lncRNAs ABHD11-AS1靶向miR-133a上調EGFR表達促進卵巢癌細胞增殖*

王之豐 孫昊 胡電 金志軍 劉曉軍

卵巢癌的發病率低于宮頸癌和子宮內膜癌，居婦科惡性腫瘤的第三位，但死亡率卻超過宮頸癌及子宮內膜癌之和，居婦科癌癥首位，是嚴重威脅婦女健康的最大疾患[1-2]。由于卵巢癌的癥狀不典型，容易被歸為其他疾病的并發癥，“無聲的殺手”因此得名。臨床上缺乏有效的篩查技術，因此卵巢癌通常在晚期才被診斷出來，預后較差[3-4]。目前，卵巢癌的治療依賴于手術和鉑類藥物，但腫瘤在腹腔內和盆腔內的種植轉移無法控制。最新研究顯示，卵巢癌5年后的存活率僅為48.6%[2，5]。因此，迫切需要開發新的診斷指標和預后治療靶標來優化治療方案。

lncRNAs是一種調節性的非編碼RNA，其異常調控被認為與許多疾病有關。miRNAs在不同類型的腫瘤中起著抑癌或癌基因的作用[6]，而lncRNAs常常作為miRNAs間接調控基因表達的靶點。大量研究表明，miRNAs與lncRNAs之間的相互作用能較大程度影響癌癥的發生和發展[7]。因此，建立一種有效的方法來鑒定與癌癥相關的lncRNA-miRNA相互作用是非常重要的。競爭性內源RNA（CeRNA）假說的提出讓人們對lncRNA-miRNA之間作用機制的認識上升到一個新的層面[8]。至今已有許多報道證實lncRNAs ABHD11-AS1對卵巢癌的進程有促進作用，但作用機制還有待進一步的探究[9]。而值得關注的是lncRNAs ABHD11-AS1存在miR-133a的結合位點[10]，而miR-133a是否通過介導ABHD11-AS1信號從而影響卵巢癌的進程目前還沒有相關研究。故本研究旨在探究miR-133a能否通過介導ABHD11-AS1信號影響卵巢癌的進展，并深入分析其作用機制。

材料與方法

1細胞株 人卵巢癌細胞TOV-112D和CaVO3購自中國科學院上海細胞庫。人輸卵管上皮細胞TEC購自上海鈺博生物科技有限公司。所有細胞均使用42.5%MCDB105（含1.5 g/L碳酸氫鈉）+42.5% M199（含2.2 g/L碳酸氫鈉）培養液中，同時加入15%胎牛血清以及1%的青霉素-鏈霉素培養。并將細胞置于37 ℃、5% CO2的培養箱內培養，常規消化傳代，選用對數生長期的細胞進行實驗。

2主要試劑 PRMI-1640培養液購自HyClone公司；胎牛血清購自Gibco；RIPA裂解液和BCA試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；NC siRNA，lncRNAsABHD11-AS1 siRNA，NC siRNA inhibitor、miR-133a inhibitor以及NC mimic和miR-133a mimic委托上海合星生物科技有限公司合成；Lipofectamine 2000轉染試劑購自Invitrogen公司；TRLzol試劑以及TIANSeq M-MLV反轉錄酶購自北京普洛麥格生物技術有限公司；SYBR Green qPCR Mix購自于Thermo Fisher Scientific公司；CCK-8檢測試劑購自北京索萊寶公司；pMIR-reporter熒光素酶載體購自美國Ambion 公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自于北京索萊寶公司。

3Real-time PCR 采用TRIzol試劑按照說明書從細胞中分離出總RNA。然后按照操作說明書通過TIANSeq M-MLV逆轉錄成cDNA。采用SYBR Green qPCR Mix進行Real-time PCR反應，控制條件在95℃ 10 min;95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 10 s下利用SYBR Green qPCR Mix進行Real-time PCR反應，經歷35個循環后檢測其溶解曲線并分析樣本Ct值。以GAPDH為內參，采用2-△△Ct法計算mRNA的相對表達量。實驗中所用引物序列見表1。

表1 Real-time PCR引物序列

4免疫印跡分析 在冰上用預冷后的RIPA裂解液裂解細胞。使用BCA試劑盒對細胞總蛋白進行定量，操作嚴格按照說明書進行。每組總蛋白上樣量為20 μg，再用10%聚丙烯酰胺凝膠進行分離，最后轉移到PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1.5 h后，用以下主要抗體在4 ℃下培養過夜：小鼠單克隆抗人β-actin antibody（1∶3 000；Cell Signaling Technology），小鼠單克隆抗人EGFR（1∶1 500；Cell Signaling Technology）。用PBS沖洗膜5次，每次5 min，并在室溫下用辣根過氧化物酶（HRP）結合的山羊抗鼠IgG（1∶5 000；Santa Cruz Biotechnology）培養2 h。用化學發光（ECL）檢測系統檢測條帶，并用image-j軟件對結果進行分析。

5細胞轉染 將對數生長期的細胞接種于6孔板中，待細胞增長到70% 融合時，采用Lipofectamine 2000轉染試劑進行細胞轉染，按照試劑盒說明書轉染NC siRNA、ABHD11-AS1 siRNA和NC inhibitor、miR-133a inhibitor或者NC mimic和miR-133a mimic。ABHD11-AS1 siRNA的序列為：Forward：5'-GCUACGAGAUCAUGAGCCA-3'，Reverse：5'-UGGCUCAUGAUCUCGUAGC-3'。

6CCK-8實驗 將細胞接種至96孔板，每孔的密度為1.0×103/孔。分別于細胞轉染后的 0、24、48、72和96 h時加入10 μL的CCK-8試劑。2 h后用酶標儀測量OD450值。

7雙熒光素酶檢測 將含有ABHD11-AS1野生型序列的質粒wt-ABHD11-AS1和突變型序列的質粒mut-ABHD11-AS1分別與miR-133a mimic或者NC mimic共轉染至TOV-112D細胞內，24 h后采用雙熒光素酶報告的基因檢測試劑盒檢測各組的熒光強度。以熒光素酶pGL-3.0為內參，分析各組熒光素酶的活性。

8統計學分析 數據分析主要用GraphPad Prism 8.0和SPSS17.0軟件進行。兩樣本的比較采用獨立樣本的t檢驗分析，三組及以上的差異分析則利用單因素方差分析，事后比較采用LSD法。當P＜0.05時，差異具有統計學意義。

結果

1lncRNAs ABHD11-AS1對卵巢癌細胞增殖的影響Real-time PCR檢測lncRNAs ABHD11-AS1在卵巢癌細胞TOV-112D和CaVO3和人輸卵管上皮細胞TEC中的表達，結果顯示：ABHD11-AS1在TOV-112D和CaVO3中的表達水平明顯高于TEC細胞。為了探究lncRNAs ABHD11-AS1的表達水平對卵巢癌細胞增殖影響，在TOV-112D和CaVO3細胞中轉染ABHD11-AS1 siRNA，運用CCK-8實驗進行檢測，結果表明：下調lncRNAs ABHD11-AS1表達水平可明顯抑制卵巢癌細胞的增殖（圖1，P＜0.01）。

圖1 Real-time PCR檢測lncRNAsABHD11-AS1在卵巢癌細胞和人輸卵管上皮細胞中的表達

2lncRNAs ABHD11-AS1對miR-133a的調控作用 在轉染ABHD11-AS1 siRNA后，用Real-time PCR檢測CaVO3和TOV-112D中的miR-133a的表達。一方面，從圖2A（Real-time PCR）可以看出在CaVO3和TOV-112D中轉染ABHD11-AS1 siRNA后，miR-133a的表達明顯升高（P＜0.01）。另一方面，圖2B（雙熒光素酶）結果表明，轉染miR-133a mimic和野生型lncRNAs ABHD11-AS1后的細胞熒光強度顯著降低（P＜0.01）。因此，上述結果說明lncRNAsABHD11-AS1參與調控miR-133a的表達。

圖2 lncRNAs ABHD11-AS1對miR-133a的調控

3miR-133a在卵巢癌細胞系和人輸卵管上皮細胞TEC中的表達情況 Real-time PCR檢測卵巢癌細胞系TOV-112D、CaVO3和人輸卵管細胞TEC中miR-133a的表達，結果顯示：相對于TEC細胞，miR-133a在TOV-112D和CaVO3中的表達水平顯著降低（圖3），在TOV-112D和CaVO3細胞中分別轉染NC mimic和miR-133a mimic，Real-time PCR結果（圖3）顯示：與NC mimic組相比，在轉染了miR-133a mimic后的TOV-112D和CaVO3細胞中miR-133a的表達水平會明顯增加（P＜0.01）。轉染miR-133a mimic能夠顯著增加TOV-112D和CaVO3細胞中miR-133a的表達水平。

圖3 miR-133a在卵巢癌細胞系和人輸卵管上皮細胞TEC中的表達

4miR-133a對卵巢癌細胞增殖的影響 在得出上述結論后，我們進一步探究了miR-133a的表達水平對卵巢癌細胞增殖的影響。首先對TOV-112D和CaVO3細胞進行轉染miR-133a mimic并培養24 h，隨后用CCK-8檢測二者的增殖能力，結果顯示轉染后細胞的增殖能力降低（圖4，P＜0.01），說明上調miR-133a的表達有利于抑制卵巢癌細胞的增殖。根據上述結果，進一步探究miR-133a與卵巢癌細胞增殖的關系，在TOV-112D和CaVO3細胞中轉染miR-133a inhibitor，結果表明：下調miR-133a表達水平可明顯促進卵巢癌細胞的增殖（圖5，P＜0.01）。

圖4 miR-133a對卵巢癌細胞TOV-112D和CaVO3增殖的影響

圖5 miR-133a inhibitor 對卵巢癌細胞增殖的檢測

5卵巢癌細胞中miR-133a下游靶基因EGFR的表達檢測 在TOV-112D和CaVO3細胞中轉染miR-133a mimic后，檢測下游靶基因EGFR的表達，結果顯示：與NC mimic組相比，轉染miR-133a mimic后兩株細胞中EGFR的表達水平顯著降低，差異具有統計學意義（圖6，P＜0.01）。此外，為了進一步探究miR-133a與卵巢癌細胞中EGFR表達的關系，在前期研究基礎上，在TOV-112D和CaVO3細胞中轉染miR-133a inhibitor，結果表明：與NC inhibitor組相比，轉染miR-133a inhibitor后兩株細胞中EGFR的表達水平明顯提高，差異具有統計學意義（圖7，P＜0.01）。

圖6 miR-133a mimics對卵巢癌細胞EGFR表達的檢測

圖7 miR-133a inhibitor對卵巢癌細胞EGFR表達的檢測

6卵巢癌細胞中蛋白EGFR的表達檢測 在TOV-112D和CaVO3細胞中轉染miR-133a mimic后檢測下游蛋白EGFR的表達，結果顯示：與NC mimic組相比，轉染miR-133a mimic能夠顯著降低兩株細胞中EGFR的表達水平，差異具有統計學意義（圖8，P＜0.01）。與此相反，在TOV-112D和CaVO3細胞中轉染miR-133a inhibitor，結果表明：與NC inhibitor組相比，轉染miR-133a inhibitor后細胞中EGFR的表達水平明顯提高，差異具有統計學意義（圖9，P＜0.01）。

圖8 miR-133a mimics對下游蛋白EGFR的表達檢測

圖9 miR-133a inhibitor對下游蛋白EGFR的表達檢測

7lncRNAsABHD11-AS1的表達水平對EGFR表達的影響 根據上述結果，為了探究lncRNAs ABHD11-AS1的表達水平對EGFR表達的影響，在TOV-112D和CaVO3細胞中轉染ABHD11-AS1 siRNA，運用Real-time PCR以及WB實驗進行檢測，結果表明：與NC siRNA組相比，轉染ABHD11-AS1 siRNA后細胞中EGFR的表達水平明顯降低，差異具有統計學意義（圖10，P＜0.01）。

圖10 Real-time PCR和WB實驗檢測ABHD11-AS1 siRNA對EGFR表達的影響

討論

miRNAs作為一種小分子非編碼RNA，其長度約21～25個核苷酸，能夠結合目的基因的3'非編碼區（3'UTRs）來抑制基因表達[8]。由于一個miRNA靶向多個mRNA，因此miRNA在眾多生物學過程中發揮著重要作用，如細胞增殖、血管生成、細胞周期和細胞遷移等。研究表明miRNAs的改變影響著腫瘤的發展，miRNAs在腫瘤中異常表達，并且由于其靶點的性質miRNAs起著腫瘤啟動子或抑制子的作用[11]。多個miRNAs已經被證實能夠調控卵巢癌細胞的增殖，并調節腫瘤的發生進展與轉移，其中，miR-133a在卵巢癌的發病和轉移的過程中起著至關重要的作用[12-13]。與此類似，lncRNA作為一種長度大于200個核苷酸的非編碼RNA。研究表明其與各種疾病尤其是腫瘤有著密不可分的聯系，正逐步成為研究熱點[14]。ceRNA假說指出lncRNA可以通過miRNA的結合位點吸附miRNA從而釋放miRNA下游的靶基因[8]。研究表明，lncRNAsABHD11-AS1通過調控miR-361-3p/PDPK1信號促進胃癌的發展[15]，亦有研究證實，其靶向細胞周期蛋白D1促進子宮內膜癌的發展[16]，皆表明其與腫瘤密不可分。LEI等通過生物信息學預測發現lncRNAsABHD11-AS1上存有miR-133a的結合位點[10]，且有實驗證實了該結合位點的可行性[17-18]。而且我們的實驗結果更進一步證實，在卵巢癌細胞中下調ABHD11-AS1顯著促進了miR-133a的表達，雙熒光素酶結果顯示，同時轉染miR-133a mimic和野生型ABHD11-AS1的片段顯著抑制了熒光素酶的活性。上述結果說明ABHD11-AS1能夠與miR-133a結合。

miR-133a首次被報道是一項在小鼠上進行的試驗研究，研究發現miR-133a通過調節骨形態發生蛋白2（BMP-2）在胚胎肌肉發育過程中對成肌細胞增殖和分化起著至關重要的作用[19-20]。腫瘤細胞與正常細胞最大的區別是腫瘤細胞過度增殖的生長特性，隨著對miR-133a進一步的研究，人們發現miR-133a在前列腺癌[21]、頭頸部鱗狀細胞癌[22]、乳腺[23]、膀胱[24]、食管[25]和結直腸腫瘤[26]中的表達與正常組織相比相對下調。研究表明miR-133a表達的恢復被報道可以抑制癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導腫瘤細胞凋亡[21-26]。這些證據都表明miR-133a在多種人類癌癥中起抑癌作用。我們的研究也驗證了這一點：上調miR-133a能顯著抑制卵巢癌細胞的增殖能力，且抑制miR-133a的表達水平會促進其增殖。再結合lncRNAs ABHD11-AS1在卵巢癌組織中的高表達以及抑制ABHD11-AS1的表達能夠顯著抑制卵巢癌細胞的增殖[9]的研究發現，可以推測下調lncRNAs ABHD11-AS1能夠釋放miR-133a來抑制卵巢癌細胞的增殖，我們的研究也證實了這一點，通過下調lncRNAs ABHD11-AS1的表達水平，可以明顯抑制卵巢癌細胞的增殖以及EGFR的表達水平。

眾所周知，miRNAs通常通過與靶mRNAs的3'utr結合抑制靶mRNAs的表達來發揮其生物學功能。SONG等人[27]通過生物信息學的方法預測miR-133a的基因靶點發現表皮生長因子受體（EGFR/ErbB-1/HER1）在3'UTR上有兩個高度保守的miR-133a結合位點，miR-133a能夠靶向調控EGFR來抑制宮頸癌細胞在體內增殖。研究發現miR-133a通過直接靶向非小細胞肺癌[28]、前列腺癌[29]和乳腺癌[30]中的3'UTR抑制EGFR的表達。EGFR是表皮生長因子（EGF）成員的細胞表面受體，是ErbB受體家族的一員，在刺激細胞內蛋白酪氨酸激酶[31]活性方面起著關鍵作用。據報道，EGFR在多種腫瘤呈高表達，并且EGFR的過度表達與腫瘤的進展、對化療和放療的抵抗以及預后不良有關，表明它是一種癌基因[32]。我們的研究顯示，上調miR-133a顯著抑制卵巢癌細胞中EGFR的表達，在抑制miR-133a的表達水平后發現此抑制作用被逆轉，這提示了miR-133a可能通過抑制EGFR的表達來發揮抗卵巢癌細胞增殖的作用。

綜上，本研究主要探討了卵巢癌細胞中miR-133a的表達水平對抗癌作用的影響，并深入研究了其作用機制。結果表明，相對于人輸卵管上皮細胞，miR-133a在卵巢癌細胞中的表達水平更低，而上調其表達則有利于抑制卵巢癌細胞的增殖能力，通過抑制miR-133a的表達水平，也驗證了這一點。主要作用機制是lncRNAs ABHD11-AS1通過調控miR-133a，進而上調其下游靶基因EGFR的表達，從而促進卵巢癌的惡性表型。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突