血糖控制達標的2型糖尿病視網膜病變患者外周血miR-3197、miR-2116-5p的表達水平及其臨床價值*

張浩 方新梅 張瑪麗

糖尿病性視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病性微血管病變中具有特異性改變的眼底病變，是糖尿病嚴重的并發癥之一[1]。由于該病是一種階段性疾病，一般確診即為晚期，因此及時診斷和治療對于挽回患者視力損失至關重要。miRNA是一類高度保守的非編碼小分子RNA，它幾乎參與機體內所有生理和病理過程，可作為新型診斷標志物和治療靶點[2]。有研究發現miRNA可參與糖尿病及其并發癥的發生，多種miRNA的差異表達與DR的發生存在密切聯系[3]，其中miR-3197和miR-2116-5p可作為DR有效的生物學標志物或治療靶點，但是目前該方面的研究內容較少且結論尚未統一。對此，本研究對循環miR-3197、miR-2116-5p在DR患者中的表達進行分析，探究miR-3197、miR-2116-5p的差異表達與DR的相關性，確定二者對于DR的診斷價值。

資料與方法

1病例資料 選擇2018年7月～2020年3月在我院確診為DR的2型糖尿?。═ype 2 diabetes，T2DM）患者72例作為研究對象，并收集同期未有DR的T2DM患者72例作為對照組。其中男性76例，女性68例，年齡在60～80歲之間，DR組平均年齡（65.32±4.56）歲，非DR組平均年齡（65.46±5.17）歲。納入標準：①符合美國糖尿病協會的T2DM診斷標準[4]；②所納入患者血糖控制在正常水平。排除標準：①患有急性或慢性炎癥性疾病者；②青年期發病的糖尿病、線粒體糖尿病或1型糖尿病者；③伴有全身系統性疾病者。本研究所有患者均知情并簽署知情同意書，獲我院倫理委員會批準（批號：2017-QT-15）。

2診斷標準 T2DM[4]：①空腹血糖＞7.0 mmol/L；②餐后2小時血糖＞11.1 mmol/L；③HbA1c＞6.5%。DR：糖尿病患者的視網膜出現病變，如視網膜有出血點，有黃白色滲出或出血，或者有視網膜前增殖。DR分級標準依據美國早期治療糖尿病性視網膜病變評分（early treatment diabetic retinopathy study，ETDRS）[5]：10～30分為1級；31～40分為2級；41～50分為3級；51～60分為4級；60～85分為5級。分級越高DR病情越嚴重。

3實驗室指標 采集外周血標本5 mL，離心（3 000 r/min,15 min）分離患者血清，檢測總膽固醇（total cholesterol,TC）、三酰甘油（triacylglycerol,TG）、糖化白蛋白（glycosylated albumin,GA）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol,LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol,HDL-C）、空腹血糖（fasting plasma glucose,FPG）、載脂蛋白A（apolipoprotein A,ApoA）、載脂蛋白B（apolipoprotein B,ApoB）、糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin,HbA1c）、血肌酐、白細胞計數（white blood cell count,WBC）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase,AST）、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）、血尿酸（uric acid,UA）、肌酐（creatinine,Cr）以及尿白蛋白/肌酐（UACR）。體重指數（BMI）計算為體重（kg）/身高（m）2。

4循環miRNA的提取純化 通過使用Beckman J-6M感應驅動離心機（Beckman Instruments,California,USA）在4℃下以6 000 g雙重離心15 min提取血清樣品，隨后將樣品分裝并于-80 ℃儲存以備RNA提取。根據制造商的說明，使用miRNeasy Serum/Plasma Kit（Qiagen,Hilden,Germany）從血清樣品中分離miRNA。使用Agilent 2100生物分析儀和RNA 6000 Nano/Pico LabChip（Agilent Technologies,Boeblingen,Germany）評估RNA的質量。

5microRNA分析研究 每個微陣列能夠檢測8 273種miRNA，對照探針用于評估質量，GenePix 4000B激光掃描儀（Molecular Devices,California,USA）和Array-Pro圖像分析軟件（Media Cybernetics）分別用于收集和數字化熒光圖像。在本研究中，差異表達的miRNA使用Bioconductor EdgeR進行鑒定，該軟件包用于分析由RNA測序技術產生的數字基因表達數據，主要測試差異表達，如果miRNA具有|log2（倍數變化）＞1|且P＜0.05，則認為存在差異表達，利用cluster軟件得到差異表達基因的表達模式聚類。

6RT-qPCR 在逆轉錄為互補DNA之前，將3.5 μL來自秀麗隱桿線蟲（cel-miR-39）的合成miR-39添加到提取的miRNA作為摻入對照（1.6×108copies/μL工作溶液）。使用miScripts Ⅱ RT Kit（Qiagen,Germany）逆轉錄總RNA。每個逆轉錄反應體系包含2 μL RNA模板、1 μL miScript Reverse Transcription Mix、4 μL 5×miScript RT緩沖液和13 μL無RNase水，最終體積為20 μL。使用iCycler系統（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）進行逆轉錄（37℃孵育1 h，95℃孵育5 min）。隨后將cDNA稀釋10倍，然后再添加到每個qPCR反應體系中。每個反應體系包括6.2 μL SYBR Green PCR Master Mix（BioRad,Hercules,CA,USA）、1.2 μL miScript通用引物、1.2 μL特異性引物、2 μL cDNA和1.9 μL無RNase水。根據制造商說明書設置反應條件：95℃15 min，94℃ 15 s、55℃30 s和70℃30 s重復40個循環。該反應在Mx3005P qPCR系統（Stratagene，美國）上進行。每個樣品重復3次。熔解曲線和擴增圖用于檢查反應的特異性。循環miR-3197（Hs_miR-3197 miScript Primer Assay,MS00041874,Qiagen,Germany）和miR-2116-5p（Hs_miR-2116-5p miScript Primer Assay,MS00031598,Qiagen,Germany）的水平在標準化后通過2-ΔΔCt（循環閾值）方法進行定量分析。

7統計學處理 利用SPSS 23.0統計軟件進行數據統計分析，計量資料均以平均數±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料使用百分數（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。Shapiro-Wilk正態性檢驗用于檢驗變量是否呈正態分布。Spearman檢驗循環miR-3197和miR-2116-5p與DR的相關性，Pearson檢驗miR-3197和miR-2116-5p與GA、FPG、UACR以及HbA1c的相關性。計算ROC曲線下面積（area under curve，AUC）以評估候選 miRNA 的預測值。

結果

1兩組患者基線資料對比 DR組患者的GA、FPG、UACR以及HbA1c指標高于非DR組，差異具有統計學意義（P＜0.05），兩組患者在年齡、BMI、糖尿病病程、TC、Cr、HDL、LDL、TG 以及BUN方面沒有顯著的組間差異（P＞0.05），見表1。

表1 兩組患者基線資料對比

續表1

2兩組患者基因表達差異對比 通過μParaflo?MicroRNA微陣列檢測到共有73種miRNA在DR病例中差異表達，其中，miR-3197和miR-2116-5p在DR患者中的含量顯著高于非DR患者（miR-3197，|Log2（Fold Change）|=8.96，P＜0.001；miR-2116-5p，|Log2（Fold Change）|=8.38，P＜0.001），見表2?；趦山M差異表達基因聚類分析結果，上調基因和下調基因分別聚為兩大類，紅色表示表達上調，綠色表示表達下調，差異倍數以log2Ratio表示，見圖1。

圖1 兩組DR相關差異表達基因聚類分析圖（A：非DR組；B：DR組）

表2 μParaflo? MicroRNA微陣列分析檢測到的循環miRNA的差異表達

續表2

3兩組患者基因表達差異驗證 通過RT-qPCR分析驗證發現，與非DR組對比，DR病例中miR-3197和miR-2116-5p表達均顯著上調（miR-3197：倍數變化=1.67，P=2×10-7；miR-2116-5p：倍數變化=1.33，P=6×10-5），見圖 2。

圖2 兩組患者基因表達差異驗證

4循環miR-3197和miR-2116-5p水平與DR及血液指標的相關性分析 采用Spearman法對循環miR-3197和miR-2116-5p水平與DR進行相關性分析，結果顯示miR-3197和miR-2116-5p與DR均呈顯著正相關（P均＜0.001），見圖3。Pearson相關性分析結果顯示，DR組患者血清miR-3197和miR-2116-5p水平與GA、FPG、UACR以及HbA1c均呈顯著正相關（P＜0.05），與其他指標之間無明顯相關性，見表3。

表3 循環miR-3197和miR-2116-5p水平與血液指標的相關性分析

圖3 循環miR-3197和miR-2116-5p水平與DR的相關性

5循環miR-3197和miR-2116-5p對DR的診斷價值 miR-3197和miR-2116-5p的ROC曲線下面積（area under curve，AUC）分別為 0.903和0.875，表明這兩種循環miRNA可以識別患有DR的風險，兩種miRNA聯合檢測的AUC為0.976（95%CI：0.905～0.997），準確率為91%，優于單獨檢測，見表4，圖4。

圖4 聯合預測因子及各原始協變量預測DR的ROC曲線性

表4 聯合預測因子及各原始協變量對DR診斷的AUC及其他參數估計

討論

DR是由于糖尿病患者血液成分改變而引起的血管內皮細胞功能異常導致的血視網膜屏障受損，是糖尿病的常見并發癥之一，也是老年人視力喪失的主要原因[6-7]。在當今社會，DR已成為最突出的公共衛生威脅之一[8]。相關研究顯示[9-10]，在全世界近2.85億糖尿病患者中，超過三分之一的患者有并發DR的跡象，在我國9 240萬成人糖尿病患者中，約43%的糖尿病患者已經患有視網膜病變，嚴重威脅患者的生命健康和生活質量[11]。此外，由于DR是一種多階段的發育性疾病，其診斷往往發生在晚期，因此，迫切需要高敏感性和特異性的新型非侵入性或微創生物標志物用于DR的早期診斷。

作為高度保守的內源性非編碼RNA，miRNA通過抑制mRNA翻譯或通過與靶基因的3'-UTR結合抑制蛋白質翻譯來調節基因表達，miRNA廣泛參與細胞發育、組織分化、細胞增殖和凋亡等生理和病理過程[12]，并在DR的發病機制中發揮重要作用。研究發現[13]，鏈脲佐菌素（STZ）誘導的糖尿病大鼠視網膜中的miRNA發生異常表達，可通過影響糖尿病大鼠的關鍵調節功能參與DR發生的早期階段。一項miRNA分析研究表明，在STZ誘導的糖尿病大鼠的視網膜和視網膜內皮細胞中，存在多種miRNA上調的情況[14]。2019年，JI等人[15]的研究成果表明DR病例中多種miRNA存在差異表達，其中miR-2116-5p和miR-3197顯著上調。在本研究中，我們通過μParaflo?MicroRNA微陣列檢測到73種miRNA在DR病例中差異表達，其中，miR-3197和miR-2116-5p在DR患者中的含量顯著高于非DR患者，并通過RT-qPCR技術驗證，這些結果與既往研究相符。另有研究發現[16]，在DR患者的視網膜中有80種miRNA發生上調，6種miRNA發生下調，且部分miRNA表達的改變與DR之間存在顯著相關性。對此，本研究通過Spearman法對循環miR-3197和miR-2116-5p與DR進行相關性分析，結果顯示循環miR-3197和miR-2116-5p水平與DR均呈顯著正相關，這進一步說明了miR-3197和miR-2116-5p可參與DR的發生。

DR的發生受多方面因素影響，本研究通過對比DR患者與非DR患者的一般資料，確定GA、FPG、UACR以及HbA1c指標是DR的影響因素。黃國強[17]等的研究表明，DR患者的FPG和HbA1c水平明顯高于非DR患者，是糖尿病患者發生DR的獨立危險因素。張危[18]等的研究顯示，UACR與T2DM患者DR的發生和發展密切相關，可作為重要的預測指標。孫東海[19]的研究表明，GA水平與血糖水平、糖尿病病程、TC等多種因素密切相關，與T2DM患者DR的發生具有一定關系。本研究通過對比DR患者與非DR患者的一般資料，確定GA、FPG、UACR以及HbA1c指標是DR的影響因素，這與既往研究相符。此外，為了進一步確定miR-3197和miR-2116-5p與DR的關系，我們采用Pearson法對miR-3197和miR-2116-5p與GA、FPG、UACR以及HbA1c的相關性進行分析，結果顯示miR-2116-5p及miR-3197分別與 GA、FPG、UACR以及HbA1c之間呈正相關，提示這兩種miRNA可能與DR發生發展及其微血管病變密切相關。因此，miR-2116-5p及miR-3197水平顯著上調可能是DR發生的早期風險預警，應盡早采取相應措施對病情進行有效控制。通過ROC曲線評估循環miR-3197和miR-2116-5p對DR的診斷敏感性和特異性，結果顯示miR-3197和miR-2116-5p的AUC分別為0.903和0.875，與JI等[15]的研究中miR-3197和miR-2116-5p診斷DR的AUC相符，表明這兩種循環 miRNA可以識別DR的發生風險。本研究中miR-3197和miR-2116-5p聯合檢測的AUC為0.976，顯著大于單項檢測，提示兩種miRNA的組合檢測對DR具有更高的診斷能力。

本研究通過微陣列分析DR組和非DR組多種差異表達的miRNA，但并未一一驗證，這是本研究的局限性，其他顯著上調的miRNA將在未來的研究中進行探討。

綜上所述，循環 miR-3197 和 miR-2116-5p在DR患者中顯著上調，與DR病情嚴重程度及多種DR相關指標密切相關，可能參與病情發生發展過程，二者聯合檢測對于DR具有更高的診斷價值，在臨床診療中具有一定的應用前景。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突