miR-367（U6 為內參）的相對表達水平。

1.3.3 轉染和實驗分組 將A549 細胞以2×105個/孔接種到6 孔板中，當細胞50%匯合時進行細胞轉染。利用脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000、Opti-MEM 培養基 分別將pcDNA3.1、pcDNA3.1-LINC00710、miR-367 mimic、miR-367 mimic+pcDNA3.1-LINC00710 轉染A549 細胞，依次記為pcDNA3.1組、pcDNA3.1-LINC00710組、miR-367 mimic組、miR-367 mimic+pcDNA3.1-LINC00710 組。另設置對照組，不進行轉染。6 h后更換為新鮮含血清DMEM 培養基，轉染48 h 后收集細胞，用RT-qPCR法檢測轉染效果。

1.3.4 CCK-8 法檢測細胞活力 轉染細胞以5×103個/孔的密度接種于96 孔板中，培養24 h，每孔加入90 μL 的DMEM 和10 μL 的CCK-8。采用酶標儀檢測孵育2 h后各孔細胞在450 nm波長處吸光度值。

1.3.5 集落形成實驗檢測克隆形成數 取0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA 溶液消化各組A549 細胞。按照每孔600 個細胞接種60 mm 培養板，每2 d 更換1 次培養基，當出現肉眼可見的克隆時停止培養。4%多聚甲醛固定細胞集落，0.1%結晶紫對細胞集落染色。隨后顯微鏡對菌落進行計數。

1.3.6 Transwell 實驗檢測細胞遷移和侵襲 向24孔板下室中加600 μL含10%血清的細胞培養基，將包被（侵襲檢測）或未包被（遷移檢測）基質膠的Transwell上室中加入200 μL。培養24 h后，去除未穿膜細胞，用4%多聚甲醛固定侵襲細胞，PBS 沖洗3次，0.1%結晶紫染色10 min，PBS沖洗3次，隨機選擇5個視野進行細胞計數、觀察和拍照。

1.3.7 Western blotting 檢測PTEN、Ki67、E-cadherin和N-cadherin 蛋白表達 預冷RIPA 緩沖液裂解細胞，離心收集細胞上清液，BCA 法進行蛋白定量。按照30 μg 每孔上樣進行電泳，轉移至PVDF 膜上，4 ℃下用5%脫脂牛奶封閉1 h，用1∶1 000 稀釋的PTEN、Ki67、E-cadherin、N-cadherin、GAPDH 一抗溶液室溫孵育2 h，加入1∶1 000 稀釋的二抗溶液孵育，加入化學發光試劑暗室顯色后，用Image J 軟件定量分析目的條帶灰度值。結果以目的蛋白和內參GAPDH灰度值的比值表示。

1.3.8 雙熒光素酶報告基因實驗 將含有miR-367預測結合位點的LINC00710（或PTEN-3’UTR）野生型序列或不含預測結合位點的LINC00710（或PTEN-3’UTR）突變型序列分別克隆到pmirGLO載體，構建重組載體WT-LINC00710、WT-PTEN、MUTLINC00710、MUT-PTEN。將A549 細胞以1×104個/孔的密度接種于24孔板中，當細胞匯合度達到50%時，使用Lipofectamine 2000試劑分別將重組載體與miR-367 mimic 或control 共轉染到A549 細胞中。檢測培養48 h后細胞相對熒光素酶活性。

1.4 統計學方法

實驗獨立重復3次，采用SPSS 20.0軟件進行數據分析，符合正態分布的計量資料用均數±標準差（）表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LINC00710、miR-367在肺癌中的表達

與癌旁組織比較，肺癌組織中LINC00710的表達水平降低，miR-367 的表達水平升高（均P＜0.05），見表1。

表1 LINC00710、miR-367在肺癌組織中的表達

表1 LINC00710、miR-367在肺癌組織中的表達

2.2 各個處理組對A549增殖遷移、侵襲的影響

與對照組、pcDNA3.1 組比較，pcDNA3.1-LINC 00710 組A549 細胞增殖活性降低，克隆形成數、遷移及侵襲細胞數減少（均P＜0.05）；與對照組比較，miR-367 mimic 組A549 細胞增殖活性升高，克隆形成數、遷移和侵襲細胞數增多（均P＜0.05）；與pcDNA3.1-LINC00710 組比較，miR-367 mimic+pcDNA3.1-LINC00710 組A549 細胞增殖活性升高，克隆形成數、遷移和侵襲細胞數增多（P＜0.05），見表2、圖1。

圖1 LINC00710、miR-367對A549細胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.3 LINC00710 靶 向miR-367 及miR-367 靶 向PTEN

DIANA Tools 數據庫預測發現LINC00710 與miR-367、miR-367 與PTEN 之間存在互補結合位點，見圖2。雙熒光素酶報告實驗顯示，與對照組和WT-LINC00710（或WT-PTEN）共轉染組比較，miR-367 mimic 和WT-LINC00710（或WT-PTEN）共轉染組A549 細胞的相對熒光素酶活性降低（P＜0.05）；與對照組和MUT-LINC00710（或MUT-PTEN）共轉染組比較，miR-367 mimic 和MUT-LINC00710（或MUT-PTEN）共轉染組A549細胞的相對熒光素酶活性無顯著變化（P＞0.05），見圖3。

圖2 miR-367與LINC00710、PTEN的靶向關系

表2 LINC00710、miR-367對A549細胞增殖、遷移和侵襲的影響，n=3

表2 LINC00710、miR-367對A549細胞增殖、遷移和侵襲的影響，n=3

與對照組比較，*P＜0.05；與pcDNA3.1組比較，#P＜0.05；與pcDNA3.1-LINC00710組比較，&P＜0.05。

2.4 miR-367 能減輕LINC00710 對A549 中Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達的影響

與對照組、pcDNA3.1 組比較，pcDNA3.1-LINC00710 組A549 細胞miR-367 表達、Ki67 和Ncadherin 蛋白表達降低，PTEN 和E-cadherin 蛋白表達升高（P＜0.05）；與對照組比較，miR-367 mimic組A549 細胞miR-367 表達、Ki67 和N-cadherin 蛋白表達升高，PTEN和E-cadherin蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與pcDNA3.1-LINC00710 組比較，miR-367 mimic+pcDNA3.1-LINC00710 組A549 細胞miR-367 表達、Ki67 和N-cadherin 蛋白表達升高，PTEN和E-cadherin蛋白表達降低（P＜0.05），見表3和圖4。

圖4 PTEN、Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白的表達

表3 miR-367能減輕LINC00710對A549中PTEN、Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達的影響，n=3

表3 miR-367能減輕LINC00710對A549中PTEN、Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達的影響，n=3

與對照組比較，*P＜0.05；與pcDNA3.1組比較，#P＜0.05；與pcDNA3.1-LINC00710組比較，&P＜0.05。

3 討論

目前肺癌的診斷和治療方法還很有限，其治療效果欠佳[8]。已發現許多lncRNA 與肺癌進展相關。如lncRNA成神經細胞瘤相關轉錄物1（NBAT-1）在肺癌組織標本中表達較癌旁組織顯著降低，NBAT-1 低表達與患者腫瘤大小、淋巴結轉移情況顯著相關，過表達NBAT-1可抑制A549細胞增殖和細胞周期，誘導細胞凋亡[9]。肺癌細胞株中lncRNA X 染色體失活基因（XIST）的表達顯著高于正常人支氣管上皮細胞，抑制XIST表達可降低細胞增殖、遷移和侵襲能力，抑制A549 異種移植小鼠模型的腫瘤生長[10]。但lncRNA 在肺癌中的潛在分子機制仍需進一步研究。本研究結果發現，肺癌組織中LINC00710 表達較癌旁組織顯著降低，與趙兵等[11]研究結論相一致。Ki67 是一種標記細胞增殖狀態的核抗原，其表達水平可準確反映細胞增殖活性[12]。E-cadherin 表達增加可維持細胞形態和黏附功能，而N-cadherin 表達增加則促進細胞骨架發生改變，降低細胞黏附能力，使其易于脫離原發灶，向周圍組織侵襲轉移[13]。本研究結果顯示，過表達LINC00710 可顯著降低A549 細胞存活率、克隆形成、遷移和侵襲能力，降低Ki67和E-cadherin蛋白表達水平，提高N-cadherin表達水平，表明LINC00710對A549細胞增殖、遷移和侵襲具有顯著抑制作用。

miRNA 表達與腫瘤發生、耐藥、腫瘤轉移密切相關，參與腫瘤發生和發展[14]。miR-367 位于染色體4q25位點，骨肉瘤、胰腺癌中miR-367表達增加，miR-367高表達對癌細胞遷移、侵襲具有誘導作用，miR-367 抑制劑可以消除這種致癌作用[15-16]。lncRNA癌易感性候選基因2（CASC2）通過下調miR-367 還可抑制肝癌細胞的遷移、侵襲和上皮間質轉化進程[17]。本研究發現，肺癌組織中miR-367 表達增加，LINC00710 對miR-367 具有靶向負調控作用。過表達miR-367可提高A549細胞增殖、遷移和侵襲能力，表明miR-367在肺癌中發揮致癌作用，與Xiao等[18]報道一致。PTEN已被證實在肺癌中表達降低或缺失，恢復PTEN 表達能夠抑制肺癌細胞增殖、遷移和血管生成[19-20]。本研究證實，miR-367 靶向負調控PTEN 表達，與Ling 等[21]報道在黑色素瘤葡萄膜細胞中兩者靶向關系一致。本實驗顯示，過表達miR-367 顯著減弱LINC00710 過表達對A549細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用以及對PTEN 表達的促進作用，進一步說明LINC00710 靶向miR-367可抑制肺癌A549細胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，LINC00710通過靶向miR-367/PTEN軸可抑制肺癌A549細胞增殖、遷移和侵襲，這對今后肺癌基因治療具有一定的參考價值。