血清白介素-10、胸苷激酶1在急性淋巴細胞白血病患兒中的表達及與危險度分層的相關性

宋春艷 林云碧 雷慶齡 呂瑜 肖祖剛

急性淋巴細胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）是一種惡性克隆性疾病，該疾病的發病機制復雜，臨床多認為與基因改變、遺傳因素等密切相關[1]。目前，臨床對于ALL的治療手段較多，包括化療、造血干細胞移植及免疫治療等，但ALL仍具有一定的復發及病死風險[2]。研究指出，臨床依據ALL患兒病情、治療反應等情況，可將患兒分為低危、中危和高危3種危險度分層，在治療前進行充分的危險度分層，對于選擇合理的治療路徑尤為重要[3]。因此，積極探討分析與ALL患兒危險度分層相關的指標，有利于準確判斷患兒病情，并為后續治療提供新思路，更有助于后續治療方案的優化。相關研究指出，細胞免疫功能在ALL的發生、發展過程中發揮關鍵性作用[4]。血清白介素（Interleukin，IL）-10是一種多細胞源、多功能的細胞因子，可參與調節細胞的生長與分化、炎性反應和免疫反應等病理生理過程，在急性白血病患者中存在明顯異常[5]。另有研究指出，骨髓異常增殖與ALL發病有關[6]。胸苷激酶1（thymidine kinase 1，TK1）是一種在分裂的細胞內表達的激酶，可參與催化胸苷磷酸化補救途徑，是細胞增殖的標志物，主要用于檢測體內細胞異常增殖速度[7]。因此，結合IL-10、TK1與免疫功能、細胞增殖的關系，推測IL-10、TK1在ALL患兒中存在異常表達，且與患兒危險度分層存在一定的關系?；诖?，本研究重點分析血清IL-10、TK1在ALL患兒中的表達及其與患兒危險度分層的相關性，為病情評估提供依據，并為后續ALL治療提供新的靶點。

資料與方法

1樣本量計算 參照下列樣本量公式估算樣本量：，其中n代表總樣本量，P代表總體比例的估計值，δ代表總體比例估計值的容許誤差；經查閱文獻獲取估計值，ALL發病率為0.35%，檢驗方式為雙側檢驗，α（檢驗水準）為0.05，μα取1.96，容許誤差為1.5%，得出最小樣本量為60例，以失訪率為20%計算，則最少需要71例樣本，故本研究共納入100例患兒進行研究。

2一般資料 研究實施已獲得醫院倫理委員會的批準同意。選取2018年5月～2021年5月醫院收治的100例ALL患兒作為研究對象，全部患兒家屬對研究內容知情，且簽署同意書。納入標準：（1）ALL符合《兒童急性淋巴細胞白血病診療建議（第四次修訂）》[8]中相關診斷標準，且經骨髓象、血液檢查等確診；（2）年齡≤16歲；（3）新發ALL。排除標準：（1）伴有心、肝、腎等臟器功能不全；（2）伴有先天性心臟??；（3）既往有放療、化療和生物學治療史；（4）合并其他惡性腫瘤；（5）繼發性免疫缺陷??；（6）伴有唐氏綜合征；（7）合并其他血液系統疾病和自身免疫性疾病的患兒；（8）伴有視力、聽力等障礙；（9）預計生存期≤3個月；（10）伴有神志不清或精神障礙患兒；（11）成熟B細胞型ALL。100例患兒中男60例，女40例；年齡1～12歲，平均年齡（5.81±0.46）歲；身高67～161 cm，平均身高（112.51±8.79）cm；體重6～56 kg，平均體重（31.06±3.51）kg。

3方法

3.1治療方法：參照《兒童急性淋巴細胞白血病診療建議（第四次修訂）》中相關內容，全部患兒在確診后均接受VDLP（B-ALL）或VDLD（T-ALL）治療方案，VDLP方案內容包括長春新堿[靜脈注射，1.5 mg/（m2·d），d8，d15，d22，d29]、柔紅霉素[靜脈滴注，30 mg/（m2·d），LR：d8，d15，IR和HR：d8，d15，d22，d29]、培門冬酶，肌注，2 500 IU/（m2·d），d9、d23共2次；潑尼松，口服，60 mg/（m2·d），d1～d28]治療。VDLD方案包括長春新堿[靜脈注射，1.5 mg/（m2·d），d8，d15，d22，d29]、柔紅霉素[靜脈滴注，30 mg/（m2·d），LR：d8，d15，IR和HR：d8，d15，d22，d29]、培門冬酶，肌注，2 500 IU/（m2·d），d9、d23共2次；潑尼松，口服，60 mg/（m2·d），d1～d7和地塞米松6 mg/（m2·d），d8～d28，口服，d29起用藥量每2天減半，1周內減停]治療。低度、中度和高度危險：鞘注甲氨蝶呤d1，三聯鞘注d15，d33。

3.2ALL患兒的危險度分層判定及分組方法：參照《國家臨床路徑》[9]中相關內容，將全部患兒分為標危組、中危組和高危組。判定標準：標危組必須同時滿足以下所有條件：（1）年齡≥1歲且＜10歲；（2）白細胞計數（white blood cell，WBC）＜50×109/L；（3）非急性T淋巴細胞白血??；（4）非成熟B細胞型ALL；（5）無t（9；22）或BCR/ABL融合基因；無t（4；11）或MLL/AF4融合基因；無t（1；19）或E2A/PBX1融合基因；（6）治療第15天骨髓呈M1（原幼淋細胞＜5%）或M2（原幼淋細胞5%～25%），第33天骨髓完全緩解。中危必須同時滿足以下4個條件：（1）無t（9；22）或BCR/ABL融合基因；（2）中樞白血病或和睪丸白血??；（3）標危誘導緩解治療第15天骨髓呈M3（原幼淋細胞＞25%）或中危誘導緩解治療第15天骨髓呈M1/M2；（4）如有條件進行微小殘留病檢測，則第33天危險殘留?。?0-2。同時至少符合以下條件之一：（1）WBC≥50×109/L；（2）年齡≥10歲；（3）急性T淋巴細胞白血??；（4）t（1；19）或E2A/PBX1融合基因陽性；（5）年齡＜1歲且無MLL基因重排。高危必須滿足下列條件之一：（1）t（9；22）或BCR/ABL融合基因陽性；（2）t（4；11）或MLL/AF4融合基因陽性；（3）中危誘導緩解治療第15天骨髓呈M3；（4）第33天骨髓形態學未緩解（＞5%），呈M2/M3；（5）如有條件進行微小殘留病檢測，則第33天危險殘留病≥10-2，或第12周危險殘留病≥10-3。

3.3基線資料調查方法：由研究人員設計一般資料調查問卷，詢問患兒家屬，記錄相關內容：（1）性別；（2）年齡；（3）身高、體重（可從病案室調取患兒身高、體重）。

3.4實驗室指標檢測方法：全部患兒均于初診當天采集靜脈血8 mL，分為4支試管。（1）血常規：取1支試管標本，使用日本希森美康XS-800i血細胞分析儀測定血紅蛋白（hemoglobin，Hb）、WBC、紅細胞計數（red blood cell count，RBC）及血小板（blood platelet，PLT）。（2）IL-10：取1支試管標本，經離心機進行離心處理（離心速度3 000 r/min，離心10 min，離心半徑15 cm），離心后取血清待檢。使用上海酶聯的試劑盒，采用酶聯免疫吸附試驗法測定IL-10水平。（3）TK1：取1支試管標本，經離心機進行離心處理（3 500 r/min，5 min，15 cm），離心后取血清待檢。使用海西唐生物科技有限公司的試劑盒，采用酶聯免疫吸附試驗法測定TK1水平。（4）凝血功能：取1支試管樣本，經離心機進行離心處理（3 000 r/min，10 min，15 cm），離心完畢后取血漿待檢。使用深圳市美思康的US-2200血液分析儀測定活化部分凝血酶原時間（activated partial thromboplastin time，APTT）、纖維蛋白原（fibrinogen，FIB）、凝血酶時間（thrombin time，TT）、凝血酶原時間（prothrombin time，PT）水平。

4統計學方法 采用SPSS24.0軟件進行數據處理，全部計量資料均經Shapiro-Wilk正態性檢驗，符合正態分布的資料以表示，組間用獨立樣本t檢驗，多組間用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗；計數資料用百分比表示，采用χ2檢驗；若期望值＜5，則采用連續校正卡方檢驗；血清IL-10、TK1表達與ALL患兒危險度分層之間的相關性采用Kendall's tau-b相關性檢驗；血清IL-10、TK1表達與ALL患兒危險度分層的關系采用Logistic回歸分析檢驗；P＜0.05為差異具有統計學意義。

結果

1ALL患兒危險度分層情況 全部患兒均接受危險度分層評估，其中24例標危，50例中危，26例高危，占比分別為24.00%（24/100），50.00%（50/100），26.00%（26/100）。

23組基線資料對比 3組患兒基線資料對比，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 3組基線資料對比

33組患兒實驗室指標檢測 全部ALL患兒的平均IL-10、TK1表達分別為（9.81±2.94）pg/mL、（4.79±1.35）pmol/L；高危組的IL-10、TK1及WBC計數均高于標危組和中危組，且組間兩兩比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 3組患兒實驗室指標對比（）

表2 3組患兒實驗室指標對比（）

注：與標危組對比，aP＜0.05；與中危組對比，bP＜0.05。

4血清IL-10、TK1及WBC計數與ALL患兒危險度分層的相關性分析 采用Kendall's tau-b相關性分析結果顯示，ALL患兒血清IL-10、TK1及WBC計數與危險度分層之間呈正相關（r＞0，P＜0.05）。見表3。

表3 血清IL-10、TK1及WBC計數與ALL患兒危險度分層的之間的相關性分析

5血清IL-10、TK1及WBC計數與ALL患兒危險度分層關系的多元Logistic回歸分析 將血清IL-10、TK1及WBC計數作為自變量，將ALL患兒危險度分層作為因變量（1=標危，2=中危，3=高危），建立多元Logistic回歸分析結果顯示，血清IL-10、TK1及WBC計數與ALL患兒危險度分層有關（P＜0.05）。相關參數見表4。

表4 血清IL-10、TK1及WBC計數與ALL患兒危險度分層關系的多元Logistic回歸分析結果

討論

作為兒童群體中高發的惡性血液腫瘤，ALL約占全部白血病類型的70%，具有起病急驟、病程短及進展迅速等特點，存在發生感染、貧血、出血等風險[10]。目前，經過規范化的診治，ALL患兒的長期無事件生存率已增長至70%～80%，但仍有少數部分患兒臨床治療效果不理想，發生難治、復發等，對患兒預后產生不良影響[11]。臨床既往通常采用WBC計數、原始/幼稚細胞比例、遺傳學等指標判斷ALL患兒病情、預后等情況，已成為臨床公認指標[12]。但為了更好地評估ALL患兒病情和預后，仍需積極尋找其他與ALL發生、發展密切相關的生物分子標志物，或可為后續治療提供新的靶點。

研究指出，機體免疫功能在白血病的發生、發展過程中發揮關鍵性作用，免疫功能異常不僅是白血病發病的重要原因之一，也會造成白血病患者體內的細胞因子分泌失衡[13]。IL-10是由輔助性T淋巴細胞（T helper cells，Th）2合成、分泌的一種細胞因子，可抑制抗原已致敏的CD4+Th0細胞向Th1細胞分化，進而促使Th0細胞向Th2方向分化，減弱Th1細胞分泌細胞因子的能力，從而抑制機體免疫功能，在腫瘤等疾病的發生、發展中占據重要角色[14]。另有研究指出，白血病進展過程中因克隆性白血病細胞的增殖失控、分化障礙及凋亡受阻等多種作用機制，導致骨髓或其他造血組織中的白血病細胞大量增殖，影響機體正常造血功能，進而引發疾病相關癥狀[15]。B系或T系淋巴細胞大量增殖是ALL的顯著特征，患兒WBC計數明顯升高，且極易發生眼、中樞神經系統等髓外浸潤，增加預后不良的風險[16]。而TK1是一種細胞周期依賴性標志物，主要存在于增殖細胞質中，有研究表明TK1與細胞的增殖密切相關，其能夠敏感反映細胞增殖異常，動態評估細胞增殖發展趨勢，可用于評估腫瘤增殖速度和分期，與腫瘤發生密切相關[17]。既往研究證明，細胞的增殖速度、DNA的合成與TK1水平變化呈正相關，TK1在細胞分裂的G1期濃度較低，在G1和S期交界處開始逐漸升高，直至S/G2期達到高峰[18]。因此，本研究試圖通過測定有關免疫功能和細胞增殖的血清指標IL-10、TK1水平，研究二者與ALL患兒危險度分層的關系。本研究結果發現，高危組的IL-10、TK1水平均高于標危組和中危組，ALL患兒血清IL-10、TK1水平與危險度分層之間呈正相關，表明ALL患兒的血清IL-10、TK1水平存在異常變化，且血清IL-10、TK1水平與不同危險度分層的ALL患兒存在一定的關系。究其原因：當IL-10水平升高時，機體免疫功能受到抑制，免疫監控能力降低，極易促使白血病細胞發生免疫逃逸，與ALL的發生與發展密切相關[19]。并且，IL-10可抑制炎癥反應，導致細胞毒性T淋巴細胞對免疫無應答，增加免疫功能缺陷的發生風險，促進ALL的發生與發展[20]。TK1與細胞增殖速度有關，當其水平增加時，則提示細胞增殖分裂旺盛，淋巴細胞具有更強的增殖能力和侵襲能力，ALL患兒的危險度分層越高[21]。最后，本研究多元Logistic回歸分析結果顯示，以高危為參照，血清IL-10、TK1表達降低時，ALL患兒危險度分層低的可能性分別為7.128倍、13.572倍，進一步證實，血清IL-10、TK1與ALL患兒危險度分層密切相關。未來或可將血清IL-10、TK1作為評估ALL病情與預后的潛在生物標志物，有較好的應用前景。但本研究也存在一定的局限性，如血清IL-10、TK1二者能否相互作用、相互影響，促進ALL的發生和發展，其中機制尚未完全明確，未來仍需開展更多的研究進一步探索、分析。

綜上所述，血清IL-10、TK1在ALL患兒中存在異常表達，且與危險度分層具有相關性，聯合傳統WBC計數、原始/幼稚細胞比例等檢測有助于更加準確評估ALL患兒的病情，同時也為了解ALL的發病機制和ALL的靶向治療提供新的思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突