腫瘤新抗原肽誘導獻血者PBMC特異反應性T細胞*

楊穎 路麗明 李勤 郭忠慧 楊啟修 張嘉敏 趙俸涌 王晨 朱自嚴

T細胞相關的細胞免疫治療[1]目前已被證實可用于治療實體腫瘤[2]和血液腫瘤[3]，如CAR-T（chimeric antigen receptor-T）治療[4-7]、抗PD-1[8-9]等，而利用腫瘤新抗原制備特異T細胞，并加以回輸也可緩解腫瘤黑色素瘤生長以及胸腺瘤等[10-12]等。而以上治療大多數基于自體T細胞的改造和加工，受限于腫瘤患者疾病狀態，如腫瘤患者無法耐受大量采血，或自身免疫細胞已被腫瘤負載所耗竭[13]，可能無法進行這種治療。針對以上問題，本研究使用來自于健康獻血者的PBMC作為制備原料，用腫瘤患者來源的腫瘤組織，先制備獲得腫瘤細胞，再測序獲得新抗原序列，然后人工合成這些抗原肽，在體外利用健康獻血者的PBMC在誘導DC后裝載抗原肽，進而刺激PBMC中的PBL，使其增殖分化為針對腫瘤新抗原特異反應性T細胞[14]，期望以上T細胞可通過細胞毒作用而起到殺瘤效果。

材料與方法

1實驗材料與儀器 24孔COSTAR細胞培養板（批號16218055，美國Corning公司）96孔COSTAR細胞培養板（批號16221601，美國Corning公司），75cm2培養瓶（批號30420601，美國Corning公司），完全培養劑含RPMI1640（批號05118006，美國Corning公司）90%、10% FBS（批號35081002，美國Corning公司）、青霉素10 IU/mL、10 μg/mL鏈霉素，細胞置于37℃、5% CO2培養箱培養；GMCSF（批號111930、011830，工作濃度為0.1 μg/μL，10 μL，美國Peprotech公司）；IL-4（批號051914、041814，工作濃度0.1 μg/μL，10 μL，美國Peprotech公司）；IL-2（批號091912，工作濃度40 IU/μL，美國Peprotech公司）。RayBio human IFN -gamma ELISA kit（批號：0506220131，0212210131，美國RayBiotech公司）；BFA/Monensin Mixture（250×，布雷非德菌素A/莫能霉素混合物，聯科生物，70-CS1002），BFA（批號M2294-03，AbMole中國），Ionomycin（批號5608212，美國Biogems公司），PHA（植物血凝素，批號SLBZ9469，美國Sigma公司），LPS（脂多糖，批號L4130，美國Sigma公司），破膜固定劑（批號GAS003/2，聯科生物）；Fc block（MTG-001，批號10，MBL公司）；DNA抽提試劑（血液基因組DNA提取試劑盒，上海天根公司）；流式抗體見表1。5% CO2培養箱（三洋MCO-18AC，日本松下公司）；流式細胞儀（FACSVerse，美國BD公司；CytoFLEX，美國貝克曼庫尓特公司）；化學發光儀（SpectraMax i3X，美國Molecuar Devices）。

表1 本實驗所用流式標記抗體

腫瘤抗原肽（LM1-LM11，LM13-LM14）委托上海生工合成并分裝為1 mg/支，腫瘤抗原肽NSLC、NSLC-Cl、NSLC-st[12]委托南京金斯瑞公司合成并分裝為1 mg/支。

2單個核細胞（PBMC）制備及定向誘導DC細胞 當日采集的隨機健康獻血者富含白細胞的白膜血，用淋巴細胞分離液進行密度梯度離心分離，進行細胞計數及活力測定后，用1640重懸后加入75 cm2培養瓶，于37℃ 5% CO2培養箱靜置數小時，然后用1640吹打2遍后，收集不貼壁細胞，于37℃5% CO2培養箱培養過夜，次日凍存于-80℃冰箱作為PBL；75 cm2培養瓶中剩余貼壁細胞則加入完全細胞培養劑，并加入GM-CSF、IL-4各10 μL（0.1 μg/μL），于37℃5%CO2培養箱培養，用于誘導DC，每三天進行半量換液，并加入GM-CSF、IL-4同前，Day 5加LPS；Day 6復蘇PBL備用；Day 7收集DC細胞，計數并用1640調整DC細胞為0.5×105～1×105/mL，接種于24孔板，每孔0.5～1 mL，共20孔，4孔留待備用PBL孔，剩余的DC用流式進行DC特征分析。如果用96孔細胞板代替24孔板，則所有試劑和細胞均用原來的1/5體系，所有孔均設置復孔，操作均與24孔板相同，不再另外贅述。

3DC細胞裝載腫瘤抗原肽并誘導淋巴細胞分化為腫瘤抗原肽特異T細胞 在上述已分裝好DC的24孔板中每孔加入一種腫瘤抗原肽10 μL（2 μg/μL）作為實驗組，并設置無肽孔、單獨PBL孔各4孔，分別用于基準對照組、以及備用加PHA作為陽性刺激對照組，視細胞數量，對照組復孔數可調整，一般不得少于2孔，37℃ 5% CO2培養箱孵育5 h，取出復蘇12 h以上的PBL，調整為DC的 4～10倍細胞密度，每孔加入等體積PBL，繼續于37℃ CO2培養箱培養，48～72 h后加入IL-2，終濃度為20～40 IU/mL，每三天進行半量換液，并補充IL-2。Day14加入腫瘤抗原肽，劑量同前；Day 21則用達科為無血清培養基0.5 mL重懸細胞，再加入腫瘤抗原肽，劑量同前，單獨PBL孔加PHA 作為陽性對照孔，37℃ 5% CO2培養箱培養，16 h后加入BFA/Monensin 各2 μL，或BFA（0.5 mg/mL）/Ionomycin（50 μg/mL）各2 μL，繼續37℃ 5%CO2培養箱培養6 h后取出，留取上清液100～200 μL/孔。

4腫瘤抗原肽特異T細胞反應性 上述24孔細胞板每孔分別加入Fc block 2 μL，并各取4孔（使用單獨PBL孔、無肽孔）分別用于不染、FITC、APC、PE單染，室溫20 min后加入FITC-CD3APC-CD8抗體，室溫30 min，然后根據聯科破膜試劑盒所示，分別進行染色固定破膜，并加入胞內染色熒光抗體PE抗IFN-γ，室溫30 min后，洗滌后用于流式分析。

5流式細胞儀分析DC特征或T細胞反應性 所有實驗均設置無熒光標記的空白管，多色熒光標記時每一熒光分別設置單色標記對照，必要時加上同型對照。根據不染管、單標管，調整細胞選取門和閾值，流式細胞儀（FACSVerse，美國BD公司）、至少讀取10 000個細胞（Events）后記錄結果；CytoFLEX至少讀取5 000個細胞（Events）后記錄結果。

5.1DC特征分析：分幾組進行流式抗體標記設置以下幾種染色組合①APC-CD80、FITC-CD86、PECD83；②APC-HLA-I、PE-CD14、FITC-CD1a；③APC-CD123、PE-CD49f、FITC-CD86；④APCCD56、PE-CD64、FITC-DR；組合①為必選，②～④根據DC數量，選擇性選取，加入抗體孵育30 min，PBS洗滌2～3次后進行流式分析，并另取一孔進行7-ADD 單獨染死活細胞。

5.2T細胞反應性分析：主要觀察CD3+IFN-γ+/CD8+IFN-γ+T細胞群占比，這些細胞代表分泌IFN-γ的反應性T細胞。

6ELISA法分析細胞培養板中IFN-γ含量 按照廠商說明操作，用1.3中所留取的上清液進行IFN-γ含量測定，并同步用標準品建立標準曲線，用SpectraMax i3X儀器自帶軟件計算得到擬合方程和擬合度，并計算出各待測樣品的IFN-γ濃度。

7統計學處理 采用IBM SPSS Statistics 20進行相關統計分析，所有實驗結論都經至少三次的獨立實驗證實。

結果

1DC細胞分析 可觀察到本實驗用PBMC誘導成熟DC，其HLA-I、HLA-DR、CD86、CD83、CD80均為高表達（圖1），符合成熟DC細胞特征，DC占比不同健康個體樣品具有差異，誘導率為5%～30%。除了以上標記以外，這些樣品還進行了CD1a、CD3、CD14、CD16、CD49f、CD56、CD64、CD123等標記的檢測，其中CD1a、CD14在不同樣品中呈現出不同的陽性比例，CD49f為部分陽性，CD3、CD16、CD56、CD64、CD123基本以陰性為主。

圖1 獻血者來源PBMC誘導培養為成熟的DC細胞

2不同腫瘤抗原肽誘導的T細胞反應性 用不同腫瘤抗原肽裝載DC后和PBL共培養后，我們可以觀察到裝載多肽LM5等多組，IFN-γ+CD3+的T細胞明顯增多（圖2 DMSO-LM5），甚至比PHA刺激陽性對照組（圖2 PHA10）更明顯，而顯示裝載多肽NSLC-ST后的分泌IFN-γ+的CD3+T細胞占比差別無明顯區別。由于所有實驗孔采用的起始細胞量、涉及的試劑、操作、環境均為一致的，只有裝載多肽有區別，說明IFN-γ+T細胞占比不同是因加入的抗原肽不同而異。

圖2 裝載腫瘤抗原肽的DC刺激PBL誘導為分泌IFN-γ的T細胞

3上清液IFN-γ的ELISA結果和CD3+IFN-γ+/CD8+IFN-γ+T細胞比較 利用上清液進行IFN-γ的ELISA分析，測定濃度列于表2，和流式細胞分析結果進行比較并作了相關分析，圖3a、3b是流式結果的截圖，具體細胞占比也一并列于表2。

圖3a FITC-CD3PE-IFN-γ染色后T細胞群

圖3b APC-CD8PE-IFN-γ染色后的T細胞群

表2 A8樣品的IFN-γ ELISA測定濃度與IFN-γ+T細胞比值的比較和相關系數

從表2中可以看到，除陽性對照外，三組中LM2、LM4、LM10、LM13也呈現出比較一致的高IFN-γ，而LM3、LM6組具有部分結果升高，但并沒有3組線性同比例增高，可能流式分析的是封閉在細胞內的IFN-γ，而上清液中IFN-γ濃度則是在多肽刺激后前16 h內已經分泌釋放到細胞外的，上清液和細胞胞內標志具有時間上的不同步性，反應性高的細胞分泌快，事實上實驗中設置的LM3復孔也是同樣的情況。IFN-γ濃度和IFN-γ+CD3+T細胞比值相關系數達到0.66，和IFN-γ+CD8T細胞比值相關系數達到0.58，為中等相關，且均具有統計學顯著意義，類似相關結果在其他具有細胞反應增高的多份標本中也得到證實，說明上清液中直接測定IFN-γ濃度也可作為檢測細胞反應性的一種實驗工具。

4獻血者PBMC對于新抗原肽的總體反應性 本研究發現可誘導3份或3份以上PBMC產生反應性T細胞的新抗原肽包括LM2、LM3、LM4、LM5、LM6、LM7、LM9、LM10、LM11、LM13，占10/13；但不同PBMC對應具有反應性的多肽數量差異性較大，根據文獻[15]，我們也采用相同的標準：具有反應性的定義是CD8+IFN-γ+T細胞或CD3+IFN-γ+T細胞數增加超過基準對照組2倍。而部分個體具有較廣泛的高反應性，超過基準組10倍，其臨床或醫學意義需要留待進一步探討。

圖4 不同多肽在不同PBMC中誘導產生細胞毒性T細胞的能力比較

討論

最近的細胞免疫治療包括腫瘤疫苗研制等為征服腫瘤提供了曙光，尤其是CAR-T等細胞治療產品，正式獲得臨床試驗許可，彰顯了其應用價值，但目前僅限于血液系統的腫瘤[3-6]，而實體腫瘤治療的免疫治療手段依然需要進一步的研究[2，10，15]。腫瘤臨床治療領域另一個新的熱點-基于免疫檢查點阻斷的治療性抗體也具有明顯療效，但僅在20%的患者人群中有效[8]，且有效性也可能因突變而不同[16]，已有實驗證實可通過腫瘤新抗原作為疫苗可誘導獲得抗腫瘤治療效果[10-15，17]，而免疫檢查點阻斷的治療和腫瘤新抗原誘導T細胞抗瘤等幾種聯合治療目前認為可能具有良好效果[18]，但采集自腫瘤患者的自身細胞，可能具有免疫反應能力低下、采集量有限等缺點，其有效反應株可在病程發展中被不斷耗竭[1，13，19-20]，而從健康獻血者處分離獲取免疫細胞具有數量眾多、可重復采集、細胞兼有多樣性，可打擊腫瘤的不同抗原、可預先制備儲存，以利緊急使用等優點，雖然目前沒有得到共識，但考慮到本研究的實驗流程所制備獲取的腫瘤新抗原特異性T細胞是經過抗原肽數次定向誘導活化的，不再是免疫幼稚期，因而我們認為其中具有再次被誘導分化針對未來的同種宿主的克隆株已被大幅清除了[14，23]，所以其誘導移植物抗宿主病的能力應該相對低下；另一方面，健康獻血者來源PBMC，大部分T細胞只有經過合適的DC誘導“教育”，才可能具備針對DC誘導提呈抗原肽的T細胞克隆[14，23-27]。

有鑒于此，我們設計了本研究，利用腫瘤患者的腫瘤組織獲取單細胞，根據單細胞測序得到的序列合成新抗原肽，再用MHC多樣化的眾多健康獻血者來源PBMC作為實驗細胞，通過誘導培養成熟DC裝載新抗原肽，“教育”Na?ve T細胞獲得識別抗原肽的能力并活化增殖成熟，從而獲得抗腫瘤抗原肽的能力。我們的實驗也證實了獻血者的PBMC可被誘導而產生明顯的活化狀態，17位獻血者中的13位，他們的PBMC能使用本團隊獲得的新抗原肽而誘導出明顯的反應性T，而13種新抗原多肽中有10種至少在3份血樣中可誘導得到反應性T細胞，如LM3、LM4、LM5、LM7、LM13等，可能因為健康獻血員的血樣具有更高殺瘤潛力。

同時我們的實驗也表明ELISA法測量IFN-γ濃度也是可行的，在多肽刺激后16 h進行的封閉，并不影響大部分實驗樣本已分泌出部分IFN-γ，濃度已處于可測范圍內，且結果和流式細胞學分析具有一定的相關性?？紤]ELISA實驗的簡便性和實驗檢材的易保存特征，IFN-γ濃度測定有望可增加作為細胞毒性或反應性T細胞檢測輔助篩選手段之一。

我們也關注到實驗過程中有些個體差異非常明顯，如PHA刺激T細胞反應性，有的樣品能分泌出高達2 000 pg/mL的IFN-γ，而同樣條件下有的樣品只分泌出100 pg/mL，健康獻血員中這種受刺激后高表達細胞因子的傾向，有何實際意義尚不得知，是否和感染后容易產生細胞因子風暴有關或者具有更高的抵抗腫瘤發生能力，都需要進一步研究。

本研究希望能利用血液中心的特點——廣泛而不間斷的獻血者來源，具備多樣化HLA特征而且可以預先凍存等優勢，為腫瘤的治療提供新的資源和方法，使得健康獻血員來源PBMC得到更有效的利用，先利用腫瘤組織獲取腫瘤新抗原，進行腫瘤疫苗的“量身訂做”，再從眾多凍存預制的庫存中篩選出符合不同病人的細胞資源，根據MHC匹配或部分匹配原則，制造出合適的抗瘤細胞，過繼輸注或局部注射給病人進行后續治療，從而造福人類。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

（致謝：資金資助方：中國輸血協會威高重點CSBT-MWG-2020-01；上海市衛健委面上項目202040503 ；東南大學免疫系沈傳來教授給予的實驗幫助）