石墨烯量子點與細胞免疫相關性研究新進展*

徐亞棟 李志強

石墨烯量子點（graphene quantum dots，GQDs）是納米碳材料家族的最新成員，由PONOMARENKO等[1]在2008年被研發成功。它是一種零維石墨烯材料，為橫向尺寸小于100納米的石墨烯薄片，包含一個或多個（2～10層）石墨烯層。其具有優異的化學、物理和生物特性，在納米醫學領域具有廣泛的應用前景，如：具有很強且可協調的熒光特性，可用于熒光生物成像和生物傳感；具有類芳香化合物的高負載能力，可用于小分子藥物傳遞，甚至基因傳遞；以及具有光輻射下產生活性氧（reactive oxygen species，ROS）的能力，可用于光熱和光動力療法治療癌癥[2]。研究表明，石墨烯及其衍生物可影響巨噬細胞和T細胞等免疫細胞的分化發育[3]，在疫苗、免疫制劑制備方面也具有潛在用途[4]。而GQDs作為石墨烯的衍生物，有更小的體積，不僅具有石墨烯的特性[5]，同時具有更高的生物相容性，故可作為治療炎性疾病的潛在藥物[6]。

1石墨烯量子點的生物相容性 生物相容性的總體定義是材料不引起意外生物反應的情況下執行其預期功能的能力，但材料的生物相容性范圍取決于具體的應用[7]。許多碳基納米顆粒會因為相互聚集而產生毒性，這限制了其在生物體中的應用，但GQDs表面存在-OH和-COOH等富氧基團，這些極性成分使GQDs具有優異的水溶性[8]，有利于其生物利用，而且GQDs為碳基顆粒，不用擔心金屬殘留的毒性問題。

1.1石墨烯量子點具有低細胞毒性：碳基納米顆粒的生物相容性在很大程度上取決于它們的表面化學性質[4]。GQDs主要通過小窩介導的內吞作用被細胞內化，體外研究表明，被-NH2，-COOH，-CHO-N-（CH3）2，聚乙二醇（PEG）等基團修飾的GQDs在濃度高達200 μg/mL時顯示出低毒性，而-OH修飾的GQDs在100 μg/mL以上時表現出一定的細胞毒性[9-11]。GQDs還顯示出較低的遺傳毒性，以往的研究中，碳納米管[12]和氧化石墨烯（graphene oxide，GO）[13]都被發現在低濃度下會導致DNA損傷，WU等[14]研究發現GQDs對MCF-7和MGC803細胞的DNA有輕微的損傷，但遠遠優于GO，GO在亞G1期便引發顯著的細胞聚集，導致細胞凋亡增加。

1.2石墨烯量子點的血液相容性：血液不僅是靜脈注射給藥的納米顆粒的第一接觸點，也是通過其他途徑給藥的所有納米顆粒到達其目標組織或器官的通道。因此評估GQDs的血液細胞相容性也非常重要。對于這方面的研究較少，KIM等[15]將人血紅細胞與不同官能團修飾的GQDs（非官能化、羥基化和羧化GQDs）共同孵育發現，當濃度低于500 μg/mL時，紅細胞的溶血率和流變學沒有明顯改變；而當濃度＞750 μg/mL時，羧基化GQDs造成了溶血，并導致紅細胞的變形和聚集。然而體內血液循環中，GQDs與血細胞、內皮細胞和血漿蛋白直接接觸，并可能相互影響，體外單種血細胞的評估不能完全反映GQDs的血液相容性，但在小鼠模型中，短期應用還未觀察到明顯的血栓及心血管并發癥。

1.3石墨烯量子點在生物模型中的毒性：NURUNNABI等[16]單次給小鼠靜脈注射羧基GQDs，觀察其生物分布和細胞毒性以及體內器官成像，發現GQDs從12 h開始被逐漸清除。并且連續給藥21 d（5或10 mg·kg-1·d-1）后沒有明顯的器官損傷或損傷。CHONG等[11]發現對小鼠靜脈和腹腔注射聚GQDs-PEG（20 mg·kg-1·d-1）14 d不會產生任何明顯毒性。同樣，在斑馬魚和秀麗隱桿線蟲中也未觀察到GQDs的明顯毒性[17-18]。

1.4石墨烯量子點在體內清除和降解：給小鼠靜脈和皮下注射GQDs發現，GQDs在腎臟內積聚，然后通過尿液排出[19]?？诜r，GQDs通過糞便排出，不會遷移到大腦或性器官[20]。超小尺寸的GQDs（＜5 nm）可以穿過腎臟濾過屏障并通過尿液排出，但是羧基GQDs雖然大小為3～6 nm，卻不能穿過腎濾過屏障，而是分布在肝臟和脾臟[21]。另外，研究表明，GQDs可被人髓過氧化物酶（MPO）和嗜酸性過氧化物酶（EPO）降解[22]。這可能是小鼠靜脈注射羧基GQDs沒有發現明顯毒性的部分機制。

總之，目前的研究顯示，GQDs具有較低的毒性，這成為了它作為治療藥物的前提。

2石墨烯量子點的抗氧化性 ROS是一組由機體各種細胞產生的不穩定分子，包括過氧化氫（H2O2）、羥基自由基（OH-）、單線氧（1O2）和超氧化物（O2-）等，在機體抵抗病原體和細胞信號傳導中起著重要作用，但他們如果不能及時清除并在細胞內蓄積，會破壞細胞內的蛋白質、脂質和核酸，造成氧化損傷[23]。研究表明，GQDs在生物系統中既具有ROS猝滅活性，又具有產生活性[24-25]。在光激發下，GQDs通過增加細胞內ROS水平從而降低細胞活力表現出顯著的光毒性，而在無光激發的情況下GQDs可以有效地清除大量ROS，從而保護細胞免受氧化損傷[26]，如圖1。如：NILEWSKI等[27]報道了GQDs-PEG對細胞具有低毒性并且有顯著的抗氧化作用。ROSTAMZADEH等[28]發現在大鼠心肌埂死模型中GQDs-PEG能緩解氧化應激反應，改善心肌梗死大鼠的心臟功能。

圖1 在光激發下，GQDs可產生活ROS，而在無光激發的情況下GQDs可有效地清除ROS

2.1GQDs的清除活性氧的機制：石墨烯的sp2雜化的碳原子蜂窩網絡是其他碳同素異形體的基本組成部分。簡單來說蜂窩網格結構包裹形成零維富勒烯，卷起形成一維的碳納米管，堆疊形成三維的石墨，切割形成零維的GQDs，如圖2?；钚匝蹩梢越Y合到GQDs的sp2碳結構域，GQDs的π-π共軛性質和豐富的邊緣缺陷位點促進了活性氧和GQDs之間的電荷轉移，從而消除活性氧。此外，GQDs表面豐富的含氧官能團（-OH、-COOH等）促進了GQDs中的自由電子離域化，表現出供氫能力，來消除ROS。

圖2 石墨烯及其衍生物結構示意圖

2.2氧化程度和氧含量對石墨烯量子點活性氧清除能力的影響：氧化程度和氧含量會影響石墨烯基材料的加合物形成、電荷轉移和供氫能力，從而影響其活性氧清除能力。一方面，引入的氧原子可以破壞GQDs原有的結構（電子轉移的主要場所），降低ROS清除能力。然而，另一方面，含氧官能團，例如-OH、C=O和-COOH，可以促進ROS的吸附，并有利于ROS與石墨烯基材料之間加合物的形成和電子轉移[29]。GQDs表面含有豐富的含氧基團，研究表明GQDs表面的含氧基團可以有效清除ROS，并且C-OH和C=O基團比C-O-C基團更具清除ROS的活性[30]。WANG等[31]設計了一種表面富含-OH的類酚基團功能化GQDs具有高效的ROS清除活性，并且在急性腎損傷小鼠模型中，僅使用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（NAC）十六分之一劑量就可以有效保護腎臟免受氧化損傷。

2.3元素摻雜對石墨烯量子點活性氧清除能力的影響：一般來說，摻雜富電子元素（如N、P、Se、S和Cl）可以提高自由基清除能力[32-33]。WANG等[34]合成了氯摻雜的GQDs（Cl-GQDs），其ROS的清除能力是未摻雜GQDs的7倍。RUIZ等[35]發現表面具有豐富含氮基團（C-N和C=N）的GQDs具有極高的供氫能力和抗氧化活性。LI等[36]人報道了磷摻雜的GQDs的DPPH·清除活性（79.1%）是未摻雜GQD（35.5%）的2倍以上。BYEONGTAEK等[37]合成了硫醇化石墨烯量子點（SH-GQDs）能有效清除巨噬細胞內的ROS。

3石墨烯量子點的免疫調節性 ROS是免疫細胞中氧化應激和氧化還原信號轉導的關鍵媒介[38]，GQDs對ROS的調控可能對免疫應答反應產生深遠影響。此外，T細胞、巨噬細胞以及樹突狀細胞（dendritic cell，DC）的功能受到自噬的調控[39-41]。多項研究表明GQDs可誘導細胞自噬[10,42-44]，如圖3。因此，GQDs可能通過清除ROS和誘導自噬兩方面作用調節免疫。

圖3 GQDs誘導自噬的作用機制示意圖

3.1石墨烯量子點與T細胞 T細胞作為最重要的免疫細胞之一，與多種炎性疾病的發生發展有關，研究表明GQDs可影響T細胞亞群的分化發育并緩解炎癥性疾病。VOLAREVIC等[6]利用GQDs治療刀豆球蛋白A（Concanavalin A，ConA）誘導的小鼠自身免疫性肝炎，發現GQDs能抑制T細胞向Th1細胞分化和巨噬細胞活化來緩解炎癥，并且大顆粒GQDs（寬度大于40 nm）和小顆粒GQDs（寬度5～30 nm）表現出相似的治療效果。TOSIC等[45]大鼠神經炎癥模型中，發現GQDs能通過調節MAPK/Akt信號通路和Th1免疫應答來緩解免疫介導的神經系統損傷。

3.2石墨烯量子點與巨噬細胞：巨噬細胞在具有高度功能異質性的先天免疫應答中起著重要作用。它是一種來源于組織中單核細胞的白細胞，能以不動細胞或自由細胞的形式吞噬和消化死亡細胞和入侵病原體的碎片，從而激活淋巴細胞和其他類型的免疫細胞，加速其對入侵病原體作出反應。巨噬細胞將在不同的微環境中極化，產生促進炎癥的經典M1型巨噬細胞和抑制炎癥的選擇性M2型巨噬細胞。ROS有利于誘導M1型促炎巨噬細胞。自噬缺陷導致炎癥M1型巨噬細胞過度激活[46]，因此GQDs的ROS清除作用和自噬誘導作用可能影響巨噬細胞亞群的分化。LEE等[47]發現GQDs可改善右旋糖酐硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導的小鼠結腸炎，并在體內外的試驗中證明了GQDs不僅能夠直接抑制T細胞向Th1和Th17細胞分化，還可通過促進巨噬細胞M0向M2亞型的分化，使小鼠結腸局部調節性T細胞（Treg）的浸潤增加，并間接抑制T細胞向Th1和Th17細胞分化。

3.3石墨烯量子點與DC細胞：抗原遞呈細胞（antigen presenting cell，APC）和T淋巴細胞之間的相互作用是調節免疫反應的關鍵環節。DC是最重要的APC，能夠感知微環境并遷移到淋巴結，從而激活抗原特異性T細胞[48]。除了誘導針對入侵病原體的有效免疫反應外，DC還表現出調節功能，以維持中樞和外周的免疫耐受。耐受性DC與其未成熟表型相關，表面含有少量共刺激分子，并分泌抗炎細胞因子IL-10和TGF-β，促使T細胞分化為抗炎的Treg[49]。DC和T細胞的功能都受自噬調節，并與其他信號通路發生復雜的相互作用[50]。自噬可以限制DCs的成熟及其分泌促炎細胞因子的能力[51-53]。哺乳動物雷帕霉素靶點（mammalian target of rapamycin，mTOR）是細胞自噬的關鍵調節因子[54]，在DC分化發育中也起著關鍵作用。SAID等[52]發現了GQDs誘導耐受性DC細胞來調節免疫功能的機制。GQDs被DC細胞攝取后可通過mTOR依賴的自噬誘導機制抑制人單核細胞源性DC的發育和功能，使其分化為耐受性DC。從而抑制T細胞向Th1和Th17細胞分化，使其向Th2和Treg細胞的分化。此外，研究還發現GQDs不僅降低了DC中活性氧的產生，而且還減少了NF-kB的核轉位，推測可能是對產生耐受性DC細胞起到了積極的作用。但在此研究中并未發現GQDs對T細胞分化的直接影響，這與LEE等[47]的研究結果有出入。

總的來說，GQDs除了能直接影響T細胞的分化發育之外，還能通過作用于巨噬細胞和樹突狀細胞這些具有抗原遞呈作用的細胞間接影響T細胞的分化發育來發揮免疫調節功能，如圖4。

圖4 GQDs調節免疫作用示意圖

4總結與展望 GQDs作為一種碳基納米材料，在藥物輸送、生物傳感、生物成像和光化學治療的應用中得到了廣泛研究，但它的物理化學及生物學特性使它本身成為一種具有治療活性的藥物。GQDs的高水溶性、低毒性、抗氧化性以及免疫調節活性，使它具有治療炎性疾病的潛力。由于炎性疾病的主要治療目標是改善過度的免疫反應，注射的顆粒需要不對免疫系統產生額外的刺激，GQDs的表面結構使其帶有負電荷，許多研究表明帶負電荷的納米顆粒具有低免疫原性[53]。另外，GQDs具有較大的比表面積以及特殊的理化結構（可以與各種官能團、靶向配體和生物活性分子進行結合），是藥物靶向輸送的理想納米載體[2]，有利于提高藥物療效和減少免疫抑制藥物的全身不良反應。例如：KHODADADEI等[57]報道了負載甲氨蝶呤（Methotrexate，MTX）的氮摻雜GQDs納米載體能夠作為有效的抗癌藥物傳遞系統，能夠有效傳遞抗癌藥物至靶細胞，并減少對正常細胞的傷害。目前GQDs的藥物運輸研究主要是腫瘤化療藥物運輸及基因治療，未來GQDs可負載抗體及免疫調節藥物在炎性疾病的治療方面具有巨大的潛力。除此之外，GQDs還具有多種治療活性，抗菌活性、抗阿爾茨海默病、抗帕金森病和抗糖尿病活性也有報道。

需要注意的是GQDs是一種相對較新的材料，目前對于影響GQDs免疫調節影響因素（結構、大小、官能基團等）的研究較少，各個研究的GQDs表征數據存在差異，如QIN等[43]報道的GQDs在THP-1人單核細胞系中誘導氧化應激和促炎癥反應。與前文所述諸多報道：GQDs具有清除ROS和免疫抑制作用不吻合。這可能是由于單一細胞的體外實驗的特殊性或者GQDs的物理化學特征差異造成的。另一方面，短期的體外和生物模型的毒性試驗還遠不足以證明GQDs在哺乳動物甚至人體中的安全性，需要更廣泛和長期的毒理性研究，才確保GQDs更安全更可靠地應用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突