毛細管離心術在胎母血型不一致的臨床大量FMH綜合征的診斷價值*

張源秦 徐璐 馬怡然 楊融輝 郝一文 程大也 叢桂敏

胎母輸血（fetomaternal hemorrhage，FMH）是指一定量的胎兒紅細胞通過破損的胎盤和（或）絨毛膜間隙進入母體血液循環，可以發生在懷孕的各個階段[1]。FMH綜合征指的是出血量較大，引發一系列不同程度的胎兒貧血和母親溶血性失血反應的一種臨床癥候群[2]。國內外尚無大量FMH的出血量普遍接受的診斷閾值，目前普遍認為胎兒出血量≥30 mL對孕產婦血型免疫（特別是RhD抗原的同種免疫）、胎兒及新生兒預后具有意義[3-4]。大量FMH的診斷主要依靠流式細胞術、酸洗脫實驗和HbF測定等，由于對實驗設備和專業技術人員的要求高且操作復雜，難以在臨床常規開展[5-6]。我們前期通過在體外模擬實驗發現毛細管離心術對胎母ABO血型不一致的大量FMH具有一定的診斷價值[7]。本研究通過選取臨床疑似為大量FMH綜合征的臨床標本對上述指標進行驗證，以評估毛細管離心術對胎母血型不一致的大量FMH綜合征的輔助診斷價值、臨床適用性。

資料與方法

1一般資料 選取2020年7月～2021年7月在中國醫科大學附屬第一醫院和沈陽市婦嬰醫院產科分娩，臨床有大量FMH綜合征典型表現的孕產婦25例。本研究獲得中國醫科大學附屬第一醫院倫理委員會及相關合作部門的批準（倫理批號: AF-SOP-07-1.1-01），所有孕產婦常規實驗均知情同意并簽署相關知情同意書，充分了解檢測目的和過程以及可能存在的風險。

2病例納入標準與排除標準 納入標準：1）孕婦出現不明原因死胎；2）孕婦主訴胎動減少或消失；3）胎心監護異常（出現正弦波、胎心基線變異減少、晚期減速）；4）B超提示胎兒生長受限、胎兒貧血、水腫和（或）肝脾腫大；5）血管彩超發現MCA-PSV≥1.5 MoM ；6）新生兒進行性貧血；7）孕婦門診為O型（丈夫血型為A型、B型或AB型）或孕婦門診血型為RhD陰性（丈夫血型為RhD陽性）且產后母親與新生兒血型不一致；滿足1和7或2、3、4和7的臨床表現、超聲高度懷疑胎母輸血綜合征。

排除標準：1）血液?。ㄈ邕z傳性血紅蛋白病、鐮狀細胞性貧血和β-地中海貧血等）；2）惡性腫瘤??；3）有腦部或精神類疾病患者；4）近三個月有輸血史的孕婦；5）拒絕抽血配合者，資料不全。

3方法 所有納入研究的可疑大量FMH的孕產婦同時行流式細胞術和毛細管離心術兩種方法加以相互印證。

3.1毛細管離心術

1）將孕產婦新鮮EDTA-K2抗凝血用生理鹽水洗滌3次，最后1次用1 000 g離心9 min，盡可能去掉上清后混勻；

2）將洗滌后的RBC吸出后混勻，加入2根比積管，留出5 mm長度封口備用；

3）血液加入端用橡皮泥封死管底，擠出的血液用紗布吸走，放入帶有編號的離心槽，注意平衡，擰緊內蓋，關上離心機外蓋12 000 r/min離心20 min；

4）在距紅細胞柱頂（遠心端）5 mm處切開微量紅細胞比積管，此段紅細胞主要為胎兒紅細胞；在距紅細胞柱底（近心端）5 mm處切開微量紅細胞比積管，此段紅細胞主要為母體新鮮紅細胞。近心端、遠心端切開的紅細胞比積管用生理鹽水洗滌3次后進行試管法ABO血型正定型鑒定。

5）采用試管法對分離的遠心端紅細胞及近心端紅細胞進行ABO血型正定型檢測，如果不一致，表明毛細管離心術實驗陽性，提示此孕婦發生了大量FMH。近心端紅細胞ABO血型鑒定結果為O型，遠心端紅細胞ABO血型鑒定結果與臍帶血標本中的紅細胞血型一致（A型或B型）時證明毛細管離心技術分離成功。

以上參考《AABB技術手冊》和《輸血技術操作規程（輸血科部分）》[8-9]。

3.2胎兒血紅蛋白HbF的流式檢測

1）用O型育齡期非妊娠健康女性捐獻者EDTAK2抗凝血2 mL加入容量占比為5%的臍帶血作為質量控制標本（陽性對照和陰性對照）；

2）實驗血標本和對照血標本（孕產婦新鮮EDTA-K2抗凝血）的RBC計數在血常規計數儀上測定，并用PH=7.4的PBS調節至終濃度為2.5×106/mL；

3）取2×107個RBC在室溫下用pH=7.4的PBS新配置成0.05%戊二醛溶液固定10 min；

4）用PBS將細胞洗滌3次，并在室溫下用0.1%TritonX-100的PBS滲透5 min；

5）用PBS將細胞再次清洗后，試驗管和陽性對照管?。?～2）×105個細胞與10 μL抗HbF抗體混合；陰性對照管?。?～2）×105個細胞與10 μL PBS混合；

6）各管均補充加入70 μL 0.1%牛血清白蛋白（PBS-BSA），將細胞在黑暗中干燥15 min；

7）用PBS將細胞洗滌3次，然后重懸于0.5 mL的1%多聚甲醛中，并在8 h內上機檢測；

8）在Flowjo上分析計算胎兒血紅蛋白HbF占比；

以上參考文獻[10-11]。

3.3胎兒出血量的計算：流式分析檢測的胎兒出血量=孕婦血容量×胎兒HbF（%）[12-13]。

4指標觀察與數據收集 通過查閱臨床電子病歷系統，記錄孕產婦年齡、胎齡、孕產次、主要診斷、胎心監護和計數胎動情況；記錄新生兒Apgar評分、主要診斷、治療及預后。

5統計學分析 所有數據均采用SPSS26.0進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，計數資料以例數、百分比（n，%）表示；以流式細胞術結果為金標準計算毛細管離心術的靈敏度、特異度、陽性預測值、陽性似然比和符合率。

結果

1大量FMH綜合征孕產婦一般情況 2020年7月～2021年7月于中國醫科大學附屬第一醫院和沈陽市婦嬰醫院產科分娩的孕產婦共12 017名。臨床表現疑似大量FMH綜合征25例，其中流式確診出血量≥30 mL的FMH綜合征孕產婦有15例，大量FMH綜合征的發病率為1.25‰；15例大量FMH綜合征中11例用毛細管離心術分離并鑒定出遠心端胎兒紅細胞血型。上述15例大量FMH綜合征的年齡范圍27～45歲，平均年齡33.73±4.83歲；孕次1～7次，平均懷孕3.2±1.373次；孕周33+6～39+2，平均孕周38.01±1.48；均為經產婦，剖宮產。15例大量FMH綜合征均出現不同程度的胎心監護異常，其中13例出現胎動減少，見表1。

2新生兒情況 在15例出血量≥30 mL的大量FMH綜合征的孕產婦中，有14例足月兒，1例出生時發生宮內死產。體重范圍為1 500～3 810 g，平均體重2 685±727 g。2例發生新生兒Rh溶血（母嬰Rh血型不合；新生兒溶血三項實驗中，抗體釋放試驗和直接抗球蛋白實驗陽性），8例高膽紅素血癥（早產兒血清膽紅素＞225 μmol/L，足月兒血清膽紅素＞220.6 μmol/L，每日膽紅素升高超過85 μmol/L）[14]，5例顱內出血，2例呼吸困難、窒息，13例經過了輸血等治療恢復良好后出院。新生兒死亡率13.35%（2/15），見表2。

表2 新生兒一般情況

3毛細管離心術在大量FMH綜合征（FMH≥30mL）的診斷結果 在25例高度懷疑發生大量FMH綜合征的孕婦中，胎兒出血量≥30 mL有15例，其中13例胎兒與母親ABO血型不一致，2例胎兒與母親RhD血型不一致，毛細管檢測出近心端與遠心端血型不一致的陽性有11例且與產后胎母血型一致，詳見表3。

表3 毛細管離心術診斷結果

4毛細管離心術在大量FMH綜合征（出血量≥30 mL）的診斷效能評價 在25例高度懷疑發生大量FMH綜合征的孕婦中，胎兒出血量≥30 mL有15例。毛細管檢測出近心端與遠心端血型不一致的陽性有15例，其中胎兒出血量≥30 mL有11例，還有4例胎兒出血量＜30 mL也出現了毛細管近心端遠心端不一致的結果。因此，毛細管離心術在大量FMH 綜合征（出血量≥30 mL）敏感度、特異度、陽性預測值、陽性似然比、符合率，見表4。

表4 毛細管離心術對FMH綜合征（出血量≥30 mL）診斷性效能評價

討論

大量FMH綜合征，如急性失血量超過胎兒血容量的50%，可導致胎兒發生低血容量休克和心衰、甚至死亡；慢性失血時可出現除胎盤外的胎兒水腫、胎兒宮內發育遲緩甚至胎死宮內。慢性FMH的胎兒即使存活，可能會出現新生兒貧血、足月小樣兒。此外，胎母血型不一致的大量FMH是造成孕婦同種免疫及新生兒溶血病發生的重要機制之一[15]。大量FMH刺激母體產生大量IgG抗體可導致胎兒嚴重溶血、甚至新生兒溶血病和高膽紅素血癥的發生、中樞神經系統損害、呼吸窘迫、持續性肺動脈高壓、失血性休克或死產等[16-20]。大量FMH發生時，母親可因胎母血型不合而發生溶血，出現發熱、寒戰等溶血性輸血反應。

在15例出血量≥30 mL的大量FMH綜合征孕婦中，有2例妊娠糖尿病，2例妊娠貧血，1例完全性前置胎盤，2例抗篩陽性（存在抗D抗體）；有13例出現了胎動減少，2例出現了胎動頻繁；15例均出現胎心監護異常，3例出現正弦曲線，4例無反應或反應差，5例出現減速，4例變異或變異差；14例新生兒均發生不同程度貧血，1例胎死宮內，1例重度貧血放棄治療，新生兒死亡率為13.3%（2/15）；8例出生后高膽紅素血癥，2例Rh系統溶血，2例出現呼吸困難和窒息，3例出現顱內出血，1例凝血功能異常；13例新生兒出現了不同程度的貧血，經過少量多次的輸血治療后預后較好。綜上可見，大量FMH綜合征嚴重危害胎兒和新生兒的健康和生命安全。

本研究以流式細胞術為金標準，流式細胞術診斷出血量≥30 mL的胎母輸血綜合征有15例，同步進行毛細管離心術檢測，其中有11例出現了近心端和遠心端胎母血型不一致的陽性結果，還有4例胎兒出血量＜30 mL母親體重較輕血容量小也出現了毛細管近心端遠心端不一致的結果。毛細管離心術在臨床病例的大量FMH（出血量≥30 mL）的敏感度為73.3%，特異度60%，陽性預測值73.3%，符合率60%等指標都高于我們前期模擬實驗中兩個大量FMH組對應指標數值[6]，說明毛細管離心術在臨床大量FMH病例的篩查效能更高。分析原因可能為模擬實驗中孕婦血容量較大，胎兒紅細胞在母血中所占比容較低；臨床病例的被檢孕婦血容量比模擬實驗的血容量普遍較低，胎兒紅細胞在母血中所占比容較高，更容易被毛細管離心所分離。毛細管離心術靈敏度為73.3%，如果實驗結果陰性，也不能排除FMH綜合征，應予以密切監護，必要時進行流式分析等其他檢測方法加以實驗室診斷；如果實驗結果陽性，基本能證實胎兒出血量比較大，應予以密切監護，指導產科醫生盡早干預并進行下一步治療。

本研究中有4例孕產婦發生大量FMH綜合征且胎兒出血量≥30 mL，毛細管離心術并未出現陽性結果，分析原因可能是部分孕產婦發現時已經發生了嚴重的大量FMH綜合征，檢測時距離發生胎母輸血的時間過長，胎兒紅細胞被母親體內免疫性抗體破壞清除，以至于未檢測出胎兒紅細胞。PENG[21]通過體外模擬大量FMH模型發現當攜帶父親抗原的胎兒紅細胞（最重要的是ABO系統血型抗原）可能與母體的血漿不相容，可能被母親體內天然的抗體清除。KIM[17]也認為在O型母體攜帶A、B或AB型胎兒的體內，天然存在異型抗血清會加速母體循環中胎兒紅細胞的清除，因此在夫婦ABO血型不相容的情況下，建議在高度懷疑FMH綜合征時應立即進行試驗。

隨著我國“三胎”政策的放開，FMH、大量FMH綜合征的發病率會顯著增加，因此大量FMH的早期診斷和早期干預是改善妊娠結局、保障孕產婦、胎兒及新生兒身體健康的必要措施。雖然毛細管離心術不是診斷FMH綜合征的金標準，但對在臨床上出現可疑FMH綜合征的臨床表現的大量篩查對預防胎母同種免疫可能至關重要。如果不能及時識別及診斷FMH綜合征，不及時進行干預及治療，可能導致胎兒及新生兒不良結局。我們建議有高危FMH風險且夫婦血型不一致的孕產婦，若孕婦產前血型已知，排除ABO亞型和抗原減弱等情況下，在妊娠中晚期用毛細管分離發現母體ABO的異型血細胞抗原，毛細管離心術實驗結果陽性，結合FMH綜合征的臨床表現，可以認為發生了大量FMH綜合征，指導產科醫生早期進行干預及進一步治療（如終止妊娠或輸血治療或保胎治療），避免了漏診和誤診。毛細管離心術簡便、快速、易操作、不需要復雜的試劑，無侵入性，1～2 h即可回報結果，特別是在一些偏遠地區缺乏FMH確診的金標準時，更有可行性和經濟適應性。

胎母血型不合的FMH綜合征包括ABO血型不合、Rh血型不合及其他稀有血型不合。本臨床研究僅針對胎母ABO血型系統和RhD血型進行了毛細管離心術的分離及檢測研究，對于夫妻ABO血型一致，但其他血型系統不一致的FMH沒有進行檢測及研究。后期我們將增加高危FMH的毛細管離心術的檢測病例數，了解臨床真實的FMH發病率，特別是有臨床意義的大量FMH發病率；對毛細管離心術篩查陰性病例但高度懷疑的FMH病例增加其他血型系統的檢測，提高檢出率，并探討研究毛細管離心術結合ABO血型及其他血型檢測對FMH綜合征的出血量檢出閾值、篩查的靈敏度及特異性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突