制曲方式對豉香型白酒酒曲理化因子及細菌群落的影響

王宇良，李志溥，蘇澤佳，梁景龍,2，白衛東,2，費永濤,2，趙文紅,2,*，方毅斐

（1.仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東 廣州 510225；2.農業農村部嶺南特色食品綠色加工與智能制造重點實驗室，廣東 廣州 510225；3.廣東省九江酒廠，廣東 佛山 528203）

中國白酒類型繁多，可根據地域、發酵材料、釀造工藝、所用酒曲及酒體風味進行區分[1]。白酒香型概念在中國第三屆品酒大會上被首次提出，而豉香型白酒在1984年被確立，是繼濃、醬、清、米4 個標準之后第1個出現的獨立香型[2]，也是珠三角地區所特有的傳統白酒，因其具有獨特的豉香味而得名，其復雜的釀造過程可大致分為制曲、投罐發酵、蒸餾、陳肉醞浸等，其中制曲是釀造過程中最關鍵的環節之一，酒曲的質量直接決定了豉香型白酒的產量和品質。

豉香型白酒酒曲屬于小曲[3]，以大米、黃豆為主要原料，加入餅丸（母曲）、酒餅葉及各種中草藥等輔料所制成，是豉香型白酒釀造過程中的唯一糖化發酵劑[4-5]。傳統酒曲的制作存在勞動強度大、生產效率低和高生產成本等缺點，同時以人工操作為主的生產操作，使得制曲過程易受環境因素影響，導致酒曲質量難以穩定，因此近年來豉香型白酒酒曲的制作開始引進機械化制曲技術，機械制曲工藝如圖1所示。機械制曲與傳統制曲有明顯不同，首先在原料上，機械制曲在與傳統制曲所用原料相同的基礎上額外添加了麥麩，使得酒曲質地松散，區別于傳統制曲大酒餅的緊密質地，其次機械制曲的發酵過程在集進料，控溫調濕、控風和翻曲、培養、出料及清洗等于一體的全封閉機械化自動化圓盤制曲機中進行[6]，代替了傳統人工操作，大大降低了生產成本和勞動強度，提高了酒曲的生產效率及質量的穩定性。雖然機械化制曲能夠有效解決傳統制曲存在的問題，但由于機械制曲和傳統制曲存在較大差異，在酒曲發酵過程是否會導致微生物的生長演替情況、菌群結構產生差異，以及酒曲發酵力、糖化力等理化因子有無差異，均成為機械化制曲能否代替傳統制曲關鍵問題。目前已對豉香型白酒傳統制曲過程中的細菌群落進行研究，但機械制曲和傳統制曲過程細菌群落結構的差異尚不清晰，因此，本研究通過分析表征酒曲品質的理化因子，同時采用高通量對機械制曲和傳統制曲過程中細菌群落結構進行解析，并結合相關性分析菌群和理化因子間的作用關系，對推動豉香型白酒機械化制曲的創新和應用具有重要意義。

圖1 機械制曲工藝流程Fig.1 Flow chart of mechanized Qu making

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

廣東某酒廠機械制曲不同時間段樣品：由制曲開始0 h至制曲結束120 h，隔6 h取樣一次，其中0～96 h為發酵期，96～120 h為干燥期；傳統制曲不同時間段樣品：由制曲開始0 h至制曲結束144 h，隔6 h取樣一次，其中0～120 h為發酵期，120～144 h為干燥期。兩種制曲方式過程中，發酵期溫度均保持在32～45 ℃，干燥期保持在45～55 ℃。

氫氧化鈉標準溶液 廣東銘固化學科技有限公司；酚酞 廣州化學試劑廠；3,5-二硝基水楊酸溶液、福林-酚試劑、L-干酪素、糖化酶、α-淀粉酶、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液 上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、無水碳酸鈉、碘化鉀、碘、五水硫酸銅、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、三氯己酸 天津永大有限公司；乳酸、葡萄糖 麥克林試劑有限公司；可溶性淀粉 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

PHS-3C pH計 艾力特國際貿易有限公司；TU-1901紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；HC130水分測定儀 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；SPX智能生化培養箱 寧波江南儀器廠；Illumina MiSeq測序儀 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 理化因子的測定

水分、發酵力、酯化力、糖化力測定根據QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》，酸度、氨基酸態氮測定參考杜亞飛等[7]采用連續滴定法，液化力測定參考沙均響等[8]采用分光光度法，酸性蛋白酶活力測定參考鄭東影等[9]采用福林-酚法。

1.3.2 微生物多樣性解析

1.3.2.1 樣品總DNA提取

DNA提取按照DNA提取試劑盒E.Z.N.A.?Soil DNA Kit的說明書進行。提取后對DNA進行檢測。

1.3.2.2 聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）提取及MiSeq Illumina測序

PCR擴增引物對應區域16S V3～V4區，細菌16S引物338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG），真菌引物806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT），對PCR產物進行鑒定、純化以及定量后構建PE文庫，進行Illumina測序，由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

1.4 數據統計分析

采用Excel、Origin 2020、Qiime1.9.1、Mothur等結合R語言軟件對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 制曲方式對酒曲理化因子的影響

2.1.1 制曲過程中水分的變化

水分是衡量曲是否達到儲藏標準的一個主要指標，一般來說水分質量分數小于13%為宜[3]。如圖2所示，在整個制曲過程中，傳統制曲和機械制曲中水分含量均隨時間延長緩慢降低，其中傳統制曲最高水分質量分數由初始的（40.78±1.82）%降低至干燥結束時的（10.32±0.10）%，而機械制曲則由初始最高水分質量分數（33.65±1.74）%降低至干燥結束時的（7.35±0.17）%。兩者制曲過程的不同導致兩者水分含量的變化趨勢有所不同，傳統制曲過程除混料壓餅成型前階段均晾掛在餅房中進行自然發酵，因此其水分含量變化趨勢呈隨時間持續降低，而機械制曲全程均在封閉的圓盤制曲儀中，在制曲過程的前4 d為機械控水，使得其水分含量呈階梯式下降趨勢。而兩者就質地而言，傳統制曲為整塊狀，機械制曲為松散狀，因此傳統制曲中水分含量會略高于機械制曲，兩者最終水分含量存在顯著差異（P＜0.05）。

圖2 制曲過程中水分變化Fig.2 Change of moisture during Qu making

2.1.2 制曲過程中酸度的變化

曲中酸度是評定大曲質量的重要指標，酸度主要是由產酸微生物如乳桿菌等在曲中進行有機酸代謝而形成，還有一部分來源于有機物的降解。它是大曲中微生物綜合作用的結果，適當的酸度能夠抑制大曲中有害雜菌的代謝，也為有益微生物提供了某些生化反應的前體物質[10]。如圖3所示，在制曲過程中，傳統制曲的酸度在發酵初期迅速升高，由（0.22±0.01 ）mmol/10 g 上升至（0.88±0.03）mmol/10 g，在36 h后開始降低至干燥完成后酸度僅有（0.30±0.01）mmol/10 g。而機械制曲的酸度變化則呈緩慢積累過程，初始酸度為（0.38±0.01）mmol/10 g，在90 h到達峰值（0.63±0.02）mmol/10 g，而后迅速降低至（0.40±0.01）mmol/10 g，到最后干燥完成時酸度為（0.463±0.01）mmol/10 g，比傳統制曲高0.16 mmol/10 g，存在顯著差異（P＜0.01）。榮瑞金等[11]在對醬香型白酒的研究中發現，水分含量高的酒曲酸度顯著高于水分含量低的酒曲，所以兩者酸度迅速下降的原因可能是水分含量變化所引起，在傳統制曲中，24 h后培養房濕度緩慢下降，而機械制曲中90 h后也進入鼓風干燥的過程，水分含量的減少進而影響了產酸微生物的生命代謝活動，酸性物質也可能會在該階段有所揮發。

圖3 制曲過程中酸度變化Fig.3 Change of acidity during Qu making

2.1.3 制曲過程中氨基酸態氮的變化

氨基酸態氮是衡量曲優劣的一項重要指標，利用氨基酸態氮的指標反映制曲過程中自身微生物以及酶降解蛋白質的能力，含量越高表明曲中所積累的復合香氣物質越多、微生物活力越強[12]。由圖4可知，傳統制曲和機械制曲的初始氨基酸態氮含量分別為（125.59±11.71）mg/g和（104.65±4.81）mg/g，均在制曲42 h到達峰值，分別為（384.29±27.76）mg/g和（312.27±3.58）mg/g，制曲結束時傳統制曲中氨基酸態氮顯著高于機械制曲（P＜0.01），含量分別為（311.31±10.25）mg/g和（233.00±10.12）mg/g。

圖4 制曲過程中氨基酸態氮變化Fig.4 Change of amino nitrogen content during Qu making

2.1.4 制曲過程中發酵力的變化

影響發酵力的主要微生物是釀酒酵母，釀酒酵母在無氧條件將原料中的糖類物質分解產生醇類物質以及二氧化碳[13]。同時，不同酵母之間也存在著相互作用關系，有研究結果顯示，在釀造過程中，異常漢遜酵母的生長受釀酒酵母的抑制，并且釀酒酵母對發酵力的影響高于異常漢遜酵母[14]。由圖5可知，傳統制曲和機械制曲的初始發酵力分別為（1.328±0.09）U和（1.348±0.14）U，傳統制曲在78 h達到峰值（5.067±0.341）U，機械制曲則在36 h達到峰值（4.605±0.145）U，制曲結束時傳統制曲發酵力顯著高于機械制曲（P＜0.01），分別為（4.532±0.039）U和（3.220±0.094）U。

圖5 制曲過程中發酵力變化Fig.5 Change of fermentation power during Qu making

2.1.5 制曲過程中酯化力的變化

酯化力是酯化酶活性的表現，酯化酶是脂肪酶和酯酶的統稱，酯化酶可以由酵母菌、細菌、霉菌等微生物生成。其中最主要的產酯微生物是酵母菌，酵母菌通過脂肪酸與輔酶A的結合活化，形成?；o酶A與醇類物質合成相應酯類，醇和?；鵆oA再在醇?；D移酶的作用下生物催化生成相應的酯類物質，這就是酵母中酯類合成的主要途徑[15]。由圖6可知，傳統制曲和機械制曲的初始酯化力分別為（211±26.98）mg/（g·100 h）和（184.66±6.66）mg/（g·100 h），傳制曲在30 h達到峰值（547.66±12.76）mg/（g·100 h），機械制曲則在36 h達到峰值（511.66±23.01）mg/（g·100 h），制曲結束時傳統制曲發酵力顯著高于機械制曲（P＜0.05），分別為（498±26.28）mg/（g·100 h）和（433.65±34.25）mg/（g·100 h）。

圖6 制曲過程中酯化力變化Fig.6 Change of esterification power during Qu making

2.1.6 制曲過程中液化力的變化

液化力主要是受曲中微生物體內的淀粉酶活性影響，淀粉酶可由多種微生物所代謝出，主要由細菌和真菌產生，如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、根霉、黑曲霉等[16]。由圖7可知，傳統制曲的液化力由培養初始的（0.276±0.02）g/（g·h）至72 h達到峰值（3.521±0.12）g/（g·h），隨后呈波動變化趨勢，制曲結束時其液化力為（1.95±0.08）g/（g·h）；機械制曲則由發酵初始（0.60±0.04）g/（g·h）至30 h達到峰值（4.04±0.135）g/（g·h），制曲結束時其液化力為（1.88±0.095）g/（g·h）。兩者液化力動態變化趨勢相似，干燥期結束后液化力無顯著差異（P＞0.05）。

圖7 制曲過程中液化力變化Fig.7 Change of liquefaction power during Qu making

2.1.7 制曲過程中糖化力的變化

糖化力是衡量酒曲是否合格的一項重要指標。糖化力是影響出酒率的重要因素之一，糖化力高低主要與細菌群落的代謝過程有關[17]。相關研究表明，糖化力還與發酵原料有關，原料中的淀粉含量能夠影響曲中霉菌代謝糖化酶的能力[18]。由圖8可知，傳統制曲和機械制曲的初始酯化力分別為（139.92±12.06）mg/（g·h）和（168.33±9.03）mg/（g·h），傳統制曲在72 h達到峰值（565.66±15.10）mg/（g·h），機械制曲則在84 h達到峰值（353.78±4.14）mg/（g·h），制曲結束時傳統制曲的糖化力顯著高于機械制曲（P＜0.01），分別為（455.96±23.16）mg/（g·h）和（233.36±19.17）mg/（g·h）。

圖8 制曲過程中糖化力變化Fig.8 Change of saccharifying power during Qu making

2.1.8 制曲過程中酸性蛋白酶活力的變化

蛋白酶能夠分解蛋白質生成氨基酸，而氨基酸可以作為風味物質。酒中許多風味物質來源于蛋白質和蛋白酶，高活性的酸性蛋白酶能夠加強酒質[19-20]；在不同大曲樣品的水解酶活性研究中發現，蛋白酶對醬香型大曲的質量有重要作用[21]。因此，酸性蛋白酶與曲中的風味和后續發酵酒體具有密切聯系。由圖9可知，傳統制曲和機械制曲的初始酸性蛋白酶活力分別為（33.08±2.58）U/g和（21.68±1.23）U/g，傳統制曲在60 h達到峰值（66.91±1.67）U/g，機械制曲則在39～51 U/g之間浮動，制曲結束時傳統制曲與機械制曲之間無顯著差異（P＞0.05），分別為（51.85±4.95）U/g和（40.71±4.03）U/g。

圖9 制曲過程中酸性蛋白酶活變化Fig.9 Change of acid protease activity during Qu making

2.2 傳統制曲與機械制曲過程中細菌群落結構分析

傳統和機械制曲過程中共鑒定出18 種（相對豐度大于1%）屬水平微生物群落（圖10），包括乳桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、魏氏菌屬（Weissella）、青枯菌屬（Ralstonia）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）、微小桿菌屬（Exiguobacterium）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、庫特氏菌屬（Kurthia）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、腸球菌屬（Enterococcus）、葡萄糖酸桿菌屬（Glutamicibacter）、裂孢菌屬（Thermobifida）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、腸桿菌屬（Enterobacter）、芽殖桿菌屬（Gemmobacter）、海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus），其中傳統和機械制曲中的核心細菌屬均為Lactobacillus、Bacillus、Pediococcus和Weissella，分別占兩組總菌落數的80%以上，這4 種菌屬為藥曲中的常見菌屬，它們的代謝產物可對酒的風味起促進作用[22]，同時還是醬香型等白酒發酵過程中的重要功能微生物[23-25]。通過對比發現，兩組中Lactobacillus、Bacillus、Pediococcus和Weissella有明顯差異，機械制曲結束時的優勢細菌屬為Bacillus（71.20%），傳統制曲中Bacillus的相對含量僅為0.38%；傳統制曲結束時的主要優勢細菌屬為Lactobacillus（68.30%），而機械制曲中Lactobacillus的相對含量僅為9.71%，同時Pediococcus和Weissella在機械制曲中的含量明顯低于傳統制曲，其中在制曲結束時，Pediococcus在傳統制曲和機械制曲中的含量分別為17.10%和2.20%，Weissella為7.70%和0.28%。Lactobacillus和Bacillus等主要功能性菌屬在兩組間存在差異，可能與機械制曲的環境及散曲的質地相關，機械制曲過程采用大型鼓風機控濕，該階段鼓風機將大量空氣吹入環境中，同時散曲的質地松散，在制曲過程中定時攪拌，使得散曲能夠充分與環境中的氧氣接觸，為Bacillus等好氧菌[26]提供充足氧氣，且機械制曲額外添加的麩皮具有良好的保濕效果，這就為Bacillus等菌屬提供了舒適的生長條件，但這同時也抑制了Lactobacillus、Weissella等兼性厭氧和厭氧菌的生長。相關研究表明，Lactobacillus、Weissella可代謝產生多種有機酸，不僅能夠提高酒曲酸度抑制不耐酸雜菌的生長，還能為酒體中的風味物質提供前體物[27-29]。Bacillus除了與揮發性酸的產生有關，同時還是蛋白酶和淀粉酶的重要來源，還可代謝4-甲基吡嗪、乙偶姻等風味物質[30-31]，高活力的Bacillus對酒體風味品質有重要貢獻作用[32-33]。在茅臺酒曲的研究中發現，人工制曲和機械制曲的優勢菌屬和動態變化雖沒有顯著差異，但機械制作的大曲比手工制作的大曲含有更多的Bacillus，而Bacillus是醬香型白酒發酵過程中最主要的功能菌，有利于醬香型白酒的制曲發酵[34]。

圖10 細菌屬水平物種豐度圖Fig.10 Relative abundance of bacterial genera in Qu samples at different fermentation times

2.3 機械制曲主要優勢細菌間及理化因子的相關性分析

為揭示細菌群落間的競爭關系以及對理化因子的影響，選取機械制曲過程中的核心且與傳統制曲存在顯著差異的細菌屬與理化因子進行相關性分析，如圖11所示，發現Bacillus與Lactobacillus、Pediococcus和Weissella間存在競爭關系，由于機械制曲和傳統制曲的質地及生產環境不同，使得兩者雖主要核心菌屬相同，但核心菌種間的組成比例不同，機械制曲過程中的環境適宜Bacillus的生長，其大量繁殖從而導致Lactobacillus、Pediococcus和Weissella的生長受到抑制[29]，同時在傳統制曲中，較高豐富度的Lactobacillus可能會合成抗生素和細菌素，導致傳統制曲中Bacillus的生長受到抑制，這與唐鰻秋等[35]對四川黃酒麥曲的研究結果一致，該結果表明機械制曲過程要合理科學控制干燥時進風量及散曲攪拌頻率，將制曲過程中的氧氣含量控制在合理范圍內，使得優勢菌群結構處于相對平衡狀態。此外Lactobacillus與氨基酸態氮、發酵力、酯化力、糖化力和酸性蛋白酶呈正相關；Bacillus與酸度、氨基酸態氮和液化力呈正相關；Pediococcus、Weissella與氨基酸態氮、發酵力、酯化力、液化力和酸性蛋白酶呈負相關與酸度呈正相關。以上結果表明，機械制曲過程保持一個相對合適的氧氣含量環境和相對穩定環境變化，既有利于Lactobacillus、Bacillus、Weissella等核心功能微生物的平衡生長，又有利于提高酒曲品質。

圖11 機械制曲過程細菌群落與理化因子相關性分析Fig.11 Correlation between bacterial community and physicochemical properties of Qu during mechanized making

3 結論

通過測定豉香型白酒傳統和機械制曲過程中水分、酸度、氨基酸態氮、發酵力、酯化力、液化力、糖化力、酸性蛋白酶發現，在制曲結束時，傳統制曲的水分、氨基酸態氮、發酵力、酯化力和糖化力顯著高于（P＜0.05）機械制曲，機械制曲的酸度高于傳統制曲；兩者液化力、酸性蛋白酶活力分別穩定在40～50 U/g和1.8 g/（g·h）左右，無顯著差異（P＞0.05）。采用高通量測序技術對豉香型白酒傳統和機械制曲過程中的細菌群落進行鑒定發現，兩者制曲過程中的主要核心細菌屬雖相似，均為Lactobacillus、Bacillus、Pediococcus和Weissella，占兩組總菌落數的80%以上，但核心細菌屬間的占比存在顯著差異（P＜0.05），傳統制曲中Lactobacillus（傳統制曲：68.30%；機械制曲：9.71%）、Pediococcus（傳統制曲：17.10%；機械制曲：2.20%）和Weissella（傳統制曲：7.70%；機械制曲：0.28%）顯著高于機械制曲，機械制曲中Bacillus（傳統制曲：0.38%；機械制曲：71.20%）顯著高于傳統制曲。通過核心菌屬與理化因子相關性分析發現，Lactobacillus、Bacillus、Pediococcus和Weissella均與表征酒曲品質的理化因子間存在明顯相關性，其中Lactobacillus與氨基酸態氮、發酵力、酯化力、糖化力和酸性蛋白酶呈正相關；Bacillus與酸度、氨基酸態氮和液化力呈正相關，Lactobacillus和Bacillus同時為兩種制曲方式中差異最顯著的細菌屬，由于機械制曲過程中添加了麥麩及制曲環境的不同，使得其與傳統制曲的質地及制曲過程中與氧氣的接觸量有所差異，如若能在機械制曲過程中合理科學地控制制曲環境中氧氣含量以及保持環境變化的相對穩定，這樣既有利于好氧及厭氧核心功能微生物的平衡生長，又有利于提高酒曲品質。機械制曲相較于傳統制曲，不僅有較高的生產效率和較低生產成本，還能夠有效提高制曲環境的質量，此外，豉香型白酒酒曲中除細菌微生物群落外，還含有豐富的真菌微生物群落，真菌同樣對發酵力、酯化力和液化力等表征指標有著重要影響作用，細菌和真菌間的協同發酵作用最終決定了酒曲品質，同時，機械制曲在原料中添加的麩皮可能更有利于好氧真菌的生長，在后續研究中可探究其中真菌微生物群落的演替情況，同時結合細菌群落結構，以此更加全面地分析兩種制曲方式之間產生差異的原因。本研究通過分析對比兩種制曲方式的理化因子及細菌微生物等指標間的差異，為豉香型白酒機械化制曲的發展及后續應用提供一定參考意義。