基于網絡藥理學和分子對接探討杜仲-牛膝藥對治療強直性脊柱炎機制

李舒 萬磊 劉健 黃傳兵 李方澤 胡賽賽 陳瑩瑩 程靜 周健

摘要：目的 運用網絡藥理學和分子對接探討杜仲-牛膝藥對治療強直性脊柱炎（AS）的關鍵靶點和分子機制。方法 利用TCMSP數據庫檢索杜仲-牛膝藥對的活性成分，預測其對應靶點；利用GeneCards、OMIM、DrugBank、TTD、PharmGkb數據庫檢索AS疾病相關靶點，利用Uniprot數據庫將預測靶點和疾病靶點名稱標準化后篩選出交集靶點，利用Cytoscape3.9.1繪制并分析中藥-成分-靶點-疾病網絡圖。將共同靶點導入STRING數據庫獲得蛋白質互作網絡并利用CytoNCA篩選出核心靶點。將共同靶點導入富集分析庫（Metascape）數據庫進行GO、KEGG富集分析。利用Auto Dock Tools1.5.7軟件進行分子對接。結果 杜仲-牛膝有效活性成分35個，預測對應靶點150個，疾病相關靶點1914個，主要活性成分為槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、漢黃芩素，核心靶點為白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素1β（IL-1β）、前列腺素內過氧化物合成酶2（PTGS2）、血管內皮生長因子A（VEGFA）、C-X-C基序趨化因子配體8（CXCL8）。富集分析方面：GO BP主要包括細胞對脂質、有機環化合物和脂多糖反應等；GO MF主要包括細胞因子活性、細胞因子受體結合和受體-配體活性等；GO CC主要包括轉錄調節復合物、RNA聚合酶II轉錄調節復合物和膜筏等。KEGG主要包括免疫系統中的細胞因子信號傳導通路、白介素相關信號通路、腫瘤壞死因子相關信號通路等。分子對接結果表明主要活性成分可以和核心靶點結合，結合構象穩定。結論 杜仲-牛膝可能通過多種有效成分、多個作用靶點和信號通路發揮抗炎、免疫調節、止痛等生物作用，進而具有治療AS的作用。

關鍵詞：杜仲-牛膝；強直性脊柱炎；網絡藥理學；分子對接

中圖分類號：R681.5 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2023）04-0060-08

強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一種以脊柱強直和韌帶骨化為特征的風濕免疫疾病^［1］。疾病發展至中后期，會造成患者中軸脊柱的不可逆損傷，出現脊柱和骶髂關節的融合，導致脊柱活動性降低^［2］。慢性腰背痛為AS常見的癥狀^［3］，西藥的對癥治療以非甾體抗炎藥（nonsteroidal antiinflammatory drugs，NSAIDs）為主^［4］。西醫治療的藥物選擇還非常有限^［5］，中醫辨證施治AS療效顯著^［6］。中醫認為AS患者腎精虧虛，督脈失養，腎為先天之本，主骨生髓，腎充則骨強，肝為罷極之本，藏血主筋，肝充則筋骨韌，且肝腎同源，精血相生，肝腎虧虛則筋骨失養、關節疼痛、強直變形，中醫治以滋補肝腎、活血強督之劑。杜仲-牛膝為補肝腎、強筋骨、健腰膝經典藥對^［7］。然而杜仲-牛膝治療AS缺乏科學依據來合理解釋其協同作用機制，網絡藥理學是大數據時代背景下，基于生物學、藥理學以及多種網絡計算平臺融合的新興學科，能系統地分析所有層面的分子機制^［8］。本文利用中藥系統藥理學分析平臺（traditional chinese medicine systems pharmacology database and Analysis platform，TCMSP）平臺，分析杜仲-牛膝藥物作用靶點與AS疾病靶點，以期更好的探討杜仲-牛膝治療AS的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料 通過TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），以杜仲、牛膝為關鍵詞，檢索兩藥活性成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug-like，DL）≥0.18為篩選條件，預測對應的作用靶點。利用全球蛋白質資源（universal protein resource，uniprot）（https：//www.uniprot.org）數據庫以“人類（Homo sapiens，H.sapiens）”為物種限定將靶點名稱標準化。

1.2 方法

1.2.1 AS疾病相關靶點搜集 以“ankylosing spondylitis”為關鍵詞，在GeneCards（https：//www.genecards.org）、OMIM（https：//www.omim.org）、DrugBank（https：//go.drugbank.com）、TTD（http：//db.idrblab.net/ttd）、PharmGkb（https：//www.pharmgkb.org）中收集AS的相關疾病靶點并利用Uniprot數據庫將靶點名稱標準化。

1.2.2 藥物作用靶點與疾病靶點Venn分析及“中藥一活性成分一疾病靶點”網絡構建 將上述得到的成分-基因靶點、疾病-基因靶點，導入Venny2.1，得到藥物和疾病共同靶點韋恩圖，得到并整理杜仲-牛膝有效活性成分調控AS靶基因的網絡節點。

1.2.3 PPI網絡關系構建及拓撲分析篩選核心靶點 檢索互作用基因/蛋白質的搜索工具STRING（https：//string-db.org）分析人類蛋白質與蛋白質之間的相互作用關系。本研究將共同靶點導入STRING數據庫，以“多種蛋白（multiple proteins”）為運行模式，以“H.sapiens”為物種選擇，設置信度score≥0.400，其他參數保持默認，構建PPI網絡，將所得參數導入Cytoscape，利用CytoNCA插件篩選出核心靶點。

1.2.4 共同靶點富集分析 將獲得的共同靶點導入基因功能注釋分析工具Metascape（http：//metascape.org/gp/index.html）數據庫進行基因本體論（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，設置P<0.01，并利用使用微生信平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn）進行可視化處理。

1.2.5 關鍵化學成分和核心靶點分子對接驗證 有機小分子生物活性數據數據庫PubChem用于獲得化合物的化學結構。包含原子坐標，蛋白質結構的其他信息和除蛋白以外生物大分子的信息的PDB數據庫用于獲得蛋白質結構。利用PubChem數據庫下載主要有效成分結構，利用PDB數據庫下載核心靶點蛋白結構，利用自動對接工具（AutoDock Tools）軟件用于配體—蛋白分子的對接，驗證主要有效成分和核心靶點的準確性。

1.2.6 杜仲-牛膝主要活性成分與核心靶點分子對接 利用TCMSP數據庫下載杜仲-牛膝主要活性成分的mol2格式，使用AutoDock Tools 1.5.7處理后保存為“pdbqt”格式，作為分子對接配體。在PBD蛋白數據庫（http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do）下載核心靶點蛋白結構，運用PyMol軟件去除受體蛋白的水分子及原小分子配體，用AutoDock Tools 1.5.7添加非極性氫與電荷后保存為“pdbqt”格式，作為分子對接受體。運用AutoDock Vina進行分子對接，導入配體和受體，設置合適的對接盒子，生成相應的的構象，去除未生成氫鍵的構象，選擇能量最低的構象作為最佳結合構象，保存為PDB格式后用Pymol 2.4將杜仲-牛膝關鍵活性成分與核心靶點對接結果進行可視化處理。

2 結果

2.1 杜仲-牛膝有效活性成分及相關作用靶點預測 在TCMSP數據庫中篩選杜仲-牛膝的有效活性成分，其中杜仲22個、牛膝16個，刪除重復項后共獲得藥對有效活性成分35個。在TCMSP數據庫對有效活性成分作用靶點進行預測，其中杜仲397個、牛膝358個。利用Uniprot數據庫標準化命名后刪除重復項，共獲得預測靶點150個。

2.2 AS疾病相關靶點 利用GeneCards、OMIM、DrugBank、TTD、PharmGkb 5個數據庫分別收集到相關疾病靶點1918個、36個、123個、5個和1個，利用Uniprot數據庫標準化命名并刪除重復項后，共獲得1949個AS疾病相關靶點。

2.3 共同靶點獲得及相關網絡構建 利用Venny2.1對杜仲-牛膝藥對作用靶點及AS疾病相關靶點進行Venn分析，獲得共同靶點67個（圖1），為杜仲-牛膝藥對治療AS的可能作用靶點。利用Cytoscape3.9.1軟件構建“中藥-活性成分-共同靶點-疾病”圖，并對其進行拓撲分析。其中藍色代表共同靶點，綠色代表杜仲，橙色代表牛膝，紫色代表2種，紅色代表AS，中藥共有的活性成分，形狀越大、代表在網絡圖中的地位越重要（圖2）。在網絡中共有255個節點，882條邊，其中等級（degree）值排名前五的有效活性成分為槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、漢黃芩素。（表1、表2）。

2.4 PPI網絡構建及核心靶點篩選 將67個潛在作用靶點導入STRING數據庫，獲得的PPI網絡導入 Cytoscape 軟件進行分析。通過篩選獲得一個由65個節點，748條邊組成的核心作用靶點網絡。根據靶點間連接 degree 值進行分層獲得核心靶點6個，重要靶點21個，次要靶點38個（圖3），將degree值排名前20的蛋白篩選出來（圖4），degree 值排序在前列的6個核心靶點有白細胞介素6（interleukin 6，IL-6）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、前列腺素內過氧化物合成酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、C-X-C基序趨化因子配體8（C-X-C motif chemokine ligand 8，CXCL8）。圖3中degree值越大，節點越大，顏色越深，靶點間聯系越緊密，連線越粗，這6個核心靶點蛋白間互作影響力最強，能在復雜的疾病調節網絡中直接或間接影響其他大部分靶點通路，可能是該藥對治療AS的關鍵靶點。

2.5 杜仲-牛膝與AS交集靶點GO和KEGG富集分析 運用Metascape數據平臺對杜仲-牛膝和AS的交集靶點進行GO和KEGG富集分析。運用微生信平臺進行可視化處理后得到如下KEGG分析圖和GO分析圖（圖5、圖6）?？梢娊患悬c參與的GO生物過程（biological process，BP）主要包括細胞對脂質、有機環化合物、脂多糖、細菌源性分子、炎癥、細菌生物刺激及白細胞介素-8產生的調節反應等。交集靶點主要GO分子功能（molecular function，MF）富集在細胞因子活性、細胞因子受體結合、受體-配體活性、信號受體激活劑活性、信號受體調節活性、生長因子受體結合、生長因子活性、DNA結合轉錄因子結合、核受體活性、配體激活轉錄因子活性等。交集靶點參與GO細胞組分（cellular components，CC）富集在轉錄調節復合物、RNA聚合酶II轉錄調節復合物、膜筏、膜微區、小窩、質膜筏、核膜、絲氨酸型肽酶復合物、質膜外側、膜側等。KEGG富集分析發現參與通路主要有免疫系統中的細胞因子信號傳導通路、白介素相關信號通路、腫瘤壞死因子相關信號通路、脂多糖應答相關信號通路、炎癥反應相關信號通路等，這進一步解釋了杜仲-牛膝治療AS的潛在機制，通過分析發現參與的通路表明杜仲-牛膝可能參與相關疾病的調節。

2.6 杜仲-牛膝主要活性成分與核心靶點分子對接 通過分子對接技術對網絡藥理學結果進一步分析，篩選網絡中度值較高的有效成分和靶點進行對接，對杜仲-牛膝中有效成分治療AS的能力進行預測打分。根據表2分析結果，在選擇度值的情況下同時考慮每個藥物，故篩選來自杜仲-牛膝的槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇，牛膝的漢黃芩素，這4個成分作為對接配體。根據圖4分析結果，選取度值排名前5的核心靶點作為對接受體：IL-6、TNF、IL-1β、PTGS2、VEGFA，用結合能（Affinity）來評估成分與靶點的結合能力，結合能<0表明可以自由結合，結合能越低表明配體與受體之間的親和力越大，二者發生相互作用的可能性就越高。由于數據較多，故展示排名前20位的對接結果見表3。利用Pymol軟件對部分分子對接結果進行可視化處理（圖7），其中藍色為蛋白受體，綠色為小分子配體，黃色虛線為配體與受體之間形成的氫鍵，表示配體與受體之間的結合較穩定。分子對接結果顯示成分與靶點能夠較好結合。

3 討論

在本研究中，通過網絡藥理學方法篩選出了35個杜仲-牛膝的活性成分和67個與AS相關的靶點。結果表明，杜仲-牛膝在多組分和多目標組合治療AS中發揮作用，對治療AS具有潛在優勢。根據“活性成分-疾病-核心靶信號通路”網絡的拓撲分析結果發現，此次篩選出的核心成分多數存在抗炎、免疫調節、止痛等作用。

杜仲、牛膝共有成分有槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇，且三種成分的degree值在所有成分中前三，體現了杜仲-牛膝藥對配伍的相須作用。槲皮素為黃酮類植物多酚，是一種眾所周知的抗氧化劑^［9］。有研究表明，槲皮素是具有鎮痛特性的藥物，可以輔助非甾體抗炎藥，而且對腎臟和胃腸道的副作用更少^［10］。山奈酚通過調節炎癥、血管生成和氧化應激發揮保護機體作用^［11-12］。β-谷甾醇通過下調IKKβ/NF-κB和JNK）信號通路改善脂肪組織中的炎癥^［13］。牛膝的主要成分為漢黃芩素，漢黃芩素具有抗氧化、抗炎和抗凋亡作用，可顯著抑制炎癥反應^［14］。本研究選取排名前4的活性成分和排名前5的核心靶點基因，其分子對接分別為IL-6、TNF、IL-1β、PTGS2、VEGFA。這些靶基因主要涉及炎癥、疼痛、血管內皮生成等。IL-6是先天性免疫的關鍵細胞因子，具有廣泛的生理功能，傳統上與宿主防御、免疫細胞調節、增殖和分化有關^［15］。TNF是一種多效性細胞因子，是炎癥中的重要細胞因子。TNF-a拮抗劑靶向治療在減少AS軸向和外周癥狀、減緩疾病進展、改善患者功能和生活質量方面顯示出快速和一致的有效性^［16］。IL-1β是炎癥反應的關鍵介質。它對宿主反應和對病原體的抵抗至關重要，但是在慢性疾病和急性組織損傷期間也會加劇損害^［17］。有研究表明，抗IL-1β和抗TNF-a治療可能有緩解椎間盤退變和下腰痛的效果^［18］。PTGS2也被稱作環氧化酶2（COX-2），COX-2選擇性抑制劑在鎮痛、抗炎方面具有與NSAIDs類似的明確療效，且與NSAIDs相比，COX-2選擇性抑制劑與胃十二指腸損傷的顯著減少相關^［19］，這些天然藥物替代品是藥物化學研究的熱點^［20］。VEGF-VEGFR信號是抑制包括炎癥在內的各種疾病的重要靶點^［21］。通過對AS以上作用機制的分析，為進一步預測杜仲-牛膝對AS的治療機制，我們對GO和KEGG通路進行了富集分析。結果顯示，杜仲-牛膝參與AS生物過程中的細胞對脂質、有機環化合物和脂多糖反應等，生物分子功能中的細胞因子活性、細胞因子受體結合和受體-配體活性等，生物組分中的轉錄調節復合物、RNA聚合酶II轉錄調節復合物和膜筏等。KEGG顯示杜仲-牛膝治療AS涉及到了免疫系統中的細胞因子信號傳導通路、白介素相關信號通路、腫瘤壞死因子相關信號通路等，這些通路在AS的免疫調節、炎癥反應、預后和轉歸均具有重要意義。

綜上所述，本研究綜合了網絡藥理學和分子對接，初步從分子水平上展示了杜仲-牛膝的多組分、多靶點、多通道治療AS的現代應用價值，從而為杜仲-牛膝臨床配伍治療AS提供指導意義。

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（收稿日期：2022-06-29）