自身免疫性肝炎患者外周血T淋巴細胞PD-1/PD-L1表達及其與肝功能指標的相關性

王變 沙敏 肖麗 李陽

自身免疫性肝炎是由自身免疫反應介導的一種慢性肝臟炎癥性疾病，在臨床中以Ⅰ型為主，其若不能得到及時有效控制，可并發肝性腦病、肝硬化等，嚴重者可發展為肝癌，給患者身體健康與生命安全帶來嚴重危害[1-2]。因此，積極探討影響自身免疫性肝炎病情進展的相關因子對臨床評估患者病情及指導治療具有十分重要的意義。目前，該病的病因及發病機制尚未得以完全闡明，但多認為自身免疫異?？赡軈⑴c了疾病的發病過程[3]。已有研究指出，T淋巴細胞調節失控在自身免疫性肝炎的發生發展中起著關鍵作用[4]。程序性死亡因子-1（programmed death-1，PD-1）和程序性死亡因子配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）能夠在T細胞活化以及增殖時供給負性共刺激信號，負調控免疫應答的活化，與自身免疫性疾病、惡性腫瘤免疫逃逸等密切相關[5-6]。相關研究報道，自身免疫性肝炎患者外周血T淋巴細胞中PD-1高表達，可能參與了疾病的發生[7]。根據上述研究，雖然外周血T淋巴細胞中PD-1等在自身肝炎患者中的表達情況已有定論，但關于其表達情況是否與肝功能變化具有一定的相關性尚需進一步探討。鑒于此，本研究旨在探索PD-1、PD-L1表達在自身免疫性肝炎患者病情進展中的意義，以期為該病的發病機制研究及臨床治療提供新方向及理論依據，詳情如下。

資料與方法

1一般資料 經醫院倫理委員會審批（倫理批準號：201512-003），選取2016年1月～2021年7月本院收治的131例自身免疫性肝炎患者設為疾病組，根據配對原則選取同期體檢健康者112例設為對照組，另取93例臨床資料均匹配的肝血管瘤手術患者作為肝血管瘤組。受試對象或家屬均簽署知情同意書。

納入標準：（1）疾病組均符合自身免疫性肝炎診斷標準[8]，經肝活檢確診；（2）根據肝活檢結果將疾病組患者分為輕度（肝活檢顯示，匯管周圍散在片狀壞死，肝小葉存在散在性壞死細胞，少于1/3匯管區有炎癥細胞）、中度（＜50%匯管周圍壞死，1/3～2/3肝小葉內變性，1/3～2/3匯管區有炎癥細胞）與重度（≥50%匯管周圍壞死，＞2/3肝小葉內變性，＞2/3匯管區炎癥細胞密度增加）[9]；（3）患者均處于活動期，疾病類型為Ⅰ型，入院后均常規給予免疫抑制劑、保肝藥物治療；（4）對照組均為體檢健康者，無心肝腎等疾??；（5）肝血管瘤組患者均為行肝血管瘤手術患者，肝功能Child-Pugh分級均為A級；（6）均無免疫抑制劑使用史。

排除標準：（1）酒精性或病毒性肝炎；（2）原發性膽汁性膽管炎、原發性硬化性膽管炎者，或自身免疫性肝炎-原發性膽汁性膽管炎/原發性硬化性膽管炎重疊綜合征；（3）藥物引發肝損傷或遺傳代謝性肝病等；（4）腫瘤；（5）膽結石或膽囊炎等其他肝膽疾??；（6）甲狀腺功能亢進等內分泌疾??；（7）心腦血管疾??；（8）貧血、營養不良；（9）急性感染；（10）免疫系統疾病。

2方法

2.1外周血T淋巴細胞中PD-1、PD-L1表達檢測：均抽取受試者（對照組于體檢時，疾病組于入院第二天，肝血管瘤組于手術前）空腹外周靜脈血2 mL，經EDTA抗凝后，取150 μL全血分三等份，分別加入3支流式管中（A、B、C支），其中A、B支均加入小鼠抗人CD3-PerCP-Cy5.5、CD4-FITC與CD8-FITC單克隆抗體各10 μL，此外A支額外加入10 μL的鼠抗人PD-1-PE單克隆抗體，B支額外加入10 μL的鼠抗人PD-L1-PE單克隆抗體，另C支加入FITC-IgGⅠ、PE-IgGⅠ各10 μL作為同型對照；渦旋后，在室溫下避光孵育30 min，加入450 μL的紅細胞裂解液（經10倍稀釋后），接著在室溫下避光孵育15 min，完全溶血后，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，用300 μL的1%多聚甲醛重新懸浮細胞，立即采用流式細胞儀檢測。用BD Cell Quest軟件分析數據，以FSC與SSC設門進行細胞的讀取，并以CD3和CD4雙陽性圈定記作CD4+T細胞，而以CD3和CD8雙陽性圈定記作CD8+T細胞，分別測定CD4+、CD8+T淋巴細胞的PD-1、PD-L1陽性比例。相關抗體試劑盒均購自美國BD公司，紅細胞裂解液、PBS緩沖液均購自杭州聯科生物技術股份有限公司，流式細胞儀（Cytomics FC 500）購自美國貝克曼公司。

2.2肝功能相關指標檢測：均抽取受試者靜脈血5 mL，離心、分離血清，應用貝克曼AU5800全自動生化分析儀檢測血清總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、直接膽紅素（direct bilirubin，DBIL）、間接膽紅素（indirect bilirubin，IBIL）、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、總蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，ALB）、γ-谷氨酰轉肽酶（gamma glutamyltranspeptidas，GGT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）水平。

3觀察指標

3.1一般資料比較

3.2疾病組、肝血管瘤組、對照組外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞中PD-1、PD-L1表達水平比較。

3.3輕、中、重度自身免疫性肝炎患者外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞中PD-1、PD-L1表達水平比較。

3.4疾病組、肝血管瘤組、對照組肝功能相關指標（TBIL、DBIL、IBIL、ALT、AST、TP、ALB、GGT、ALP）比較。

3.5自身免疫性肝炎外周血T淋巴細胞中PD-1、PD-L1表達水平與肝功能指標的相關性。

3.6不同肝功能Child-Pugh分級自身免疫性肝炎患者外周血T淋巴細胞中PD-1、PD-L1表達情況。

4統計學方法 數據統計學分析采用SPSS 21.0軟件，計量資料以（）表示，獨立樣本采用t檢驗，多樣本計量資料采用單因素方差分析與SNK-q檢驗；計數資料以“例/%”表示，采用χ2檢驗；采用Pearson相關性分析法分析外周血T淋巴細胞中PD-1、PD-L1表達水平與肝功能指標的相關性；P＜0.05表示差異有統計學意義。

結果

1一般資料 三組在性別、年齡方面比較差異無統計學意義（P＞0.05）；疾病組與肝血管瘤組的病程比較差異無統計學意義（P＞0.05）；疾病組與肝血管瘤組的病情嚴重程度、肝功能Child-Pugh分級方面比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 一般資料比較

2疾病組、肝血管瘤組、對照組外周血T淋巴細胞中PD-1、PD-L1表達水平 疾病組外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞中的PD-1、PD-L1表達率均明顯高于肝血管瘤組與對照組（P＜0.05）；肝血管瘤組與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；見表2。

表2 各組外周血T淋巴細胞中PD-1、PD-L1表達水平比較（，%）

表2 各組外周血T淋巴細胞中PD-1、PD-L1表達水平比較（，%）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與肝血管瘤組比較，bP＜0.05。

3輕、中、重度自身免疫性肝炎患者外周血T淋巴細胞中PD-1、PD-L1表達水平 外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞中PD-1、PD-L1表達率在輕度、中度、重度自身免疫性肝炎患者中逐漸升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3和圖1-4。另對照組、肝血管瘤組外周血T淋巴細胞中PD-1、PD-L1表達情況分別見圖5、圖6。

圖1 輕、中、重度患者PD-1/CD4+表達水平（橫坐標均表示CD4+T淋巴細胞，縱坐標均表示PD-1表達情況）

圖2 輕、中、重度患者PD-1/CD8+表達水平（橫坐標均表示CD8+T淋巴細胞，縱坐標均表示PD-1表達情況）

圖3 輕、中、重度患者PD-L1/CD4+表達水平（橫坐標均表示CD4+T淋巴細胞，縱坐標均表示PD-L1表達情況）

圖4 輕、中、重度患者PD-L1/CD8+表達水平（橫坐標均表示CD8+T淋巴細胞，縱坐標均表示PD-L1表達情況）

圖5 對照組外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞中PD-1、PD-L1表達水平（橫坐標分別表示CD4+、CD8+T淋巴細胞，縱坐標分別表示PD-1、PD-L1表達情況）

圖6 肝血管瘤組外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞中PD-1、PD-L1表達水平（橫坐標分別表示CD4+、CD8+T淋巴細胞，縱坐標分別表示PD-1、PD-L1表達情況）

表3 不同疾病程度患者外周血T淋巴細胞中PD-1、PD-L1表達水平比較（，%）

表3 不同疾病程度患者外周血T淋巴細胞中PD-1、PD-L1表達水平比較（，%）

注：與輕度比較，aP＜0.05；與中度比較，bP＜0.05。

4疾病組、肝血管瘤組、對照組肝功能相關指標水平 疾病組血清TBIL、DBIL、IBIL、ALT、AST、GGT、ALP水平均明顯高于肝血管瘤組與對照組（P＜0.05），TP、ALB水平均低于肝血管瘤組與對照組（P＜0.05）；肝血管瘤組肝功能相關指標水平與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；見表4。

表4 各組肝功能相關指標水平比較（）

表4 各組肝功能相關指標水平比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與肝血管瘤組比較，bP＜0.05。

5自身免疫性肝炎患者外周血T淋巴細胞中PD-1、PD-L1表達與肝功能指標的相關性 經Pearson相關性分析，自身免疫性肝炎患者外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞中的PD-1、PD-L1表達率與TBIL、DBIL、IBIL、ALT、AST、GGT、ALP水平均呈明顯正相關（P＜0.05），與TP、ALB水平均呈負相關性（P＜0.05），見表5。

表5 自身免疫性肝炎患者外周血T淋巴細胞中PD-1、PD-L1表達與肝功能指標的相關性

續表5

6不同肝功能Child-Pugh分級自身免疫性肝炎患者外周血T淋巴細胞中PD-1、PD-L1表達情況 外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞中PD-1、PD-L1表達率在自身免疫性肝炎患者肝功能Child-Pugh分級A、B、C級中依次升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表6。

表6 不同肝功能Child-Pugh分級患者外周血T淋巴細胞中PD-1、PD-L1表達比較（，%）

表6 不同肝功能Child-Pugh分級患者外周血T淋巴細胞中PD-1、PD-L1表達比較（，%）

注：與A級比較，aP＜0.05；與B級比較，bP＜0.05。

討論

自身免疫性肝炎屬于免疫損傷性肝臟疾病，其可進展為肝硬化或肝衰竭，嚴重影響患者生存[10-11]?，F階段，盡管自身免疫性肝炎的發病機制仍未完全清楚，但自身免疫異常在其發病中的作用已得到明確[12-13]。PD-1、PD-L1可抑制T細胞活化與增殖，對免疫應答具有負性調控的作用[14-15]。本研究特探討自身免疫性肝炎患者外周血T淋巴細胞中PD-1、PD-L1的表達及其與肝功能的相關性，以期為臨床工作提供指導。

PD-1屬于免疫細胞負性共刺激分子，與其配體PD-L1相結合后，能夠傳入抑制信號而對T淋巴細胞活化與增殖發揮抑制作用[16]。PD-1/PD-L1信號通路在淋巴細胞免疫應答的初始部位及效應階段具有雙重作用，可適時阻止過強的免疫應答，以維持免疫功能穩定，從而可避免發生自身免疫性疾病[17-18]。本研究中，自身免疫性肝炎外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞中的PD-1、PD-L1表達率均較健康人群與肝血管瘤患者高，且隨病情加重而逐漸升高，此與理論上PD-1、PD-L1在自身免疫性疾病中應表達下調不相符合，可能是因在機體效應T淋巴細胞激活的同時，雖然PD-1、PD-L1表達逐漸增多，但表達PD-1與PD-L1的CD4+、CD8+T淋巴細胞的增殖能力卻出現下降的情況，并未達到下調免疫應答和抑制自身免疫的效果，考慮其升高可能是機體對自身免疫的一種代償，通過增加PD-1、PD-L1的表達以實現負調控T淋巴細胞的目的，抑制過強的免疫反應而造成的肝細胞損傷，但該自身代償反應作用有限，增高的PD-1、PD-L1對免疫反應的下調并不足以阻止疾病的進一步發展[19-20]；亦可能是正性刺激過強，超過了PD-1/PD-L1通路的負性抑制作用，或是該通路在共刺激通路中發生了功能障礙，促使免疫耐受失衡，不能發揮抑制性調控免疫反應的作用，導致病變發生[21-22]。PD-1/PD-L1通路并不能夠對活化T細胞增殖分化的速度與強度進行有效控制，最終導致了自身免疫性肝炎的發生[23]。芮志蓮[24]研究報道，自身免疫性肝炎患者外周血CD8+T細胞PD-1表達水平較健康人群明顯升高，與本研究結果相似。另熊克宮等[25]研究表明，Ⅰ型自身免疫性肝炎患者外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞PD-L1的表達均高于健康者，此與本研究結果相一致。另本研究中，疾病組血清TBIL、DBIL、IBIL、ALT、AST、GGT、ALP水平均較對照組與肝血管瘤組明顯升高，而TP、ALB水平較對照組與肝血管瘤組降低，表明自身免疫性肝炎患者存在肝功能受損情況。肝細胞壞死是自身免疫性肝炎的主要病理特征之一，可導致肝功能降低[26-27]。肝血管瘤屬于肝臟良性腫瘤，一般對肝功能無影響，肝功能通常在正常狀態。

此外，本研究結果還發現，自身免疫性肝炎患者外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞中的PD-1、PD-L1均與TBIL、DBIL、IBIL、ALT、AST、GGT、ALP水平均呈明顯正相關，而與TP、ALB水平呈負相關性，另其在自身免疫性肝炎患者肝功能Child-Pugh分級A、B、C級中均依次升高，表明外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞中的PD-1、PD-L1表達與自身免疫性肝炎患者肝功能密切相關。當自身免疫性肝炎進展時，為維持免疫耐受狀態，機體過表達PD-1、PD-L1，以發揮負性調控T淋巴細胞的作用，避免過度免疫反應所致的肝細胞損傷[28-30]。相關研究[31]表明，自身免疫性肝炎患者肝組織中PD-L1的表達與肝功能指標TBIL、ALT、GGT、ALP水平呈正相關，此與本研究結果相一致。PD-1、PD-L1在自身免疫性肝炎發病進展中具有重要作用，與肝功能密切相關，此對臨床治療具有一定的指導作用。

綜上，自身免疫性肝炎患者外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞中PD-1、PD-L1表達均升高，且與肝功能關系密切。本研究的創新之處在于通過對外周血T淋巴細胞中PD-1、PD-L1表達情況與自身免疫性肝炎患者肝功能關系的探索分析，為臨床疾病進展的預測與治療提供了指導，可作為評估機體是否存在一定程度的免疫紊亂的參考指標，并有助于推動自身免疫性肝炎抑炎和免疫調節治療新策略的發展。但本研究尚存在一定的不足，納入研究的樣本量相對較少，并未對外周血T淋巴細胞中PD-1、PD-L1影響肝功能的具體機制進行探討分析，且因PD-1、PD-L1在機體內的表達具有廣泛性，后續仍需擴大樣本量進行深層次的研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突