桑樹Aux/IAA基因家族鑒定與IBA處理下表達模式分析

馮曦, 豆浩, 孫佳佳, 孫慧娟, 畢會濤

(河南農業大學林學院,河南 鄭州 450002)

Aux/IAA是誘導生長素響應調節作用的關鍵轉錄因子蛋白家族[1],Aux/IAA基因家族通過表達核定位蛋白[2],影響了生長素的早期反應[3]。在高濃度生長素水平下,生長素在TIR1/AFB基因家族所構建的生長素結合域中與Aux/IAA蛋白結合[4],形成TIR1/AFB-Aux/IAA生長素共受體[5],并作為SCF復合體一部分的F-box蛋白(Skp1/Cullin/F-box)與生長素結合[6],形成SCFTIR1-生長素-Aux/IAA復合體,使Aux/IAA蛋白泛素化后降解[7-8]。在低濃度生長素水平下,ARF蛋白與Aux/IAA蛋白互作,促進轉錄抑制[9]。Aux/IAA蛋白包括4個高度保守的結構域(Domain Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ)[10]:Domian Ⅰ 存在著與乙烯響應因子(ERF)相關的轉錄抑制子(ERA)結構域[11],轉錄阻遏因子(TPL)通過該結構域,從而抑制生長素信號下游基因的表達[12];Domian Ⅱ 具有高度保守的特性,受TIR1調控,可以直接結合SCFTIR1控制Aux/IAA蛋白降解[13];Domian Ⅲ、Ⅳ 是與ARF相結合的部位,具有ARFs蛋白的CTDs的同源結構域,負責與其他Aux/IAA蛋白的二聚化和多聚化[14-15],進而調控生長素信號。

Aux/IAA基因家族的表達模式比較復雜,目前在擬南芥 (Arabidopsisthaliana)[16]、番茄 (Lycopersiconesculentum)[17]、玉米 (Zeamays)[18]、龍眼 (DimocarpuslonganLour)[19]中分別發現了29、36、40、18個Aux/IAA基因。擬南芥光敏色素A通過促進Aux/IAA蛋白質穩定性負調避蔭反應[20],AtIAA7參與植物的向地性生長[21],AtIAA5、AtIAA6、AtIAA19能夠調節擬南芥的耐旱特性[22],AtIAA32能夠調控頂端彎鉤發育的作用[23];Sl-IAA17調控番茄果實發育過程中的品質參數[24];GRMZM2G115357在高滲透壓條件下高表達,可能參與了玉米對高滲透脅迫的抗性過程[18];Dl-IAA基因參與了龍眼花芽分化過程,Dl-IAA2和Dl-IAA17可能在開花誘導中起作用[19]。

桑樹(Morusnotabilis)是?？粕俚穆淙~喬木,原產于中國[25],是經濟生態兼用型樹種[26]。桑樹可以培育成葉用、果用、材用的喬木林,也可以培育成菜用的灌木林,還能適應多種立地條件[27]。桑樹具有優良的產業優勢,一年栽植可多年利用[28]。桑樹栽植通常采用嫁接育苗[29],嫁接苗具有成活率高的優勢,但也存在育苗成本高,技術要求嚴格等缺陷[30]。扦插因具有育苗周期短,繁育成本低的優勢,成為桑樹快速產業化的有效途徑[31]。前期研究發現,生長素在桑樹扦插生根過程中起著重要的調節作用[32],但目前控制桑樹扦插生根的基因表達模式尚不清楚,桑樹Aux/IAA基因家族的全基因組分析也未見報道。

本研究鑒定了桑樹Aux/IAA基因家族成員的蛋白序列,并對其理化性質,系統發育樹、基因結構、蛋白互作關聯以及啟動子順式作用元件進行了較為全面的生物信息學分析。并研究了在IBA處理下的桑樹Aux/IAA基因家族的表達模式,推測了部分MnAux/IAA基因的功能,為后續闡明桑樹生根過程的研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 數據來源

桑樹全基因組序列和蛋白序列從本地川桑(Morusnotabilis)基因組數據庫中獲取,擬南芥全基因組序列和蛋白序列從TAIR數據庫(https://www.arabidopsis.org/)下載。

1.2 桑樹Aux/IAA基因家族成員提取鑒定

根據LISCUME等[33]提到的29個擬南芥AtAux/IAA基因家族成員,構建本地BLAST數據庫(E-value<0.05),獲得51條擬南芥的同源蛋白序列;同時從Pfam數據庫(http://pfam.xfam.org/)下載具有Aux/IAA蛋白結構域(PF02309)的隱馬爾可夫模型文件(hidden markov model, HMM),并使用HMMER3.0軟件對川桑全基因組數據庫進行檢索(E-value<0.05),篩選出51條待定序列。將上述兩方法所得到的序列取交集,篩選出具有完整Aux/IAA結構域的蛋白序列。并命名為MnAux/IAA1～MnAux/IAA51。

1.3 桑樹Aux/IAA基因家族成員理化性質預測

利用在線軟件ExPASy-ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)對篩選得到的51條MnAux/IAA蛋白質的理化性質進行預測。包括氨基酸數、相對分子質量、等電點、平均疏水指數。用在線軟件WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)預測亞細胞定位。

1.4 桑樹Aux/IAA基因家族成員的系統進化樹構建

利用MEGA7.0軟件的Muscle比對方式,對桑樹和擬南芥Aux/IAA基因家族的蛋白序列進行比對,并使用鄰接算法(neighbor-joining, NJ)構建系統進化樹,Bootstrap重復值設置為1 000。最后用evolview在線網站(https://www.evolgenius.info/evolview/)對系統進化樹進行分類和注釋。

1.5 桑樹Aux/IAA基因家族成員的保守基序與基因結構預測

利用在線工具MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)對桑樹Aux/IAA基因家族成員的保守基序進行分析,設置motif顯示數量為10。再根據川?；蚪M的注釋文件對MnAux/IAA基因結構進行分析。最后用TBtools軟件(https://github.com/CJ-Chen/TBtools)對分析結果進行可視化。

1.6 桑樹Aux/IAA基因啟動子順式作用元件預測

將MnAux/IAA基因家族成員的編碼區上游的2 000 bp序列作為啟動子區域進行提取。用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對啟動子區域的順式作用元件分析進行預測分析,最后用TBtools軟件進行可視化。

1.7 桑樹Aux/IAA基因家族蛋白三級結構和蛋白互作關聯預測

利用在線網站SWISS-MODEL(https://swiss-model.expasy.org/interactive/),對鑒定出的MnAux/IAA蛋白序列進行蛋白三級結構預測。隨后將MnAux/IAA蛋白序列與已知的AtIAA和AtARF蛋白序列進行比對。然后利用在線網站STRING(https://cn.string-db.org/),將51個MnAux/IAA基因家族蛋白序列作為查詢目標并預測蛋白互作(protein-pro-tein interaction, PPI)網絡。以AtIAA基因和AtARF基因與MnAux/IAA基因家族的相似度為標準,以置信度為0.7的基因作為PPI網絡中的樞紐基因來構建網絡圖,并用Cytoscape軟件進行可視化。

1.8 桑樹Aux/IAA基因在IBA不同時期處理下的表達模式測定

選取桑樹品種“強桑一號”的扦插枝為試驗材料,進行1 000 mg·L-1的IBA處理和清水處理,處理30 s后扦插至基質中,后續選取10、20、30、40 d的插穗進行轉錄組測序。統計IBA處理后10、20、30和40 d(IBA-1、IBA-2、IBA-3、IBA-4)以及相應的清水(CK-1、CK-2、CK-3、CK-4)對照組的轉錄組數據。分別比對到每個MnAux/IAA基因的序列數量,采用RPKM(reads per kilobase of tran-scripts per million mapped reads)對每個基因表達量進行均一化處理,最后使用TBtools軟件繪制MnAux/IAA基因家族成員在IBA處理前后的表達熱圖。

2 結果與分析

2.1 桑樹Aux/IAA基因家族成員鑒定及理化性質分析

在桑樹全基因組中,共鑒定出51個Aux/IAA基因家族成員,依據基因編號大小對桑樹Aux/IAA基因家族成員依次命名為MnAux/IAA1～MnAux/IAA51(表1)。桑樹Aux/IAA基因家族成員理化性質分析顯示,發現它們在氨基酸數量、等電點、相對分子質量方面存在顯著差異。51個MnAux/IAAs蛋白的氨基酸長度在79 (MnAux/IAA51)～1 144 aa (MnAux/IAA3)范圍內,其中小于400 aa的有27個,所占比例為52.9%;蛋白質相對分子質量差異較大,為8.99(MnAux/IAA51)～127.70 kD (MnAux/IAA3);72.55%的MnAux/IAAs蛋白等電點(pI)小于7,平均值6.7,說明這些MnAux/IAAs蛋白大部分呈酸性;蛋白質平均疏水指數均為負值,表明MnAux/IAAs均為親水性蛋白質;亞細胞預測結果顯示,有40個成員定位于細胞核上,7個定位于葉綠體,2個定位于過氧化物酶體,1個定位于細胞骨架,1個定位于線粒體,說明該家族基因主要在細胞核中發揮功能。

表1 桑樹Aux/IAA基因家族基本信息Table 1 Basic information of Aux/IAA gene family in Morus notabilis

表2 桑樹MnAux/IAA基因家族蛋白互作預測Table 2 Protein interaction prediction of MnAux/IAA gene family in Morus notabilis

2.2 桑樹Aux/IAA基因家族系統進化分析

根據擬南芥AtIAA蛋白序列和鑒定出的桑樹MnAux/IAA蛋白序列構建了系統進化樹(圖1)。根據系統進化分析將51個MnAux/IAA基因家族成員大致分成8個亞家族,8個亞家族分別命名為A1 ～ B4。其中A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3和B4亞家族分別包含10、11、4、5、5、4、3和9個MnAux/IAA基因,而且桑樹與擬南芥Aux/IAA基因家族成員在6個亞家族中的分布類似。分析結果表明,MnAux/IAA基因和AtIAA基因同源性很高,Aux/IAA基因物種進化比較保守,蛋白序列的相似性。表明2個物種的Aux/IAA基因可能具有相似的生物學功能。從進化樹分支上看,桑樹與擬南芥的Aux/IAA基因家族成員在各亞家族上的分布數所占比例不同,說明Aux/IAA基因家族在不同植物亞家族中聚類存在差異。

2.3 桑樹Aux/IAA基因家族成員的保守基序與基因結構分析

保守基序分析結果顯示(圖2-B)。不同MnAux/IAAs中所包含的motif數量存在一定差異,親緣關系相近的成員,其所含的motif也大多相似。51個MnAux/IAAs中,有15個MnAux/IAAs包含9種motif。幾乎所有家族成員都有motif 1,這說明motif 1是桑樹MnAux/IAA基因家族的保守結構域的一部分。比較發現,有較多的蛋白保守基序按照motif 4、motif 9、motif 3、motif 2、motif 5、motif 6、motif 7的順序排列,該結果可能與MnAux/IAA基因的特定功能有關。結構域分析發現,有23個MnAux/IAAs包含B3DNA結構域,49個MnAux/IAAs包含羧基末端的PB1結構域。

A: MnAux/IAA基因家族系統發育樹;B: MnAux/IAA基因家族成員的保守基序;C: MnAux/IAA基因家族成員的基因結構。

基因結構分析結果顯示(圖2-C),MnAux/IAA基因家族中均含有內含子,除MnAux/IAA6含有1個內含子外,其余均含有2個及以上內含子。不同成員所含有的外顯子數量也不同,分布為3～22個,其中MnAux/IAA23含有最多的外顯子(22個),MnAux/IAA6的外顯子數量最少(2個)。外顯子在5～14個的基因數最多,占80.39%。另外各亞家族間的基因長度差異較大,B2、B4兩個亞家族的基因長度較短。其中MnAux/IAA51基因長度最短;MnAux/IAA23的基因長度最長。所有的基因家族成員都有外顯子和內含子,僅有1個基因家族成員(MnAux/IAA51)無非編譯區(untranslated region, UTR),說明MnAux/IAA基因家族成員的功能比較穩定,在家族進化過程中變化較小。

2.4 桑樹Aux/IAA基因家族成員的順式作用元件分析

分析MnAux/IAA基因上游2 000 bp啟動子序列區域,得到Aux/IAA基因家族的啟動子順式作用元件預測結果(圖3)。在MnAux/IAA基因中共檢測到19種順式作用元件,主要包括4種類型:光響應型、激素響應型、逆境響應型和發育響應型。其中,激素響應型方面。MnAux/IAA基因的啟動子上存在5種激素相關的順式作用元件。5種順式作用元件的數量存在差異,其中茉莉酸甲酯響應元件占比例最多,達到14.68%,赤霉毒響應元件所占比例為7.01%。生長素響應元件數量最少,僅占3.75%。從整體來看,厭氧感應元件所占比例最大,達到18.10%。整體看來,MnAux/IAA49上的順式作用元件最多(21個),其余大多數都在11～17個之間。同時發現,同一元件在不同基因上的分布不均衡。生長素響應元件主要分布在MnAux/IAA31、MnAux/IAA38、MnAux/IAA39的啟動子上。

圖3 桑樹MnAux/IAA基因啟動子順式作用元件分布情況Fig.3 Distribution of cis-acting elements of MnAux/IAA gene promoter in Morus notabilis

2.5 桑樹Aux/IAA基因家族蛋白三級結構及蛋白互作關聯分析

桑樹MnAux/IAA蛋白三級結構預測如圖4所示,桑樹MnAux/IAA蛋白包含α-螺旋、β-折疊、β-轉角以及無規則卷曲等空間構象。對比發現,蛋白質整體相似度水平不高,但同一個亞家族的蛋白質的空間結構比較接近。例如A1亞家族的MnAux/IAA35、MnAux/IAA36、MnAux/IAA38和MnAux/IAA39;B4亞家族的MnAux/IAA42、MnAux/IAA43、MnAux/IAA44。表明蛋白結構與物種進化同源性有的一定關聯。

圖4 桑樹MnAux/IAA基因家族蛋白三級結構預測Fig.4 Prediction of tertiary structure of MnAux/IAA gene family proteins in Morus notabilis

蛋白互作關聯預測如圖5所示,將篩選出的MnAux/IAA蛋白,與擬南芥中基因結構相似的AtIAAs和AtARFs進行比對,利用AtIAAs和AtARFs所構建的蛋白互作PPI網絡,推測MnAux/IAA蛋白之間的調控關系。對比發現,MnAux/IAA蛋白之間存在多種調控通路。IAA3、IAA4、IAA16、IAA17、IAA19、IAA26具有較多的網絡交叉聯系,說明這些蛋白對植物某些生理功能和生長發育等一系列過程可能具有協同調控作用。AtARF1和AtARF2能調控葉片的衰老、花器官的發育與凋謝[34],AtARF5主要參與維管組織的形成及胚的發育[35],AtIAA3,AtIAA14,AtIAA28,AtIAA19與側根的生長發育有關[16]。說明與其同源的MnAux/IAA蛋白有相似的功能。

圖5 桑樹MnAux/IAA基因家族蛋白互作Fig.5 Protein interaction of MnAux/IAA gene family in Morus notabilis

2.6 桑樹Aux/IAA基因在IBA處理下的表達模式分析

以“強桑1號”扦插苗為試驗材料,對其采用質量濃度為1 000 mg·L-1的IBA處理30 S,并選取10、20、30、40 d 4個不同時期的扦插苗進行轉錄組測序,從測序數據中篩選出51個MnAux/IAA基因的表達量數據并繪制熱圖(圖6)。

51個Aux/IAA基因在兩種處理條件下均有不同程度的表達。在清水處理下,有6個基因隨著處理時間的延長,其表達量保持上調趨勢;有2個基因表達量保持下調趨勢。經過IBA處理后,有13個基因隨處理時間的延長,其表達量保持上調趨勢;有8個基因表達量保持下調趨勢。在IBA-1的處理條件下,B2亞家族中所有的MnAux/IAA基因的表達量顯著高于其他處理時期;在CK-A的處理條件下,處于B4亞家族的MnAux/IAA23和MnAux/IAA48兩個基因表達量尤為突出,這說明同一亞家族中的基因表達模式具有一致性和相似性。

在IBA-3和IBA-4的處理條件下,MnAux/IAA的整體表達水平不如IBA-1和IBA-2,猜測是由于處理時間過長導致IBA對MnAux/IAA表達的影響逐漸降低。整體來看,92.2%的基因在經過IBA處理后,基因表達程度上會有不同程度的提升,這說明IBA處理對MnAux/IAA基因的表達具有良好的促進作用。MnAux/IAA34、MnAux/IAA33、MnAux/IAA32在經過IBA處理后在表達量上有較大程度的下降,推測IBA抑制了這3種基因的正常表達。

3 結論與討論

Aux/IAA基因家族是植物生長素在表達過程中參與反應的重要基因家族,在不同濃度的生長素下具有相應的調控作用[36],也是生長素最早進行信號轉導以及基因表達的3個基因家族之一?，F如今Aux/IAA蛋白功能已經被人所知,但對桑樹Aux/IAA基因家族的研究還未見報道。本研究利用本地川桑(Morusnotabilis)基因組數據,最終鑒定出51個MnAux/IAA基因家族成員,高于擬南芥29個[16]、番茄36個[17]、玉米40個[18]、龍眼18個[19]。理化性質分析發現,MnAux/IAA蛋白的氨基酸個數與相對分子質量差異較大,大部分MnAux/IAA的等電點小于7,平均值6.7,顯酸性;系統進化樹分析將MnAux/IAA家族分為8個亞家族,各亞家族內的基因結構基本相似表明,Aux/IAA基因在物種進化的過程中具有較高的保守性;保守基序與基因結構分析發現,含有PB1結構域基因成員較多,且僅有1個基因家族成員無UTR,說明MnAux/IAA基因家族成員的功能穩定。蛋白三級結構分析表明,同一個亞家族的蛋白質的空間結構比較接近。蛋白互作分析發現,MnAux/IAA與AtIAA在部分基因上具有相似的功能。

本研究中,有47個基因經過IBA處理后,4個時期的平均表達量高于清水對照組,說明IBA具有促進Aux/IAA基因表達的作用。經過IBA處理后,基因MnAux/IAA34、MnAux/IAA33、MnAux/IAA32的表達量持續顯著降低,蛋白互作分析結果表明,MnAux/IAA34、MnAux/IAA33、MnAux/IAA32與AtARF2同源性較高。調查發現,AtARF2具有促進調控葉片衰老和花器官脫落的作用[37],推測MnAux/IAA34、MnAux/IAA33、MnAux/IAA32可能與葉片生長發育的功能相關。桑樹扦插苗在IBA處理10 d后,MnAux/IAA18、MnAux/IAA31基因表達量顯著,且與AtIAA17有較高的同源性,調查發現AtIAA17具有調控植物下胚軸長度、根毛數量及保證葉形正常的功能[38]。因此,推測MnAux/IAA18和MnAux/IAA31具有促進生根、調控葉形的功能。

生長素在植物早期的調控作用與Aux/IAA基因的表達密切相關。在擬南芥中,AtAux/IAA家族成員AXR3的突變體AXR3(IAA17)具有下胚軸明顯變短,葉向上卷曲且呈黑色及無根毛等表型[39];王婧[40]利用酵母雙雜交試驗證明,AtlAA8與ARF6和ARF8互作,表明Aux/IAA參與調節花器官的發育;在水稻中,NAKAMURA等[41]將OsIAA31過表達,引起株系葉片變短,不定根減少。本研究中,B2、A1、A2亞家族內部的基因表達量相似,證明同一亞家族內基因表達模式大致相同。隨著IBA處理時間的增加,MnAux/IAA基因的表達量普遍下降,證明IBA作用效果隨時間增加而出現緩慢下降的趨勢。

結合桑樹扦插苗受IBA處理后的基因表達量變化,發現IBA具有促進Aux/IAA基因表達的作用;推測MnAux/IAA34、MnAux/IAA33、MnAux/IAA32具有調控葉片衰老和花凋落的功能;推測MnAux/IAA18和MnAux/IAA31與根毛數量的維持和葉片正常舒展密切相關,但其具體功能仍需進一步實驗驗證。通過本研究,為桑樹Mux/IAA基因家族在調控扦插生根過程中提供了候選基因。探究了與植物激素相關的基因家族對扦插生根的表達作用,為深入研究Aux/IAA基因家族的功能提供了基礎。為桑樹扦插生長發育在分子水平上提供了參考條件。