姜黃素納米膠囊親水改性及體外評價綜合實驗設計

劉煥迪，杜 潔*，張紅蕾，賈新超，張路路，李 瑋

（1.河北大學 化學與材料科學學院，保定 071002；2.晨光生物科技集團股份有限公司，邯鄲 056000；3.河北牧群生物科技有限公司，保定 071002）

姜黃素（Curcumin，Cur）是從姜科植物中提取的一種可食用色素，安全無毒，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等廣泛的藥理作用[1]；近期研究還發現，姜黃素能有效抑制新冠病毒的活性及繁殖能力[2-4]。但姜黃素難溶于水，生物利用率低，抗氧化性差[5-7]等缺點影響了其發展及臨床上的應用。為了克服姜黃素穩定性差、生物利用率低等缺點，許多研究者利用納米粒[8-9]、脂質體[10]、介孔材料[11]等藥物載體材料運載姜黃素，使其能夠在生物體內更加穩定且高效地發揮其藥效。但是，遞送載體本身存在生物相容性差、降解產物導致正常細胞炎性等不足，并且沒有解決水溶性差的問題，影響其在臨床上的廣泛應用。因此選擇一種安全有效無毒的遞送載體，構建易分散于水的遞藥系統，對姜黃素應用具有重要的臨床意義。

聚羥基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoates,PHA）是一類由多種微生物胞內發酵合成的生物可降解高分子材料，有著良好的生物可降解性、生物相容性等性能。其在體內可被完全降解為二氧化碳、水和一些水溶性的分子團，不會對機體帶來毒性，被廣泛應用在生物醫學領域[12]。其作為載體在疏水性藥物的包封及緩釋方面也具有獨特的優勢[13]，已有研究利用PHA 作為載體分別對免疫抑制劑硫唑嘌呤（AZA）[14]、抗癌藥物5-氟尿嘧啶（5-FU）[15]進行遞送，表現出了優異的生物相容性及藥物緩釋效果。本課題組前期采用乳化固化法，以PHA 納米顆粒作為藥物遞送載體包裹疏水性藥物姜黃素，制備出姜黃素生物可降解的納米膠囊（Cur@PHA），并對其包封率及載藥量進行了研究[16]。

為了進一步改善Cur@PHA 在水中的分散性及穩定性，我們利用天然PHA 表面結合的顆粒表面結合蛋白（PhaP）的兩親特性，對姜黃素納米膠囊進行表面改性。本實驗首先設計并合成了PHAP蛋白并對其進行純化，通過自組裝的方式將其修飾在前期所制備的Cur@PHA 表面。PhaP 疏水結構域吸附在PHA 載體表面，親水結構域暴露在水溶液中，將Cur@PHA 表面由疏水性改性為親水性，以期提高藥物在水中的分散性。然后我們對所制備的表面改性姜黃素納米膠囊（PHA@Cur-PhaP）形貌、血清穩定性、PH 穩定性、光穩定性、藥物釋放性能及細胞毒性進行了表征與評價，構建出易分散于水、生物利用度高、光穩定性能優的綠色、無細胞毒性的姜黃素納米膠囊系統。該工作對解決疏水性藥物姜黃素的體內遞送具有現實意義。

本實驗來源于產業需求，以解決實際問題為出發點，涉及分子生物學、材料學、儀器分析等專業知識，以提高學生應用創新能力為目標開展實驗教學，系統的實驗思考與操作過程能夠加深學生對本專業領域的體會與定位，強化學生的學習目標，增強學生對個人發展目標的認識，激發學生對化學生物學科的濃厚興趣與熱情。

1 實驗藥品與儀器

試劑耗材：咪唑、胰蛋白胨、酵母粉、十二烷基硫酸鈉、98%噻唑藍溴化四氮唑（MTT）、100X 青霉素/鏈霉素溶液、DMEM 培養液、DNA連接酶快速連接試劑盒、考馬斯亮藍染液均購自上海生工；胎牛血清購自Gibco；二甲基亞砜（DMSO）購自阿拉丁試劑；硫酸卡那霉素購自BBI Life Sciences；瓊脂糖購自Biowest；HisTrapTM HP 和HisTrapTM Desalting 預裝柱均購自GE 生命科學。

儀器：雙向磁力加熱攪拌器（金壇市榮華儀器）；小型離心機（德國Eppendorf）；旋轉蒸發儀（日本Eyela）；電子天平（美國BECKMAN）；超聲波粉碎機（寧波新芝生物）；高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific）；冷凍干燥機（日本Eyela）；掃描電子顯微鏡（日本Hitachi）；電泳儀（北京六一生物）；PCR 儀（德國Eppendorf）；蛋白純化系統（美國GE）；大型離心機（美國Thermo Fisher Scientific）；凝膠成像分析儀（上海天能科技）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊醫療生物儀器）；恒溫培養振蕩器（上海智城分析儀器）；多功能酶標儀（美國BioTek）和細胞培養箱（新加坡ESCO）。

2 實驗方法

2.1 親水性顆粒蛋白PhaP 的合成及純化

由蠟樣芽孢桿菌基因組（登錄號：CP023245）中注釋的phap 基因設計引物phap-F：CGGGATCCATGGAAACTAAACCATACG，phap-R：CCCTCGAGTTACTTGATGGAAGTAAATAG。使用上述引物，以HBL-AI 全基因組為模板，對phap基因片段進行擴增。瓊脂糖凝膠電泳對PCR 產物進行檢測，并對目標條帶進行純化。使用限制性內切核酸酶BamHI 和Xhol 消化純化后的PCR 產物及質粒pET-28a，使二者具有相同的粘性末端，并利用DNA 連接試劑盒對其進行連接。連接產物轉化E.coli DH 5α 感受態細胞，篩選陽性重組子。將重組質粒轉化至E.coli BL21（DE3）plysS 中。挑取單菌落置于添加卡那霉素（終濃度100 μg/mL）的LB 培養基中，37 ℃，200 rpm 振蕩培養過夜。次日，對培養液進行離心，收集菌體沉淀進行高壓破碎。上清液使用HisTrapTM HP 預裝柱（1 mL）進行梯度洗脫純化。隨后，采用HisTrapTM Desalting 預裝柱（5 mL），用1×PBS（pH=7.4）緩沖液進行洗脫，脫掉洗脫液中的鹽。純化后的PhaP 蛋白采用12%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行驗證分析，凝膠在80 V 下運行0.5 h，然后在130 V 下運行1 h，電泳后凝膠用考馬斯亮藍染色并觀察。收集的PHAP 蛋白于4 ℃保存，備用。

2.2 Cur@PHA 與PhaP 蛋白的自組裝及形態表征

稱取1 mg Cur@PHA 顆粒，加入到2 mL PhaP蛋白溶液（濃度為1.2 mg/mL）中，在4 ℃環境下低速攪拌，使其反應過夜。反應液12 000 rpm，4 ℃，離心5 min，收集沉淀得到結合物Cur@PHA-PhaP。然后采用BCA 蛋白濃度檢測方法測定吸附前后上清液中PhaP 濃度，通過差值法計算PHA 表面的PHAP 蛋白吸附量，來評估蛋白吸附量情況。

分別取10 μL Cur@PHA-PhaP 樣品沉積在硅片表面上，自然干燥，15 kV 電壓下，放大30 000倍，進行掃描電鏡（SEM）的觀察。

2.3 Cur@PHA 改性前后分散性測試

準確稱取8 mg 的Cur@PHA 顆粒于50 mL 離心管中，加入過濾好的磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）1 mL 重懸，使用95%的功率，低溫超聲20 min，待顆粒全部重懸后轉移至1.5 mL 玻璃小瓶中，立即拍照。

準確稱取8 mg 的Cur@PHA 顆粒于50 mL 離心管中，加入16 mL PhaP 蛋白溶液，低溫過夜結合。將結合后的溶液經12 000 rpm，4 ℃，離心5 min，收集沉淀，將沉淀用過濾好的1 mL 磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）重懸并轉移至1.5 mL 玻璃小管中，立即拍照。

將以上兩種溶液靜置2.5 h 后，拍照并觀察二者分散穩定性。

2.4 Cur@PHA-PHAP 體內穩定性測試

1）血清穩定性：將Cur@PHA-PhaP 溶液與等體積的10%非加熱滅活的胎牛血清混合，置于37 ℃下孵育。分別在孵育的1、2、4、8 和12 h 取混合液進行10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。

2）pH 穩定性：將Cur@PHA-PhaP 分別浸入到Tris-HCl 溶液（pH=4.5），PBS 溶液（pH=7.4）和磷酸氫二鈉溶液（pH=9.0）中，于37 ℃進行孵育。分別在孵育0.25、0.5、1、2、4、8 和12 h 后，取混合液進行10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。

2.5 Cur@PHA-PhaP 的釋藥性能測定

將1 mL Cur@PHA-PhaP 溶液（終濃度100 μmol/L）轉移到透析袋（MWCO 10kDa）中，并浸入醋酸-醋酸鈉的緩沖液（pH=4.5）中，在37 ℃條件下，以100 rpm 的轉速在振蕩器中輕輕搖動。分別于間隔時間0、2、4、6、8、12、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264、288、312、336、360 和384 h，取出500 μL 透析袋外的混合溶液，進行HPLC 檢測。通過Cur 標準曲線依次計算出對應濃度。通過如下公式計算Cur 的釋藥率。

釋藥率R（%）=C1/ C0×100%

其中C1是釋放的Cur 濃度，C0是裝載在Cur@PHA-PHAP 中的Cur 濃度。

釋藥時間作為橫坐標，釋藥率作為縱坐標，分析Cur@PHA-PhaP 的體外釋放行為。

2.6 Cur@PHA-PhaP 光穩定性測試

稱取Cur@PHA-PhaP 和Cur 各15 mg 分別加入到15 mL 甲醇中配制成溶液，置于陽光下進行照射。在陽光照射的0～10 天內，每天分別取上述兩種溶液10 μL 混合到3 mL 氯仿溶液中，采用紫外分光光度儀在425 nm 波長下檢測Cur 的含量，觀察Cur 含量的變化。

2.7 Cur@PHA-PhaP 的細胞毒性測試

MGC803 細胞培養于含有10%（v/v）胎牛血清和100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的DMEM培養基中。將指數生長期的MGC803 細胞以1×105個細胞/孔的濃度接種到96 孔板中，37 ℃，5%CO2環境下孵育。培養24 h 后，取10 μL PHA緩沖溶液、Cur 溶液和Cur@PHA-PhaP 溶液分別加入到上述96 孔板中，繼續培養24 h。然后向每個孔中加入10 μL 的MTT（5 mg/mL），于37 ℃下孵育4 h。棄去上清液，向各孔中加入100 μL DMSO。記錄570 nm 波長下的吸光值。通過以下公式計算細胞生長抑制率。

細胞生長抑制率（%）=（OD 陰性對照-OD 處理）×100%/（OD 陰性對照-OD 背景）。

每次實驗5 組平行。

3 實驗結果與討論

3.1 親水性蛋白PhaP 的純化

以HBL-AI 全基因組為模板，通過PCR 成功克隆了phap 基因（541 bp），結果如圖1（a）所示。PCR 反應均為單一條帶無非特異性擴增，條帶大小與預期相符。

圖1 電泳測試結果分析

目的基因片段經酶切、連接、轉化后，挑取陽性轉化子測序驗證，測序結果顯示：成功構建重組質粒pET-28a（+）&phap。將重組質粒轉化至E.coli BL21（DE3）plysS 中，通過誘導表達，得到可溶性目的蛋白。蛋白經親和層析、脫鹽、濃縮進行純化。將純化后的蛋白經SDS-PAGE 電泳檢測結果如圖1（b）所示：蛋白條帶大小與PhaP 分子量（23.9 kDa）大小相同且條帶單一，蛋白可用于后續實驗。

3.2 Cur@PHA-PhaP 的組裝及形貌表征

將Cur@PHA 與純化得到的PhaP 蛋白溶液進行混合，利用PHAP 蛋白與PHA 之間的疏水作用力，使其自發吸附到Cur@PHA 表面，形成自組裝體Cur@PHA-PhaP。通過差值法計算得到的1 mg Cur@PHA 吸附PHAP 蛋白的量為0.5 mg，確定蛋白確實吸附在Cur@PHA 上。

將自組裝體Cur@PHA-PhaP 進行SEM 觀察，結果如圖2 所示。經過表面改性后，Cur@PHAPhaP 粒徑大小約為200 nm，微球表面粗糙，基本呈球形。微球中間顏色深，邊緣顏色淺，也表明PhaP 蛋白修飾在膠囊外圍。

圖2 Cur@PHA-PhaP 的SEM 圖

3.3 Cur@PHA-PhaP 分散性分析

為了比較納米膠囊表面改性前后的分散性，我們對其懸濁液進行了對比，如圖3（a）所示。改性前的納米膠囊水溶液，膠囊顆粒大部分懸浮于水溶液中，少部分發生團聚并開始沉降。改性后的納米膠囊顆粒能夠均勻的懸浮于水溶液中，其分散性更優。

圖3 分散性測試分析

同時，我們對二者2.5 h 靜置后所呈現懸濁液的分散性進行了對比，結果如圖3（b）所示：改性前的納米膠囊經過2.5 h 的靜置大部分發生沉降，而經過表面改性的納米膠囊沉降現象不明顯，分散性及穩定性更優。

3.4 Cur@PHA-PhaP 體外穩定性分析

1）血清穩定性。為了研究Cur@PHA-PhaP血清環境穩定性，將其放置于中性的血清環境中進行孵育。在孵育的不同時間取樣進行SDS-PAGE電泳分析，結果顯示Cur@PHA-PhaP 隨著在血清中孵育時間的延長，在點樣孔處可以清晰地看到條帶未發生變化，如圖4（a）所示，也未檢測到因結構解體而生成的PhaP 蛋白條帶，說明Cur@PHAPhaP 在血清中結構穩定性良好。

圖4 SDS-PAGE 電泳分析Cur@PHA-PhaP 穩定性

2）pH 穩定性。我們研究了Cur@PHA-PhaP在不同pH 條件下的穩定性及變化。從圖4（b）中可以看出：Cur@PHA-PhaP 在中性環境（pH 7.4）中可以保持穩定的組裝體結構，在pH 4.5 和pH 8.0環境下，膠塊上可以檢測到PHAP 蛋白條帶，說明在酸性和堿性條件下Cur@PHA-PhaP 體系不穩定，結構發生解離。

上述結果表明Cur@PHA-PhaP 載藥體系有利于藥物在輸送過程中保持穩定，而運輸至酸性環境的腫瘤患處，載藥體系發生解離，有利于膠囊到達細胞溶酶體后釋放出包裹的姜黃素，以此達到藥物控釋的效果。

3.5 Cur@PHA-PhaP 體外藥物釋放分析

我們在酸性環境下對Cur@PHA-PhaP 的藥物釋放進行了研究。從圖5 可以看出，經過24 h，Cur 僅釋放了35.46%。隨著時間延長，Cur 被持續釋放，在384 h 時，Cur 達到較大釋放率（89.56%）。

圖5 光穩定性分析

這是由于Cur 被包裹在PHA 微球內部，在中性環境（pH 7.4）中可以保持較穩定的組裝體結構，藥物無法釋放。當環境發生改變，酸性環境中PHA 被破壞，Cur 逐漸從疏水核心釋放到外部溶液。由此說明Cur@PHA-PhaP 結構可對姜黃素的藥物緩釋起到很好的效果。

3.6 Cur@PHA-PhaP 光穩定性分析

游離的姜黃素本身在光照下極易被降解，為了研究Cur@PHA-PhaP 的光穩定性，將Cur 和Cur@PHA-PhaP 同時置于太陽光照下，每天定時取樣，HPLC 分析姜黃素降解情況。如圖6 所示，在第二天時，游離姜黃素含量降低了近一半，到第十天游離姜黃素基本全部被降解。而制成納米膠囊的Cur@PHA-PhaP，因有PHA 材料的包裹作為保護，降解速率明顯變慢。這說明納米膠囊結構能夠有效幫助姜黃素抵御光解作用，更利于藥物保存。

圖6 姜黃素的釋放

3.7 Cur@PHA-PhaP 體外細胞毒性

很多研究表明PHA 材料本身沒有明顯的細胞毒性，也沒有先天的免疫原性。本文通過MTT 實驗驗證了隨著PHA 濃度的增加，細胞存活率并未發生改變，證明PHA 納米顆粒本身對細胞無毒性，如圖7 所示。

圖7 PHA 對細胞的毒性評價

同樣采用MTT 實驗將Cur 與Cur@PHA-PhaP對細胞的毒性情況進行了評價。結果如圖8 所示，Cur 的IC50 值為29.03±3.275 μmol/L，Cur@PHAPhaP 的IC50 值更低，僅為2.575±3.509 μmol/L，說明包裹Cur 的納米膠囊對癌細胞表現出更強的毒性。上述結果也說明Cur@PHA-PhaP 對姜黃素藥物具有較好裝載效果，顯著增強了細胞對藥物的攝取能力，從而產生更強的抗腫瘤作用。

圖8 Cur 與 Cur@PHA-PhaP 對癌細胞的毒性評價

4 結束語

本實驗中，我們對前期所制備出的Cur@PHA進行了表面改性，將設計合成的兩親性PHAP 蛋白成功修飾于Cur@PHA 表面，獲得顆粒均勻、分散性更優的Cur@PHA-PhaP 納米膠囊載藥體系。

我們對優化后的Cur@PHA-PhaP 血清穩定性、PH 穩定性及體外釋放性能進行了評價：該載藥體系在血清中穩定性良好，PHA 對姜黃素具有一定的保護作用；載藥體系能夠在酸性條件下發生解離，姜黃素從疏水中心得以釋放，實現了納米載藥體系對藥物的緩/控釋作用，從而可以更有效地發揮其藥效。光穩定性實驗表明：該載藥體系能提高姜黃素的穩定性，有效保護姜黃素抵御光解作用。細胞毒性實驗表明：PHA 納米材料本身對細胞無毒性，而裝載姜黃素的納米膠囊顯著增強了細胞對姜黃素的攝取能力，表現出優異的癌細胞毒性，增強了藥物的利用率。

本實驗作為一項綜合創新型實驗，將專業知識與產業需求相結合，針對醫藥產業的實際問題引發學生思考，激發學生對所解決問題及實驗設計產生濃厚興趣。學生依據問題設計相應的實驗方案，對實驗內容進行合理規劃，在具體的實驗過程中使科學問題得到解決，培養了學生的實驗探究能力。同時，學生能夠利用原有實驗設計出有價值的新實驗，結合廣泛的理論知識及實驗技術手段更深層次的開展科學研究，在科學性、合理性、可行性的基礎上，提高了學生的創新意識。此外，通過解決實際問題，強化了專業知識在社會發展中的具體應用及帶來的具體成果，增強了學生的學習主動性和社會責任感。