槐耳通過PI3K/AKT信號通路誘導結直腸癌細胞凋亡

溫璐雯，馮 琦，霍明一，柳 新，程 玉，鄭紀寧*

（1.承德醫學院病理教研室，河北承德 067000；2.承德醫學院基礎醫學研究所；3.承德醫學院附屬醫院）

國際癌癥研究機構最新數據示，結直腸癌的發病率在全部惡性腫瘤中位居第三，致死率位居第二[1]。結直腸癌的治療通常以手術結合化療或單獨化療[2,3]。但化療嚴重的毒副作用常使患者難以耐受，尋找低毒性的藥物迫在眉睫?；鄙轄柨拙追Q槐耳，在我國有一千六百多年的用藥史[4,5]?，F已知槐耳對多種腫瘤都有抗癌作用[6-10]，臨床上已用于肝癌的輔助化療[11,12]。且槐耳副作用低、不易耐藥等優點更是受到人們的廣泛關注[13]。

PI3K/AKT信號通路與增殖凋亡密切相關，PI3K亞基活化激活AKT，進而影響凋亡蛋白和增殖蛋白表達[14]。凋亡在腫瘤的發生發展中起至關重要的作用，常表現為凋亡抑制[15]。因此，誘導腫瘤細胞凋亡是治療癌癥的關鍵思路。本研究主要探討槐耳對結直腸癌細胞增殖及凋亡的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所使用的人結直腸癌細胞HCT8和HT29細胞系、HCT8專用完培、胎牛血清和RPMI-1640培養基均購買自普諾賽公司?；倍褐苽淙? g槐耳顆粒（江蘇啟東蓋天力醫藥有限公司），溶于20 mL 1640培養基，渦旋振蕩器震蕩10 min，充分混勻后用0.22 μm過濾器（美國密理博公司）過濾除菌，從而獲得100 mg/mL槐耳原液，分裝密封好儲存于-40℃冰箱。Cell Counting Kit-8（CCK8）購自MCE公司。凋亡檢測試劑盒購自中國四正柏公司?？贵w包含：β-actin、AKT、p-AKT（中國Affinity公司）、BAX、BCL-2、山羊抗鼠、山羊抗兔（美國Abclonal公司）、P85α、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、CyclinD1、CDK4（美國ProteinTech Group公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 HCT8置于10%專用完培，HT29置于10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，37 ℃、5% CO2的潮濕空氣培養箱中培養。

1.2.2 細胞增殖實驗 取對數生長期的細胞以每孔約5000個細胞種于96孔板，共設6組，分別是HCT8（0、9、12、15、18、21 mg/mL）和HT29（0、6、9、12、15、18 mg/mL），每組設3個復孔，棄上清加入相應槐耳濃度的10%完培繼續置于培養箱培養，24 h后棄上清，加入CCK8工作液：每孔10 μL CCK8和100 μL 1640培養基混勻，置于培養箱培養2 h后用酶標儀檢測460 nm處吸光值。加入同前一樣槐耳濃度的10%完培后放于培養箱培養24 h，再次同前一樣測吸光值。存活率=（實驗組吸光值-空白組吸光值）/（對照組吸光值-空白組吸光值）

1.2.3 流式細胞術 六孔板取一個對照組，另外3個孔分別加不同濃度槐耳，作用24 h后用不含EDTA的胰酶消化細胞，輕吹使細胞分散，1500 r·min-1離心10 min棄上清，PBS重懸用300目篩網過篩，同樣方法離心棄上清，用PBS清洗離心1~2遍后棄上清，每組加入500 μL緩沖液：100 μL 5×Binding Buffer和400 μL超純水混勻后，每組各加10 μL PI染液和5 μL Annexin V混勻，室溫避光孵育5～10 min，上機檢測。

1.2.4 RT-qPCR實驗 實驗共分4組，對照組不加藥和實驗組加不同濃度槐耳。細胞加藥培養48 h后提取總RNA，測A260值計算RNA濃度，反轉錄得到的cDNA及原RNA樣本作好標記放于-80 ℃保存，實時定量PCR程序為：95 ℃預變性10 s；95 ℃變性15 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共42個循環；隨后72℃延伸10 min，4 ℃終止反應。實驗使用GAPDH作為參照，實驗中所用引物序列如下：P85α 正向引物（5'-ACTGAAGCAGATGTTGAACAAC-3'），P85α 反向引物（5'-CATCGATCATTTCCAAGTCCAC-3'），GAPDH 正向引物（5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'），GAPDH 反向引物（5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'）。實驗結果用2-△△Ct法分析。

圖1 細胞增殖實驗檢測槐耳對HCT8和HT29的細胞存活率的影響

圖2 流式細胞術檢測槐耳對HCT8和HT29細胞凋亡的影響

圖3 槐耳對P85α mRNA的表達水平影響

圖4 槐耳對不同基因表達影響

1.2.5 Western blot法檢測蛋白表達 各組加藥同上，細胞均放于培養箱培養48 h后取出提取各組蛋白。以每泳道40 μg蛋白質在12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳上分析蛋白質，200 mA 2h濕轉至甲醇激活的PVDF膜（密理博）上，5% BCA封閉2 h后一抗孵育4 ℃過夜。TBST搖床洗滌5 min×4次，相應二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌5 min×4次。免疫復合物用顯影儀Image Lab顯影，Image J分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 槐耳對結直腸癌細胞有抑制增殖的作用

通過CCK8實驗我們測得，當槐耳濃度為9、12、15、18、21 mg/mL時，HCT8細胞24 h存活率分別為：0.997±0.005、0.847±0.031、0.450±0.016、0.385±0.011、0.267±0.012；48 h存活率分別為：0.795±0.045、0.446±0.021、0.289±0.009、0.163±0.009、0.125±0.007。當槐耳濃度為6、9、12、15、18 mg/mL時，HT29細胞24 h存活率分別為：0.948±0.065、0.429±0.015、0.208±0.009、0.106±0.007、0.106±0.007、0.065±0.005；48 h存活率分別為：0.937±0.039、0.317±0.018、0.141±0.009、0.048±0.004、0.057±0.004。結果可看出，經過不同濃度槐耳處理后，HCT8和HT29細胞存活率顯著降低（P均<0.05），且存活率隨濃度遞增而遞減；同一濃度處理24 h的細胞存活率明顯高于48 h，即存活率隨藥物作用時間延長而遞減（**P<0.01，***P<0.001）。實驗證明，槐耳對結直腸癌細胞HCT8和HT29具有降低存活力和抑制增殖的能力，且其抑制力隨濃度和時間遞增（圖1）。

2.2 槐耳對結直腸癌細胞的促凋亡作用

不同濃度槐耳作用下，H C T8細胞凋亡率分別為：0.046±0.009、0.129±0.003、0.274±0.003、0.333±0.001，P均<0.001。HT29細胞中凋亡率分別為：0.03±0.010、0.160±0.003、0.213±0.001、0.250±0.006，P均<0.001。結果表明，槐耳能促進結直腸癌細胞HCT8和HT29的凋亡，且其凋亡率隨濃度增加而遞增（圖2）。

2.3 槐耳調控PI3K/AKT信號通路

RT-qPCR實驗結果表明，槐耳能降低HCT8和HT29細胞P85α mRNA的表達水平，如圖3。不同濃度槐耳作用下HCT8的P85α mRNA的表達水平為0.105±0.027、0.085±0.029、0.081±0.035，P均<0.001；HT29的P85α mRNA的表達水平為0.429±0.011、0.290±0.008、0.245±0.016，P均<0.001。實驗組細胞P85α mRNA的表達水平均顯著低于對照組，可見槐耳能抑制P85α基因表達水平，從而抑制PI3K/AKT信號通路激活，且其表達水平隨濃度增加而降低。

2.4 槐耳通過抑制PI3K/AKT信號通路促進結直腸癌細胞凋亡

為了進一步研究槐耳槐耳促進結直腸癌細胞的凋亡機制，我們通過western blot實驗檢測了槐耳作用后結直腸癌細胞內PI3K/AKT信號通路關鍵蛋白，凋亡蛋白及增殖蛋白。實驗得出，加入槐耳后HCT8和HT29細胞中P85α、CyclinD1、CDK4的表達明顯降低，p-AKT/AKT的比值明顯降低，而BAX/BCL-2、Cleaved caspase-3/Caspase-3、Cleaved caspase-9/Caspase-9的比值顯著升高（圖4），P均<0.05。因此我們得知槐耳能抑制PI3K/AKT通路激活，下調CyclinD1、CDK4的表達，上調BAX、Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9的活化水平，減少細胞增殖和促進其凋亡，其機制可能與抑制PI3K/AKT通路激活有關。

3 討論

結直腸癌好發于中老年人，其死亡率位于全球第二，在發展中國家的發病率和死亡率正逐年提高，尤其在我國發病人群正逐步趨向年輕化[16]。臨床上被發現時常常已是中晚期，治療尤其困難，化療藥物產生的毒副作用更是讓患者難以忍受，開發有效且毒副作用低的藥物迫在眉睫。中藥是我國不可忽視的瑰寶，在我國使用歷史悠久?；倍目拱┳饔迷缫岩鸨姸鄬W者的關注，其作為腫瘤的輔助用藥具有很大的治療潛力[10,11]。因此，本研究主要針對槐耳對結直腸癌細胞的促凋亡機制，為進一步探討槐耳的藥用價值做出一點貢獻。

PI3K/AKT的異常激活使p-AKT活化水平提高，研究表明，過度激活的p-AKT與70%結直腸癌患者的細胞分裂和凋亡有關[17]。PI3Ks主要被分為三個類別，其中與癌癥相關主要是ⅠA類，Ⅰ類PI3Ks是異二聚體，包含P85調節亞單位和P110催化亞單位[18]?；罨腜I3K被募集到細胞膜上激活AKT，AKT活化后成為p-AKT調節增殖蛋白CDK、CyclinD等，和凋亡蛋白BAX、BCL-2，啟動Caspase凋亡級聯反應，從而調控腫瘤細胞的增殖和凋亡[14]。為了研究槐耳是否能抑制結直腸癌細胞增殖和誘導細胞凋亡，我們選用了兩株結直腸癌細胞HCT8和HT29進行實驗。研究表明，槐耳能抑制HCT8和HT29細胞增殖和誘導凋亡?；倍茱@著降低增殖蛋白CyclinD1、CDK4的表達，從而抑制細胞增殖；顯著提高BAX/BCL-2表達水平和上調Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9的活化水平，從而誘導細胞凋亡；明顯抑制HCT8和HT29細胞P85α mRNA的表達水平，顯著降低PI3K的調節亞基P85α的表達量，下調P85α和p-AKT/AKT蛋白表達水平，抑制PI3K/AKT信號通路的激活。因此，槐耳能抑制結直腸癌細胞增殖和誘導細胞凋亡，其機制可能與抑制PI3K/AKT信號通路激活有關，這為我們研究結直腸癌的治療方法提供了新的思路。然而，槐耳提取物中含多種成分，我們尚未研究清楚各組分之間的關聯性及相互作用機制，仍需更多更深入的研究來明確其效果。

綜上，槐耳能抑制HCT8和HT29細胞增殖和誘導細胞凋亡，其機制可能與抑制PI3K/AKT信號通路激活有關。