功能菌群對柴油污染土壤的修復及菌群演替特性

趙中汀，李 爽，朱春昀，馬會強

（遼寧石油化工大學 環境與安全工程學院，遼寧 撫順 113001）

全球發生過多起柴油污染事件，其造成的巨大損失無法估量，而且影響還在持續[1-2]。柴油在開采、加工和運輸等過程中會泄漏到地面，對土壤環境造成污染[3]。工業的持續發展和對燃料的需求不斷增長，使排放的污水和污泥中含有的柴油類物質不斷增加，對周圍環境造成嚴重危害[4-5]。柴油污染物進入到土壤后，其腐蝕性成分石油烴不僅對土壤環境造成污染，而且還會通過蒸發等途徑進入到大氣環境中，通過滲透遷移到地下水環境中，然后轉移到植物及動物體內，最終對人類健康造成危害[6]。柴油污染已經成為急需解決的問題，柴油污染的修復方法主要有物理修復方法、化學修復方法和生物修復方法。物理修復方法具有操作復雜、成本高的特點[7]；化學修復方法具有一定的危險性，且操作復雜，易產生其他污染；生物修復方法有植物修復方法、動物修復方法和微生物修復方法，其中微生物修復方法具有安全可靠、操作簡單、利于可持續發展的優點，被認為是一種安全、經濟、高效和可持續的技術[8-9]，其原理是通過微生物將有機物的有害成分降解為無害物質，如二氧化碳和水。Q.Xia 等[10]研究發現，在粗質地的土壤中真菌物種豐富度和多樣性均有所提高，土壤性質是影響微生物群落結構和組成的主要因素之一。T.G.Weldmichael 等[11]研究發現，不同土壤深度的微生物呼吸速率不同，表層土壤的微生物呼吸速率高于地下深層土壤。M.Zhang 等[12]研究發現，由于土壤性質的不同，不同恢復類型的細菌和真菌群落存在明顯差異。S.Tajik等[13]研究發現，土壤微生物的分布與地形的屬性有關，所設計的地形參數為發現微生物群落變化提供了低成本、可訪問的數據和準確的模型。一般來說，若柴油在土壤中質量分數過高也會使微生物中毒，從而抑制微生物的活性[14]。

本研究以柴油為主要碳源，進行柴油污染土壤人工模擬實驗，篩選出可降解柴油的高效菌群。通過高通量測序技術，分析了在不同條件下柴油高效降解菌群的多樣性以及對柴油的降解效果。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

試劑：鹽酸（質量分數為37%），天津大茂化學試劑廠；氯化鈉、氯化鈣、氯化鈷、氯化鋇，天津博迪化工有限公司；正己烷，天津富宇精細化工有限公司；酚酞，天津登峰化學試劑有限公司；氫氧化鉀、磷酸氫二鉀、硫酸銨、氯化鎂、乙二胺四乙酸（EDTA），天津恒興化學試劑制造有限公司；磷酸二氫鈉，沈陽新興試劑廠；硫酸鋅，天津光復精細化工研究所；硫酸鐵、硫酸銅、氯化錳，國藥集團化學試劑有限公司；鉬酸鈉，合肥工業大學化學試劑廠。本實驗所用試劑均為分析純。

儀器：HZQ-Q 型全溫振蕩器，哈爾濱東聯電子技術開發有限公司；UV-5100 型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；LDZX-40KB 型立式熱壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司。

1.2 無機鹽培養基

常量溶液：磷酸氫二鉀1 550.0 mg/L，磷酸二氫鈉850.0 mg/L，硫酸銨2 000.0 mg/L，氯化鎂100.0 mg/L。

微量溶液：硫酸鋅2.0 mg/L，氯化鈣1.0 mg/L，硫酸鐵5.0 mg/L，鉬酸鈉0.2 mg/L，硫酸銅0.2 mg/L，氯化鈷0.4 mg/L，氯化錳1.0 mg/L。

制備條件和過程：在無菌環境中，按照配方分別稱取定量藥品，加入所需水量使藥品溶解；溶解后的藥品混合為常量溶液和微量溶液；用移液管移取99 mL 常量和1 mL 微量無機鹽，并將其加入無菌錐形瓶中，調節pH=7.0。

1.3 柴油降解菌群的篩選及馴化

取10 g 柴油污染場地土樣置于裝有100 mL 蒸餾水的250 mL 錐形瓶中，在15 ℃下以150 r/min 轉速振蕩培養3～4 h。對上述培養液進行馴化，采取柴油質量濃度遞增的方式，連續培養9 次，柴油質量濃度按照500、1 000、1 500、2 000 mg/L 遞增。具體步驟為：從初始培養液中移取4 mL 加入至以柴油為唯一碳源的100 mL 無機鹽液體培養基中，其中柴油質量濃度為500 mg/L，在15 ℃下培養20 d，連續培養2次；從上一培養液中移取4 mL 加入至以柴油為唯一碳源的100 mL 無機鹽液體培養基中，其中柴油質量濃度為1 000 mg/L，在15 ℃下培養20 d，連續培養2次；從上一培養液中移取4 mL 加入至以柴油為唯一碳源的100 mL 無機鹽液體培養基中，其中柴油質量濃度為1 500 mg/L，在15 ℃下培養20 d，連續培養2次；從上一培養液中移取4 mL 加入至以柴油為唯一碳源的100 mL 無機鹽液體培養基中，其中柴油質量濃度為2 000 mg/L，在15 ℃下培養20 d，連續培養3次。篩選出菌群用于柴油污染土壤降解實驗。

1.4 菌群修復污染土壤模擬實驗

1.4.1 柴油污染環境的構建 構建柴油污染環境所需的土壤來自無柴油污染的場地，柴油為市售0#柴油。

取兩個等份（每份150 g）土壤制成土柱，對兩個土柱進行滅菌處理，并分別命名為A 土柱和B 土柱。向A 土柱中投加柴油降解菌群和一定量的蒸餾水，使土壤含水率達到50%；B 土柱不投加菌群，僅投加蒸餾水使土壤含水率達到50%，作為空白對照組。同時，向兩個土柱中加入1 000 mg/kg 柴油。1.4.2 柴油降解情況分析（1）測定土壤中殘留柴油質量分數。在培養第5、10、15、20、30 d，分別測定A、B 土柱內土壤中殘留的柴油質量分數。分別移取A 土柱和B 土柱的土壤樣品，向其中加入去離子水20 mL、正己烷30 mL，并在振蕩器上充分振蕩1 h，倒入布氏漏斗內進行真空抽濾；分別用30、20 mL 正己烷和20 mL 去離子水清洗容器瓶，將清洗液倒入布氏漏斗內一并進行真空抽濾，以此減少損失；將抽濾后的清液移入250 mL 分液漏斗中，搖勻后靜置分層，收集下層水相于干凈燒杯中，將正己烷萃取相通過無水硫酸鈉填充的過濾層，收集于干凈的100 mL 蒸餾瓶中；再將燒杯中的水相倒回分液漏斗，分別用30、20 mL 正己烷萃取2 次，合并過濾后的有機相置于先前的蒸餾瓶中，將蒸發裝置放置于水浴中濃縮，然后用正己烷在10 mL 比色管中定容。使用紫外分光光度計在225 nm 處測定吸光度，對照標準曲線，確定其質量分數。如果樣品質量分數過高，超出了標準曲線范圍，則稀釋后再測定。（2）測定柴油降解菌群呼吸強度。在培養第5、10、15、20、30 d，分別測定A 土柱內土壤中CO2的質量分數，該值可表示土壤中菌群的呼吸強度。根據土壤呼吸強度的測定原理，采取直接吸收法測定。方法如下：稱取3 g 土樣，用紗布包好，再用繩子將其懸掛于盛有一定量KOH 的廣口瓶內，密閉，使土樣中釋放出來的CO2被瓶內的KOH 吸收；培養1 d后取出土樣，向瓶內加入過量BaCl2溶液及酚酞指示劑，用鹽酸滴定至無色。將沒有投加菌群的B 土柱的土樣作為空白對照。

（3）分析菌群在不同土壤深度對柴油的降解效果。投加A、B 土柱中的菌群降解30 d 后，分別測定A、B 土柱內深度為0、5、10、15、20 cm 處土壤中殘留柴油質量分數，通過土壤中柴油的殘留量分析菌群在不同土壤深度對柴油的降解能力。

1.5 柴油降解菌群的高通量測序

在構建的柴油污染土壤中取樣，在投加菌群第0 d 時取樣制成樣本A1；在降解30 d 后于表層（0～1 cm）處取樣制成樣本A2；在降解30 d 后于深層（19～20 cm）處取樣制成樣本A3。將以上制成的所有樣本送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行高通量測序。

2 結果和分析

2.1 菌群對柴油污染土壤的降解效果

2.1.1 菌群降解土壤中柴油效率 以不加柴油降解菌群的滅菌土壤為對照組，考察了投加菌群前后土壤中柴油降解率的變化，結果如圖1 所示。由圖1 可知，投加菌群后土壤中柴油降解率有明顯增加；在降解第5、10、15、20、30 d，投加菌群的樣品中柴油的降解率分別為47.3%、59.0%、70.1%、72.5%、74.3%，未投加菌群的樣品中柴油的降解率分別為3.2%、5.7%、9.2%、15.5%、17.0%；菌群對土壤中的柴油降解能力穩步提升，在降解時間為5～15 d 時，菌群對柴油的降解速率增加較快，此時菌群的生長繁殖最旺盛，而在降解時間為15～30 d時，菌群對柴油的降解速率逐步放緩，營養物質的減少使菌群生長繁殖處于穩定狀態，與菌群生長規律相一致。

圖1 投加菌群前后土壤中柴油降解率的變化Fig.1 Changes of diesel degradation rate in soil before and after adding flora

2.1.2 土壤中菌群的呼吸強度分析 土壤中CO2質量分數可以動態地反映土壤中菌群的呼吸強度。圖2 為投加菌群前后土壤中CO2質量分數的變化。由圖2 可以看出，在第5、10、15、20、30 d 時，投加 菌 群 的CO2質 量 分 數 分 別 為1.30、3.99、13.27、18.56、22.07 g/kg，未投加菌群的CO2質量分數分別為0.05、0.10、0.15、0.31、0.56 g/kg；在降解開始至降解時間為5 d 時，CO2質量分數較低，這是由于柴油降解菌群投入土壤后需要一定的時間適應新環境，沒有立即利用營養物質，因此該階段菌群生長速率緩慢；隨著降解時間的增加，土壤中CO2質量分數逐漸增大，尤其是在降解時間為10～20 d 時CO2釋放速率最快，這是由于土壤中微生物在適應新環境后開始代謝土壤中的柴油污染物，進行生長繁殖，使菌群數量逐漸增多，呼吸強度增加，土壤中菌群的呼吸強度隨著時間的增加而增強；在降解時間大于20 d 時，菌群的呼吸強度增加幅度開始減小，這是因柴油質量分數的降低、營養物質的限制、微生物生長繁殖速度減緩造成的。

圖2 投加菌群前后土壤中CO2質量分數的變化Fig.2 Changes in the cumulative release of CO2 in soil before and after adding flora

2.1.3 菌群在不同土壤深度對柴油的降解效果圖3 為柴油在不同土壤深度的質量分數。由圖3 可知，在土壤深度為0、5、10、15、20 cm 處投加菌群土壤中柴油的質量分數分別為229.00、261.00、294.00、343.00、421.00 mg/kg，未投加菌群土壤中柴油 的 質 量 分 數 分 別 為756.00、804.00、865.00、899.00、905.00 mg/kg；投加菌群后土壤中的殘余柴油質量分數明顯低于未投加菌群的殘余柴油質量分數；土壤中不同深度菌群對柴油均有較明顯的降解效果，隨著土壤深度的增加，柴油質量分數也有所增加。這是由于隨著土壤深度的增加，其氧氣質量分數減少，菌群活性隨之降低，菌群對柴油的降解效果變弱，柴油降解菌群對土壤中柴油的降解效果隨著土壤深度的增加而逐漸降低。與未投加菌群的土壤樣本相比，在投加菌群的樣本中，菌群對土壤中柴油的降解率在土壤深度為20 cm 時達到53.5%。

圖3 柴油在不同土壤深度的質量分數Fig.3 Mass fraction of diesel at different depths in soil

2.2 柴油污染土壤中柴油降解菌群多樣性分析

對土壤樣本進行了多樣性分析，結果如表1所示。

表1 Alpha 多樣性分析Table 1 Alpha diversity analysis

由表1 可以看出，測序的三個樣本Coverage 指數均大于0.993，說明測序結果具有較高的可信性。

由Shannon 指數可以看出，樣本A2 的物種多樣性高于樣本A3，說明在表層氧氣充足的狀態下，菌群的繁殖狀況優于深層缺氧的環境；樣本A2 和A3 的物種多樣性均遠高于樣本A1，說明該柴油降解菌群在柴油污染環境中具有較強的適應能力，能夠高效地繁殖。

由Chao 指數可以看出，樣本A2 中微生物的總數大于樣本A3，這是由于深層土壤中氧氣質量分數低，會影響微生物的生長繁殖；樣本A2 和A3 中物種的豐度均高于A1，說明將菌群投加到柴油污染環境中可以較好地進行生命代謝活動，使其物種豐度增大。

2.3 柴油降解菌群優勢菌種分析

土壤滅菌后，分別對樣本A1、A2、A3 中的微生物群落結構進行分析，得到相對豐度3D 柱狀圖，結果如圖4 所示。由圖4 可知，樣本A1 主要由菌群Proteobacteria、Firmicutes以及少量Bacteroidetes組成；樣本A2 中Proteobacteria相對豐度占比提高，由75.4% 增加到80.6%，增加幅度為5.2%，說明Proteobacteria可以較好地適應柴油污染土壤的環境，并可以在其中生長繁殖，結合土壤中柴油的殘留質量分數判斷，Proteobacteria是降解柴油的主要菌群；樣本A3 與A2 的群落結構差異較大，樣本A3中主要的優勢菌群為Firmicutes，其相對豐度占比為79.9%，而在A2 中其相對豐度占比僅為8.1%，Firmicutes的相對豐度增加幅度為71.8%，這是由于深層土壤中氧氣質量分數較低，菌群處于缺氧環境，從而厭氧菌群Firmicutes可以大量繁殖并降解土壤中的柴油類污染物。

圖4 相對豐度3D 柱狀圖Fig.4 3D histogram of relative abundance

通過以上分析可知，本實驗篩選出的柴油高效降解菌群中主要的優勢菌群為Proteobacteria、Firmicutes以及少量Bacteroidetes，此菌群可以適應不同的環境，對柴油類污染物有較高的降解效率。

3 結 論

（1）投加菌群的降解時間大于30 d 時，菌群對土壤中柴油降解率達到74.3%；土壤中菌群在30 d的連續降解過程中，其呼吸強度逐漸增大；菌群對柴油的降解能力隨著土壤深度的減小逐漸增強。

（2）土壤中菌群多樣性分析結果表明，將菌群投加入土壤后，土壤中微生物多樣性和豐度都有所增加，說明該菌群對柴油污染土壤適應性良好，能夠高效地生長繁殖。

（3）各樣本的微生物群落結構組成分析結果表明，在氧氣豐富的表層土壤中優勢菌群為Proteobacteria，在相對缺氧的深層土壤中優勢菌群為Firmicutes，故本實驗菌群可適應不同環境。