除蟲菊TcALDH和TcGLIP基因啟動子克隆及功能分析

周黎 李伽文 徐郅卓 曾拓 王彩云

摘 要：? 天然除蟲菊酯是從除蟲菊（Tanacetum cinerariifolium）中提取的綠色植物源生物殺蟲劑。醛脫氫酶（TcALDH）和GDSL脂肪酶（TcGLIP）是除蟲菊酯生物合成途徑中的關鍵限速酶。為探究TcALDH和TcGLIP基因的功能，該研究從除蟲菊無性系‘W99中克隆得到TcALDH和TcGLIP基因的啟動子，并通過生物信息學分析、組織化學染色（GUS染色）、熒光素酶報告實驗和外源植物激素處理實驗對其啟動子的調控元件、啟動子活性、激素誘導特異性和組織特異性進行分析。結果表明：（1）克隆得到的TcALDH和TcGLIP啟動子序列分別為2 848、1 343 bp，均含有多個與逆境應答和激素信號相關的順式作用元件。（2）分別構建了啟動子和熒光素酶融合的植物表達載體，在煙草葉片中觀察熒光成像發現，TcALDH啟動子具有茉莉酸甲酯（MeJA）和脫落酸（ABA）激素誘導特異性。（3）用MeJA和ABA處理除蟲菊‘W99組培苗發現，TcALDH的表達量在12 h內受ABA誘導時上調，受MeJA誘導時先升高后降低，TcGLIP的表達量受ABA和MeJA誘導下調。（4）分別構建了TcALDH和TcGLIP啟動子與GUS基因融合的植物表達載體，轉化煙草并對其轉基因葉片進行GUS活性染色發現，TcALDH啟動子在煙草葉片腺體、腺毛頭部及葉肉細胞中表達，而TcGLIP啟動子僅在煙草葉肉細胞中表達。綜上認為，TcALDH和TcGLIP的啟動子具有組織特異性，TcALDH啟動子具有MeJA和ABA激素誘導特性。該研究結果為除蟲菊TcALDH和TcGLIP基因參與除蟲菊酯合成的調控機制提供了新見解。

關鍵詞： 除蟲菊， 醛脫氫酶（TcALDH）， GDSL脂肪酶（TcGLIP）， 啟動子， 功能分析

中圖分類號：? Q943

文獻標識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2023）07-1276-11

收稿日期：? 2022-10-18

基金項目：? 國家重點研發項目（2019YFD1001500）； 中央高?；A研究基金（2662019FW016）； 國家自然科學基金（32160718）。

第一作者： 周黎（1998-），碩士，研究方向為觀賞植物生理與調控，（E-mail）zhouli@webmail.hzau.edu.cn。

通信作者：? 王彩云，博士，教授，研究方向為花卉生理與品質及其花卉應用，（E-mail）wangcy@mail.hzau.edu.cn。

Cloning and functional analysis of promoter of TcALDH

and TcGLIP genes in Tanacetum cinerariifolium

ZHOU Li1， LI Jiawen1， XU Zhizhuo1， ZENG Tuo2， WANG Caiyun1*

（ 1. Key Laboratory of Horticultural Plant Biology （HZAU）， MOE， Wuhan 430070， China;

2. School of Life Sciences， Guizhou Normal University， Guiyang 550001， China ）

Abstract：? Natural pyrethrin is a green botanical insecticide that extracted from the aboveground tissues of pyrethrum （Tanacetum cinerariifolium）. Aldehyde dehydrogenase （TcALDH） and GDSL lipase （TcGLIP） are key rate-limiting enzymes involved in pyrethrin biosynthesis pathway in pyrethrum. The promoters of TcALDH and TcGLIP genes were cloned from the genomic DNA of pyrethrum clone ‘W99 in order to investigate the regulatory mechanism of these genes. The regulatory elements， activity， hormone specificity and tissue inducibility of the two promoters were analyzed through bioinformatics analysis， histochemical staining （GUS staining）， luciferase reporting， and exogenous hormone treatment. The results were as follows： （1） Using pyrethrum genomic DNA as a template， specific primers were used to clone the pTcALDH and pTcGLIP fragments. The sequence lengths of pTcALDH and pTcGLIP were 2 848 and 1 343 bp， respectively， and the promoter analysis software the PlantCARE predicted that they both contained multiple cis-elements related to stress response and hormone signals. （2） The plant expression vectors fused by pTcALDH and pTcGLIP and luciferase report gene were constructed， and were transformed into tobacco （Nicotiana benthamiana） to analyse hormone inducibility by observing the fluorescence imaging in tobacco leaves. The results demonstrated that the pTcALDH displayed typical hormone inducibility of methyl jasmonate （MeJA） and abscisic acid （ABA）， whereas the pTcGLIP showed no response. （3） The tissue culture seedlings of pyrethrum ‘W99 were treated with MeJA and ABA， the expression of TcALDH was up-regulated by ABA within 12 h， and first increased and then decreased under MeJA treatment; the expression of TcGLIP was down-regulated by ABA and MeJA. （4） We constructed the expression vectors of pTcALDH and pTcGLIP fused with GUS reporters and transformed them into tobacco， then the transient transformation of tobacco drived the expression of GUS gene and showed initiating activity. It was found that the pTcALDH expressed in the glands， glandular hair heads and mesophyll of the leaves， while the pTcGLIP was only expressed in the parenchyma cell. These results indicated that the pTcALDH and pTcGLIP were tissue-specific promoters， and the pTcALDH appeared MeJA-inducible and ABA-inducible characteristics. This study provides a new insight into the regulatory mechanism of TcALDH and TcGLIP genes involved in pyrethrin synthesis.

Key words： Tanacetum cinerariifolium， TcALDH， TcGLIP， promoter， functional analysis

除蟲菊（Tanacetum cinerariifolium）作為一種多年生菊科植物，幾個世紀以來一直被用于提取綠色植物源殺蟲劑除蟲菊酯（Lybrand et al.， 2020）。其因提取于花頭的除蟲菊酯具有殺蟲迅速、無富集易降解、對哺乳動物毒性小、適用于敏感人群等特性，被廣泛應用于有機農業和家居防治（Nelson， 1974），其花頭還能夠釋放大量揮發性萜烯（E）-beta-法尼烯 ［（E）-beta-farnesene， ESymbolbA@F］， 能夠在田間吸引瓢蟲驅避蚜蟲（Li et al.， 2019; Li et al.， 2021），同時吸引大量授粉昆蟲如食蚜蠅等（Zeng et al.， 2021; 曾拓等，2021）。因此，除蟲菊也作為一種間作作物，在我國云南有廣泛的應用（周黎等，2022）。全世界對除蟲菊酯的需求較大，將其作為天然植物源殺蟲劑以避免過度使用化學合成殺蟲劑（Suraweera et al.， 2017）。因此，如何提高除蟲菊酯的含量一直是除蟲菊產業和基礎研究的熱點和重點。

除蟲菊酯在植物體內由單萜羧基部分（菊酸和除蟲菊酸）和酮醇部分（除蟲菊酮醇、茉莉酮醇和瓜葉酮醇）酯化形成（Staudinger & Ruzicka 1924; Mossa et al.， 2018）。酸前體來源于萜烯途徑的質體甲基赤蘚醇-4磷酸（methylerythritol 4-phosphate， MEP）途徑（Lybrand et al.， 2020），酮醇前體來源于茉莉酸類激素（jasmonates， JAas）途徑（Matsuda et al.， 2005）。在除蟲菊酯單萜合成模型中，兩分子二甲基烯丙基二磷酸（dimethylallyl pyrophosphate， DMAPP）首先在腺體中依次由菊基二磷酸合成酶（chrysanthemyl diphosphate synthase， CDS）、乙醇脫氫酶2（alcohol dehydrogenase 2， ADH2）、醛脫氫酶 1（aldehyde dehydrogenase 1， ALDH1）催化形成前體分子菊酸，隨后菊酸被運輸到腺體下方的皮下組織，最終在種子和果皮中被GDSL脂肪酶（GDSL lipase protein， GLIP）催化形成除蟲菊酯，后被胚胎吸收轉移至幼苗組織中（Kikuta et al.， 2012; Ramirez et al.， 2012; Xu et al.， 2018; Lybrand et al.， 2020; Li et al.， 2022a）。TcALDH參與除蟲菊酸部分最后一步催化反應合成菊酸CoA，菊酸CoA和酮醇則在TcGLIP的催化作用下通過酯鍵相連合成最終產物除蟲菊酯（Kikuta et al.， 2012; Wang et al.， 2022）。由此可知， TcALDH和TcGLIP是除蟲菊酯合成的關鍵限速酶基因。目前，已經從擬南芥和棉花中克隆到大量ALDH和GLIP基因的啟動子（Hou & Bartels， 2015; Guo et al.， 2017; Ma et al.， 2018; Yang et al.， 2021），此外，高粱、大豆以及黃花蒿等物種中也報道了ALDH基因的啟動子。然而從除蟲菊中僅分離出一個具有腺體特異表達的菊基二磷酸合成酶基因TcCHS的啟動子（Sultana et al.， 2015）。因此，研究其他除蟲菊酯合成酶基因的啟動子是解析除蟲菊酯合成調控機制的前提。

茉莉酸及其衍生物不僅作為反應底物參與除蟲菊酯酮醇部分的生物合成，同時作為防御應激類激素調控除蟲菊酯的合成（Matsuda et al.， 2005; Li et al.， 2018）。課題組前期進行了茉莉酸甲酯處理下的白花除蟲菊葉片和花期轉錄組數據分析，注釋到了很多與除蟲菊酯合成代謝相關的基因?；诖?，本研究通過除蟲菊無性系‘W99克隆得到TcALDH和TcGLIP基因的啟動子序列，對其調控元件、啟動子活性、激素誘導特異性和組織特異性進行了分析，進一步揭示除蟲菊酯的合成機制及代謝調控中植物激素的作用，從而為培育除蟲菊優良品種和提高除蟲菊酯含量提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

除蟲菊無性系‘W99的葉片取自華中農業大學組培室。大腸桿菌DH5α 和根癌農桿菌GV3101、EHA105購自上海唯地生物技術有限公司。用于轉化的本氏煙草（Nicotiana benthamiana）在 25 ℃、16 h光照/8 h黑暗條件的組培室中生長。

1.2 啟動子克隆

利用RaPure plant DNA mini kit（美基生物， 中國）提取除蟲菊葉片的gDNA作為模板，依據除蟲菊基因組（Yamashiro et al.， 2019），設計TcALDH基因啟動子的特異引物F-ALDH-pro及ORF下游R-ALDH-ORF（表1），TcGLIP基因啟動子的特異引物F-GLIP-pro及ORF下游R-GLIP-ORF（表1），利用高保真酶High-Fidelity Master Mix（MCLAB， China）進行擴增，將擴增產物連接到pBLUE-T載體（ZOMANBIO， China），轉化大腸桿菌，挑選單菌落進行測序。利用除蟲菊基因組對獲得的片段進行檢驗。利用PlantCARE軟件對啟動子的元件進行預測。

1.3 載體構建

以測序正確的質粒為模板，分別利用含有同源重組片段的引物Luc-aldh-F、Luc-aldh-R、Luc-glip-F、Luc-glip-R（表1）進行擴增?；厥誔CR產物，連接到經HindⅢ酶切的pGreenII 0800-LUC載體上，轉化大腸桿菌，挑選單菌落進行測序，選取測序正確的載體轉化GV3101農桿菌。

以測序正確的質粒為模板，分別利用含有同源重組片段的引物F-aldh121pro、R-aldh121pro、F-glip121pro、R-glip121pro（表1）進行擴增?；厥誔CR產物，連接到經Hind III和BamH I酶切的PBI121載體上，轉化大腸桿菌，挑選單菌落進行測序，選取測序正確的載體轉化EHA105農桿菌。

1.4 煙草中LUC瞬時表達和熒光成像

將含有重組pGreenⅡ 0800-LUC載體的農桿菌單菌落接種到發根農桿菌培養基（YEB）中，培養至OD600=0.5，5 000 r·min-1離心7 min后，用MES侵染液重懸，調節至OD600=1.0。選取生長2至3周的本氏煙草，用無針頭的注射器將農桿菌菌液注射到煙草葉片，葉片左半部分注射含有空載pGreenⅡ 0800-LUC載體的農桿菌，右半部分注射含有重組pGreenⅡ 0800-LUC載體的農桿菌。注射后的煙草置于人工氣候室中培養2 d后，在煙草葉片上噴施50 μmol·L-1的脫落酸（abscisic acid， ABA），濃度參考胡慧敏等（2021）的方法，或噴施100 μmol·L-1的茉莉酸甲酯（methyl jasmonate， MeJA），濃度參考陳雨倩等（2021）的方法，以噴施清水植株的葉片作為對照。放置12 h后，將Dual-Luciferase Reporter Assay 試劑盒中的Luaferase Assay Substrate與Luaferase Assay Buffer II混合，涂抹在煙草的注射區，然后使用LB 985 Nightshade system（Berthold，Bad Wildbad，德國）儀器觀察熒光。

1.5 不同激素處理下除蟲菊TcALDH和TcGLIP基因表達分析

MeJA處理：以繼代培養一個月的除蟲菊‘W99無性系作為實驗材料，使用5 mL的2 mmol·L-1的MeJA溶液噴施處理組培苗，濃度參考（Buraphaka & Putalun， 2020），擰緊瓶蓋，培養0、4、12 h后，將實驗材料葉片放置在液氮中迅速冷卻后，保存于-80 ℃冰箱。

ABA處理：以繼代培養一個月的除蟲菊‘W99無性系作為實驗材料，使用5 mL的1 mmol·L-1的ABA溶液噴施處理組培苗，擰緊瓶蓋，培養0、4、12 h后，將實驗材料葉片放置在液氮中迅速冷卻后，保存于-80 ℃冰箱。

利用Real-time qPCR分析兩種激素處理后的基因表達水平。RNA提取使用植物RNA提取試劑盒Ultrapure RNA Kit（CWBIO康為世紀生物科技有限公司），反轉錄形成cDNA，使用EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（TRAN北京全式金生物技術有限公司）進行熒光定量分析，熒光定量的儀器為Applied Biosystems 7500 platform，試劑為2×Sybr Green qPCR Mix（Aidlab，北京艾德萊生物科技有限公司），熒光定量使用的引物為TcALDH-RT-F、TcALDH-RT-R、TcGLIP-RT-F、TcGLIP-RT-R、TcGAPDH-F和TcGAPDH-R（表1）（Ramirez et al.， 2012）。

1.6 煙草遺傳轉化篩選及GUS表達

將含有pTcGLIP-GUS質粒的農桿菌單菌落接種到YEB液體培養基中，培養至OD600=0.5，5 000 r·min-1離心7 min后，用液體MS（Murashige & Skoog）基本培養基重懸，調節至OD600=0.5。將煙草葉片切成0.5 cm×0.5 cm，放入農桿菌菌液，侵染10 min后，在濾紙上晾干，將侵染后的煙草葉片轉移至共培養培養基上，培養基配方為MS基本培養基+2.25 mg·L-16-芐氨基嘌呤（6-benzyladenine， 6-BA）+0.3 mg·L-11-萘乙酸（1-naphthylacetic acid， NAA），黑暗條件下培養2 d后，將葉片轉移至篩選培養基，培養基配方為MS基本培養基+2.25 mg·L-1 6-BA+0.3 mg·L-1 NAA+400 mg·L-1頭孢霉素（cefotaxime， Cef）+50 mg·L-1 卡那霉素（kanamycin， Kan），每2周繼代一次，當抗性芽生長至1 cm時，將抗性芽切下，放置在含有400 mg·L-1 Cef和50 mg·L-1 Kan的MS培養基中，繼續培養。

提取卡納霉素抗性本氏煙草葉片的DNA，以其為模板，用F-aldh121pro作為上游，TcALDH啟動子特異引物R-aldh-pro280作為下游，檢驗pTcALDH-GUS轉基因煙草；用F-glip121pro作為上游，R-GUS-T作為下游，檢驗pTcGLIP-GUS轉基因煙草，轉化所用菌株為陽性對照，野生煙草為陰性對照。植物DNA提取試劑盒為HiPure Plant DNA Mini Kit（美基生物，中國），PCR擴增mix為2×Taq Master Mix（近岸蛋白質科技有限公司，中國）。

將繼代培養一個月的陽性煙草用GUS Staining Kit（Coolaber， 中國）進行染色，實驗步驟參照試劑盒說明書，染色后用70%的酒精脫色至葉片完全褪綠后，在體視顯微鏡下觀察染色情況。每個啟動子均取3個獨立的轉基因株系進行染色。

2 結果與分析

2.1 TcALDH和TcGLIP啟動子克隆

以提取的除蟲菊基因組DNA為模板，使用特異性引物F-ALDH-pro和R-ALDH-ORF克隆得到TcALDH基因ATG上游2 848 bp的啟動子序列，使用特異性引物F-GLIP-pro和R-GLIP-ORF擴增TcGLIP啟動子，獲得條帶大小為1 343 bp（圖1）。分別命名為pTcALDH和pTcGLIP。

2.2? pTcALDH和pTcGLIP調控元件分析

利用PlantCARE軟件分析了pTcALDH和pTcGLIP的順式作用元件。結果顯示在pTcALDH序列2 848 bp 的區域共檢測到43種210個作用元件，在pTcGLIP序列1 343 bp的區域檢測到30種116個作用元件。pTcALDH和pTcGLIP均含有多個核心啟動子元件（TATA-box）和增強子元件（CAAT-box）等基本特征元件，此外還包含許多與激素響應［MeJA、水楊酸（salicylic acid，SA）、生長素（auxin）、ABA、赤霉素（gibberellin，GA）等］，脅迫響應（損傷、低溫、干旱等）和光響應相關的元件（表2，表3）。這兩個基因啟動子序列均含有MeJA響應元件（TGACG-motif和CGTCA-motif）和ABA響應元件（ABRE）。

2.3 pTcALDH和pTcGLIP活性和激素誘導特性分析

將含有pTcALDH-LUC和pTcGLIP-LUC表達載體的農桿菌分別注射煙草葉片，熒光成像結果顯示，含有pTcALDH-LUC和pTcGLIP-LUC載體的農桿菌注射部位，熒光強度高于空載對照，說明pTcALDH和pTcGLIP能夠驅動LUC基因的表達，具有啟動子活性。注射含有pTcALDH-LUC表達載體農桿菌的葉片在ABA和MeJA激素處理后，熒光強度顯著高于清水對照，表明pTcALDH具有ABA和MeJA激素誘導特性（圖2）。而注射含有pTcGLIP-LUC表達載體農桿菌的葉片在ABA和MeJA激素處理后，熒光強度低于清水對照（圖2）。

2.4 不同激素處理下除蟲菊葉片TcALDH和TcGLIP基因表達分析

用ABA和MeJA處理除蟲菊組培苗，檢測TcALDH和TcGLIP基因轉錄水平。結果表明，MeJA和ABA處理可顯著影響除蟲菊TcALDH和TcGLIP基因的表達，其中TcALDH的表達受ABA誘導上調，受MeJA誘導表達量先升高后降低；TcGLIP的表達受ABA和MeJA誘導下調（圖 3）。

2.5 pTcALDH和pTcGLIP組織特異性分析

將TcALDH和TcGLIP啟動子區域與GUS報告基因融合，轉化煙草，獲得了4個獨立的pTcALDH-GUS轉基因株系和5個獨立的pTcALDH-GUS轉基因株系。對這些轉基因株系進行GUS染色，結果表明，在野生型植物中無任何組織觀察到藍色，在pTcALDH-GUS轉基因煙草葉的腺毛頭部顯現出明顯藍色，而在pTcALDH-GUS轉基因煙草葉中未發現明顯的組織特異染色（圖4）。

3 討論與結論

本研究利用除蟲菊基因組及PCR測序驗證，獲得了TcALDH和TcGLIP的啟動子序列。pTcALDH和pTcGLIP序列均含有多個核心啟動子元件（TATA-box）和增強子元件（CAAT-box）等基本特征元件，表明這兩個基因的啟動子擁有典型啟動子的功能。此外，pTcALDH和pTcGLIP區域還包含了激素響應、脅迫響應和光響應元件。啟動子序列分析表明，pTcALDH和pTcGLIP均含有參與MeJA響應的CGTCA基序和ABA響應基序，這恰好解釋了MeJA可以促進除蟲菊酯的合成。類似地，在pTcALDH和pTcGLIP中均發現了MBS元件，它是參與干旱誘導的MYB的結合位點，而有趣的是，之前Suraweera等（2017）

研究表明除蟲菊酯的產量受干旱的影響。除了除蟲菊中TcALDH和TcGLIP基因會響應機械損傷使得除蟲菊酯含量上升外（Kikuta et al.， 2012），黃花蒿中AaALDH基因也會因為傷害處理而上調（王煥燕，2016），這可能與損傷響應元件W-box相關。綜上可知，pTcALDH和pTcGLIP序列包含MYB、MYC、BZIP、WRKY等轉錄因子可結合的元件，如MBS、RBRE、G-box、W-box等（Yang et al.， 2020; Fu et al.， 2021），因此推測這兩個基因的表達可能受這些轉錄因子的調控。最新的研究發現證實了白花除蟲菊中TcMYC2和TcMYB8均可以通過上調TcGLIP基因表達進而提高葉片中除蟲菊酯的含量（Zhou et al.， 2022; Zeng et al.， 2022）。

植物次生代謝物質合成受茉莉酸（jasmonic acid，JA）、ABA、SA等植物激素的調控（Lv et al.， 2017）。TcALDH作為除蟲菊酯合成關鍵基因，其啟動子具有ABA和MeJA激素誘導特性。TcALDH的基因表達量在ABA誘導下上調，在MeJA誘導下先顯著上升后下降。這與前人的研究結果基本一致，除蟲菊中TcALDH和TcGLIP基因的表達受MeJA的影響（Li et al.， 2018），進一步證明MeJA可以調控除蟲菊酯合成。在除蟲菊的近緣種黃花蒿中，用MeJA處理黃花蒿，AaALDH1基因表達量也有顯著的提高（王煥燕，2016）。這說明MeJA也會調控青蒿素的合成。與TcALDH處理結果相反的是，TcGLIP啟動子不具備MeJA和ABA誘導特異性，且處理后基因表達量顯著下降。這與前人研究報道的擬南芥NtGLIP1不受JA調控結果基本一致，NtGLIP1僅為SA響應分泌蛋白（Oh et al.， 2005）。而NtGLIP2可以響應JA，并通過響應生長素抵御生物脅迫（Lee et al.， 2009）。擬南芥、棉花和除蟲菊的ALDH基因啟動子均能響應ABA，除此之外，除蟲菊pTcALDH可以響應MeJA；擬南芥和棉花GLIP基因啟動子均可響應乙烯（ethylene， ET），且擬南芥NtGLIP基因啟動子具有生長素誘導特性，這在除蟲菊中未見報道（Kirch et al.， 2005; Hou & Bartels， 2015; Guo et al.， 2017; 胡陽光，2019 ）。這說明參與代謝合成的基因通常具有各自的激素誘導特異性，通過響應一種或者多種植物激素調控次生代謝物質合成，在植物生物或非生物脅迫中發揮作用。

Wasternack等（2019）研究表明MeJA能夠促進次生代謝物在植物體內的積累。MeJA短效處理可以促進除蟲菊酯合成基因的瞬時上調，但不能維持較高的除蟲菊酯含量，JA路徑部分合成酶基因和TcGLIP基因表達量反而下調（Zeng et al.， 2022）。除蟲菊酯前體物質主要在腺體中合成，被運輸到細胞外形成最終產物，儲存在花頭的子房中（王鳳姣等，2021）?；^中具有豐富的特殊結構，如分泌管/腔或胞外空間（Ramirez et al.， 2012）。然而在葉片中并沒有發現類似的結構或空間來儲存除蟲菊酯。除蟲菊毛狀根中也僅存在極低含量的除蟲菊酯（Li et al.， 2022b）。這意味著除蟲菊酯的生物合成可能受到強大的負反饋，以避免除蟲菊酯的過度積累。植物體內這種負反饋調節機制可能通過抑制GLIP酶的活性從而降低除蟲菊酯的含量。

此外，GUS組織染色結果表明，TcALDH主要在腺體中表達，而TcGLIP僅在皮下薄壁細胞表達。這些結果基本與前人的研究一致，即腺體中表達的TcALDH用以合成菊酸，薄壁細胞中表達TcGLIP用以合成除蟲菊酯（Kikuta et al.， 2012; Ramirez et al.， 2012; Xu et al.， 2018）。黃花蒿ALDH1基因只在成熟的蓮座葉的腺毛體中表達（王煥燕，2016）。然而，本研究的結果與前人的預測略有不同，本研究表明薄壁細胞也可能具有表達TcALDH的能力，TcALDH基因并非為腺體特異表達。擬南芥中NtGLIP1和其他NtGLIPs信號同樣定位在細胞壁或者胞外（Oh et al.， 2005; Lee et al.， 2009）。通過亞細胞定位研究擬南芥NtALDH和NtGLIP，NtALDH蛋白多分泌于質體和細胞質中，NtGLIP蛋白通常分布在細胞壁或胞外（Oh et al.， 2005; Lee et al.， 2009; Hou & Bartels， 2015）。當前報道僅分析了棉花GhALDH和GhGLIP基因組數據和啟動子的元件，在空間表達研究上未見報道（Guo et al.， 2017; Ma et al.， 2018）。

本研究分析了pTcALDH和pTcGLIP的調控元件、啟動子活性、激素誘導特異性和組織特異性。其中pTcALDH具有MeJA和ABA激素誘導特異性，且這兩種激素影響除蟲菊酯合成基因的表達水平。TcALDH主要定位在腺體中，而TcGLIP主要定位在胞外，這再次驗證了菊酸的合成部位在腺體而除蟲菊酯的合成部位在胞外。本研究可為進一步探討除蟲菊中TcALDH和TcGLIP基因的表達調控機制提供理論參考依據。

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（責任編輯 周翠鳴）