人促甲狀腺激素受體A亞單位蛋白在昆蟲細胞體系中的分泌性表達

張 萌,張愷寧,陳子怡,王 玲,伍麗萍,王 悅,劉 冰,施秉銀

(1.西安交通大學第一附屬醫院內分泌科,陜西西安 710061;2.西安交通大學第一附屬醫院生物樣本信息資源中心,陜西西安 710061)

促甲狀腺激素受體(thyroid stimulating hormone receptor,TSHR)是G 蛋白耦聯受體家族成員之一,主要表達于甲狀腺濾泡上皮細胞。TSHR 由764個氨基酸構成,翻譯組裝時發生分子間裂解,形成二硫鍵連接的胞外段A 亞單位和跨膜的B亞單位。生理條件下,促甲狀腺激素(TSH)與胞外段結合,激活下游信號通路產生cAMP,介導相應的生理功能。

TSHR A 亞單位主要包含氨基酸序列22-289,既是Graves病(Graves’disease,GD)及其并發癥Graves 眼病(Graves’ophthalmopathy,GO)的主要自身抗原,也是其防治研究的重要靶點[1]。病理狀態下,在二硫鍵異構酶作用下二硫鍵斷裂,TSHR A 亞單位從細胞膜脫落,誘導機體的自身免疫[2]。臨床研究中,GD 患者和GO 患者體內可以檢測到TSHR A亞單位的自身抗體[3-4]。動物研究顯示,給予Balb/c小鼠注射不同時長和頻率的表達人TSHR A 亞單位的腺病毒可以誘導GD 模型和GO 模型[5-6];將人TSHR A 亞單位基因導入NOD.H2h4小鼠體內,可以誘導自身抗體從而建立自發的GD 模型[7]。此外,TSHR A 亞單位蛋白和表達人TSHR A 亞單位的腺病毒的預處理GD 小鼠,均可抑制其GD 的發病率和癥狀[8-9];將TSHR A 亞基蛋白導入TSHR A-NOD.H2h4小鼠,可以減輕GD 的癥狀[7]。

獲取大量純度較高的TSHR A 亞單位蛋白對生產促甲狀腺素受體抗體、檢測患者血清促甲狀腺素受體抗體水平以及GD 的防治具有重要意義。而TSHR A 亞單位蛋白作為大片段蛋白,主要的結構是富亮氨酸的β折疊組成的重復區域,有6個必需的糖基化位點[10]。常見的蛋白表達系統包括大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞等,前兩者系統存在折疊和糖基化等翻譯后修飾的缺陷,哺乳動物細胞系統的成本較高、產量較少。而昆蟲細胞在經過糖基化優化等完善后,作為在折疊、糖基化、產量等方面較為均衡的蛋白表達系統,已經進入生物醫藥領域,在流感疫苗、乙肝疫苗等領域廣泛應用,是工業化生產TSHR A 亞單位的良好選擇[11-12]。

本研究采用分子生物學技術,擬構建TSHR A亞單位的昆蟲細胞分泌表達體系,在草地夜蛾卵巢細胞(sf9)中表達分泌型的TSHR A 亞單位蛋白,為其工業化平臺的建設及生產提供前期基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗細胞 DH5α大腸桿菌熱激感受態細胞(上海唯地生物技術有限公司,DL1001),DH10bac大腸桿菌熱激感受態細胞(上海唯地生物技術有限公司,DL1071),草地夜蛾卵巢細胞(Spodoptera frugiperda9,sf9)(美國Invitrogen生物技術有限公司,B82501)。

1.1.2實驗試劑 p Fastbac-dual質粒(武漢淼靈生物科技有限公司,P0292),胎牛血清(美國Gibco生物技術有限公司,10100147),Bluo-Gal(美國Gibco生物技術有限公司,15519028),金牌Mix(green)(北京擎科生物技術有限公司,0BH21701),Gel Extraction Kit瓊脂糖凝膠回收試劑盒(美國Omega生物技術有限公司,D2500-02),Plasmid Mini Kit質粒提取試劑盒(美國Omega生物技術有限公司,D6943-02),BAC/PAC DNA Mini Kit(美國Omega生物技術有限公司,D2156-01),EasyGeno快速重組克隆試劑盒(北京天根生化科技有限公司,VI201),TSHR抗體(3B12)(美國Santa Cruz生物技術有限公司,sc-53542)。

1.1.3實驗儀器 正置光學顯微鏡(日本Olympus),電泳儀(美國Bio-rad),Turbo全能型快速轉印系統(美國Bio-rad),蛋白免疫印跡成像系統(美國Thermo Fisher Scientific),超微量分光光度計(美國Nano-drop)。

1.2 方法

1.2.1重組質粒的構建和鑒定 ①重組基因的設計及引物合成:根據TSHR 22-289、Fastbac-dual及綠色熒光蛋白GFP的序列設計重組蛋白序列,在Fastbac-dual的兩個啟動子下分別插入TSHR 22-289和GFP的序列。利用Primer5.0設計引物并合成。

②質粒線性化擴增及回收:通過PCR 反應在目的基因插入位點將載體質粒線性化并擴增。使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收線性化載體片段,測定濃度,-20℃保存。

③目的基因擴增及回收:通過PCR 反應從表達TSHR 的質粒psv2-neo-ECE(美國加州大學洛杉磯分校Basil Rapoport教授和陳春榮教授惠贈)上獲得TSHR 22-289片段,在該片段的上游5’端引入蜂毒信號肽序列,在上下游都引入與線性化載體匹配的同源序列,擴增并膠回收。

④線性載體同源重組、轉化及陽性克隆的提取:使用重組克隆試劑盒對線性化載體和目的基因片段進行同源重組,轉化DH5α感受態細胞后將復蘇的菌液涂布到含有羧芐青霉素的LB固體平板上,37℃倒置培養過夜。挑取平板上的菌落接種于含有羧芐青霉素的LB培養基,搖床(37℃,225 r/min)振蕩過夜,使用質粒小提試劑盒對重組pFastbac-dual-TSHR-GFP質粒進行提取。測定濃度,-20℃保存。

⑤陽性質粒的鑒定:PCR 鑒定重組質粒中的插入片段大小,并對目的基因片段進行回收測序。

1.2.2重組桿粒的生成和鑒定 ①質粒的轉化及藍白斑篩選:將鑒定正確的重組克隆質粒轉化入DH10bac感受態細胞,利用含有慶大霉素、卡那霉素、四環素、IPTG 和Bluo-gal的LB瓊脂板來對陽性菌落進行藍白斑篩選, 待培養成單菌落后,統計各稀釋度瓊脂板上藍色和白色菌落的數目。

②菌落PCR 鑒定重組桿粒的大小:因為Bacmid DNA 大于135 kb,難以直接測序,先進行PCR 分析確認重組Bacmid中目的基因的存在。p UC/M13正向 引 物5＇-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3＇;p UC/M13反向引物5＇-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3＇。

③重組桿粒的提取及鑒定:使用OMEGA BAC/PAC DNA Mini Kit提取重組Bacmid,使用p UC/M13通用引物及目的基因特異性引物對重組桿粒PCR 鑒定?；厥漳康幕蚱尾y序。

1.2.3重組桿狀病毒的生產及擴增 ①重組桿粒轉染昆蟲細胞獲得病毒儲液并擴增:利用Invitrogen公司的化學轉染試劑ExpiFectamine Sf Transfection Reagent,將純化好的重組Bacmid 轉染至復蘇好的sf9細胞,置于27℃、無CO2環境孵育3～4 d,觀察病毒感染征象,收集上清液,離心棄沉淀獲得P0 病毒儲液。P0病毒儲液是低滴度儲液,再次感染sf9細胞生成高滴度的P1儲液,4℃避光保存。

②病毒滴度空斑分析:將密度為5×105個細胞/mL的細胞懸液加入6孔板中,貼壁1 h后棄去培養基,分別加入1 m L 不同稀釋倍數的病毒培養基,培養1 h;去除培養基,迅速加入2 m L 含有瓊脂的空斑培養基,室溫下靜置1 h使瓊脂變硬后培養7～10 d;加入中性紅溶液,室溫孵育1 h;去除多余染料,計數空斑。

1.2.4重組蛋白的表達及鑒定 影響重組蛋白最佳表達條件的確定的因素有很多,選取感染復數(multiplicity of infection,MOI)和時程來進行條件的優化。MOI=病毒儲液滴度×病毒儲液體積/細胞數。優化條件分別為MOI=1、2、5、10,及轉染時程為48、96、120 h。收集細胞及上清液,每孔的細胞提取總蛋白,-20℃保存。通過Western blotting進行蛋白鑒定。

2 結 果

2.1 重組質粒的構建和鑒定結果

2.1.1質粒線性化及目的基因擴增結果 通過PCR反應,分別將質粒線性化、目的基因擴增,產物經20 g/L瓊脂糖凝膠電泳,分別在大于4 000 bp和950 bp處出現特異性條帶(圖1A)。

圖1 重組質粒的構建和鑒定結果Fig.1 Construction and identification of recombinant plasmid

2.1.2陽性質粒的鑒定結果 轉化后抗生素篩選的陽性質粒提取后進行鑒定。PCR 鑒定在800 bp左右處出現特異性條帶(圖1A),測序結果與基因庫結果一致(圖1B)。

2.2 重組桿粒的生成和鑒定結果

2.2.1藍白斑篩選結果 培養48 h后瓊脂板上出現藍白斑:稀釋度為100的瓊脂板上,菌落較為密集,邊界不清晰;稀釋度為10-2、10-3的瓊脂板上,菌落較少;稀釋度為10-1的瓊脂板上菌落清晰,白斑較大,選取大而有光澤的白斑進行進一步鑒定(圖2A)。

圖2 重組桿粒生成和鑒定結果Fig.2 Generation and identification of recombinant bacmid

2.2.2陽性桿粒的鑒定結果 對篩選出來的12個菌落以p UC/M13通用引物進行菌落PCR 鑒定,僅桿粒的PCR 產物大小約300 bp,帶有目的基因的桿粒為3 200 bp左右。12個菌落均出現＞2 000 bp的特異性條帶(圖2B)。

挑選數個菌落PCR 陽性的菌液提取重組桿粒以p UC/M13 通用引物和目的基因特異性引物鑒定,p UC/M13通用引物PCR 顯示陰性對照在300 bp左右出現條帶,4個白色菌落均在3 200 bp左右出現特異性條帶;目的基因特異性引物鑒定顯示,陰性對照沒有出現特異性條帶,4個白色菌落均出現在2 000 bp左右特異性條帶,大小與預期結果相符。

將通用引物的PCR 產物回收后,利用目的基因引物測序,結果與基因庫TSHR 序列進行比對,結果一致(圖2C)。

2.3 重組桿狀病毒的生產和滴度測定結果

2.3.1轉染后的sf9細胞的形態變化 重組桿粒轉染昆蟲細胞后,分別于48 h和96 h觀察到細胞感染的早期和后期征象。顯微鏡下可見,與對照組細胞相比(圖3A),感染了桿粒的sf細胞在96 h出現細胞直徑增大25%～50%,細胞核“充滿”整個細胞(圖3B);120 h出現細胞生長停滯,并出現病毒出芽的顆粒樣外觀(圖3C、圖3D)。

圖3 感染后的昆蟲細胞形態變化Fig.3 Morphological changes of insect cells after infection

2.3.2P1代病毒擴增的結果 P0代細胞擴增P1代病毒,由于載體上攜帶有綠色熒光蛋白基因,可在轉染24 h和48 h后實時觀測到細胞的感染情況(圖3E、圖3F)。

2.3.3 空斑實驗結果 10-4至10-6稀釋濃度均可見明顯空斑,6孔板的最佳計數范圍為3～20個空斑,選擇10-6作為稀釋濃度(圖4),計算空斑數為20。根據公式:滴度(pfu/mL)=空斑數×稀釋倍數/菌液體積,計算P1的病毒滴度:20×106/1=2×107pfu/m。

圖4 空斑實驗結果Fig.4 The results of plaque test

2.4 重組蛋白的表達及鑒定結果

利用已測定滴度的P1病毒儲液進行重組蛋白的初步表達,Western blotting鑒定結果顯示55 ku處出現了目的條帶;且該蛋白主要表達于培養基上清中(圖5A)。選取MOI和時程來進行條件的優化,結果顯示相對于48 h,72 h 是更好的最佳表達時程,MOI為1時的表達結果最佳(圖5B)。

圖5 蛋白的鑒定及表達條件優化Fig.5 Protein identification and optimization of expression conditions

3 討 論

TSHR A 亞單位是GD 的自身抗原和發病核心環節。近年來多項研究顯示,其不僅可以誘導多種GD 動物模型[5-6],在GD 的防治中也具備巨大的前景[8-9]。既往涉及TSHR 的科學研究中大多是以中華倉鼠卵細胞(Chinese hamster ovary,CHO 細胞)表達的,但因為哺乳動物蛋白表達系統的產量存在限制,局限了針對TSHR 蛋白的科學研究和產業轉化[10,13]。因此,亟需探索一種新的蛋白表達體系用于TSHR A 亞單位的產業轉化和基礎研究。

作為含有200多個氨基酸的大分子蛋白,TSHR A 亞單位具有獨特的蛋白結構,對于其生物學及免疫學功能至關重要[14]?？茖W家們通過晶體X 射線衍射的方法,對TSHR 的結構和結合位點進行了研究并構建模型[11-12,15]。TSHR A 亞單位主要為富含亮氨酸重復結構域,該區域由11個重復序列的β折疊構成,其凹面是激素和自身抗體的主要結合位點[16]。除了蛋白的序列和折疊的結構以外,蛋白的翻譯后修飾對TSHR 的功能也有重要影響。TSHR 的胞外段共有6個糖基化結合位點,研究人員發現,只有保證至少4個位點的糖基化才能使TSH 與該受體的結合并傳導下游信號[10]。

因為TSHR A 亞單位的復雜結構,雖然科學家們已經嘗試了多種表達系統進行大量克隆表達,但均未建立穩定表達活性TSHR 及其胞外域的體系[13]。目前一致認為以CHO 細胞為代表的真核表達系統是生成構象完整、具有正確空間結構TSHR A 最有效的方法;然而,其表達量非常低,并且大部分以未成熟的形式保留在細胞內,僅少量分泌至培養基中[13]。其他蛋白表達系統如大腸桿菌、酵母表達系統等,其蛋白折疊和修飾能力較弱,無法表達具有穩定結構的目標蛋白。近年來,昆蟲細胞表達系統逐步進入科學家們的視野,經過糖基化優化等完善后的昆蟲表達系統,作為在折疊、糖基化、產量等方面較為均衡的蛋白表達系統,已經進入生物醫藥領域,在流感疫苗、乙肝疫苗等領域廣泛應用。近期通過構建昆蟲表達系統,科學家們分別構建并解析了TSHR 胞外域氨基酸22-260與TSHR 刺激性抗體(M22)、阻斷性抗體(K1-70)的復合物的晶體結構,證實了昆蟲系統可以表達有完整結構及功能的部分TSHR 胞外段[11-12]。

本研究成功構建了外泌性的TSHR A 亞單位蛋白昆蟲細胞桿狀病毒表達系統。本系統的優勢有以下幾點:①本系統通過蜂毒信號肽構建外泌性表達系統,在培養基檢測到蛋白,并優化了MOI和時程條件(MOI為1和72 h),較既往的真核表達系統更為優化,在純化及后期工業化中都具備巨大優勢[13]。②該系統表達出來的蛋白質分子質量在55 ku左右,考慮到TSHR A亞單位是具有6個糖基化位點的β折疊為主的多肽,其蛋白分子量在未修飾時為24～27 ku,糖基化修飾后會達到50～60 ku左右[13],因此我們推測該蛋白的相應位點已經充分糖基化。③本系統選擇表達的TSHR A 亞單位序列為aa22-289,與既往昆蟲系統表達進行蛋白表達TSHR 的研究(aa22-260)并不相同[11-12];對該肽段的選擇是因為近年來的結構與功能研究推測LRRD 的重復序列有11個,而不是之前認為的9個[15-16]。④本系統選擇了雙啟動子的質粒,使得可以通過綠色熒光實時定量監測細胞的轉染情況,初步估計其滴度,這是對前期昆蟲系統表達系統的巨大優化[11-12]。本研究作為前期基礎,相信在不遠的將來,通過中試、大試等可以建立產業化的平臺系統。

綜上,本研究構建了TSHR A 亞單位的昆蟲細胞桿狀病毒表達體系,該體系能夠外泌性表達分子質量為55 ku左右的蛋白TSHR 22-289,且蛋白能夠成功的糖基化修飾。該系統為其工業化平臺的建設及生產提供了前期基礎,也為日后針對TSHR 蛋白的研究和GO 病因預防提供了有用的工具。