玉米秸稈水提-甘油協同蒸汽爆破預處理及其丁醇發酵研究

李曉娟, 董紅麗, 張宏森, 宋安東, 聶文喜, 王風芹

(1.河南農業大學生命科學學院,河南 鄭州 450046; 2.河南省鄉村產業發展服務中心,河南 鄭州 450002)

丁醇是重要的化工原料和可再生生物能源,與乙醇相比具有能量密度高、燃燒值高、蒸氣壓低、與汽油配伍性好及能以任意比例和汽油混合等多種優良特性,現已成為僅次于乙醇的第二代可再生生物能源[1-2]。傳統的丁醇發酵以玉米淀粉和甘薯淀粉等為原料,原料成本占總成本的30%以上,且存在“與人爭糧,與糧爭地”的突出問題,不利于丁醇發酵工業的可持續發展[3]。以木質纖維素為原料生產丁醇,既可以實現資源的高效高值轉化,還可以減輕過度使用化石能源導致的能源危機、環境污染和溫室效應。

秸稈等木質纖維素資源是豐富的生物質資源,中國僅玉米秸稈的年產量就達到2.7億t[4-5]。以秸稈等木質纖維素為原料生產生物能源和生物基化學品是資源高效利用的重要途徑[6]。木質纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質素組成,三者之間存在復雜的化學鍵連接,形成類似鋼筋混凝土式堅實致密的結構。因此,在木質纖維素轉化利用過程中,首先要通過物理、化學或生物等預處理技術打破細胞壁抗降解屏障,脫除部分半纖維素、木質素以打散細胞壁結構,增加底物的孔隙率,降低纖維素結晶度,提高酶對纖維素的可及性,進而提高纖維素酶解效率和生物轉化效率[7-9]。

蒸汽爆破預處理具有設備投資少、環境污染小、能耗低等優點,被認為是最具工業化應用潛力的預處理技術之一[10],已被廣泛應用于農作物秸稈、林業廢棄物和能源作物等預處理研究。然而,單獨的蒸汽爆破預處理仍然存在木質纖維素酶解效率偏低的問題,近年來聯合預處理技術逐漸興起。覃錦程等[11]經離子液體和蒸汽爆破兩步預處理后,葡萄糖酶解效率提高到90%以上。LIU等[12]以3種離子液體聯合蒸汽爆破預處理水稻秸稈,葡萄糖產率均達到70%。甘油作為高沸點(290 ℃)有機溶劑,能夠有效去除半纖維素和木質素,選擇性地保留纖維素[13],且甘油自身對纖維素酶的抑制作用小于離子液體[14]。此外,甘油可被微生物利用進行生物轉化,減少了回收的難度和成本。WANG等[15]利用甘油協同蒸汽爆破預處理技術,將玉米秸稈和甘油按照m(玉米秸稈)∶m(甘油)=1∶0.5進行混合預浸后再進行蒸汽爆破預處理,預處理玉米秸稈殘渣中纖維素的酶解效率較單獨蒸汽爆破提高28.2%,該預處理體系甘油的用量較傳統的甘油預處理下降90%以上。

巴氏梭菌(Clostridiumpasteurianum)CICC10391是一株可以同時利用葡萄糖和甘油生產丁醇的細菌。本研究首先比較單獨蒸汽爆破、水浸潤蒸汽爆破、甘油協同蒸汽爆破和水提-甘油協同蒸汽爆破對玉米秸稈三素組成和酶解效率的影響。在此基礎上,通過巴氏梭菌CICC10391對水提-甘油協同蒸汽爆破預處理玉米秸稈水解液進行厭氧瓶發酵生產丁醇,同時研究玉米漿對丁醇發酵的影響,進而進行5 L發酵罐擴大發酵試驗,以期為甘油和玉米秸稈高效轉化生物丁醇的工業生產提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與菌種

玉米秸稈(corn stover, CS):取自河南省鞏義市;未處理玉米秸稈的三素組分:纖維素質量分數為31.1%±0.36%,半纖維素質量分數為17.6%±0.27%,木質素質量分數為14.9%±0.9%。玉米秸稈粉碎后過0.25 mm篩,45 ℃烘干至恒質量后密封室溫(25 ℃)保存備用。分析純級甘油(≥99.7%)和商業纖維素酶(120 FPU·mL-1)分別購自天津富宇精細化工有限公司和諾維信(中國)生物科技有限公司;無菌去纖維蛋白羊血、對氨基苯甲酸、生物素和維生素B1購自北京索萊寶科技有限公司;其余試劑購自天津市大茂化工試劑廠。

巴氏梭菌(Clostridiumpasteurianum)CICC10391,購自中國工業微生物菌種保藏管理中心。

1.2 儀器設備

QBS-200B蒸汽爆破機(鶴壁正道有限公司);SHG-Ⅲ循環水真空泵(鞏義市英峪儀器廠);ZQLY-80A恒溫振蕩培養箱(上海知楚儀器有限公司);Shimadzu LC-20AD高效液相色譜儀(日本島津公司);Agilent 7890A氣相色譜儀(美國安捷倫科技公司)。

1.3 培養基

活化培養基(1 L):胰蛋白胨15 g,大豆蛋白胨5 g,NaCl 5 g,121 ℃滅菌15 min,冷卻后加入質量分數5%無菌去纖維蛋白羊血。

強化梭菌培養基(reinforced clostridial medium,RCM)(1 L):胰蛋白胨10 g,酵母浸粉3 g,葡萄糖5 g,氯化鈉5 g,半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g,牛肉膏10 g,可溶性淀粉1 g,121 ℃滅菌15 min。

1.4 玉米秸稈水解液的制備

1.4.1 玉米秸稈水提方法 玉米秸稈45 ℃烘干后,按照m(玉米秸稈/g)∶V(去離子水/L)=1∶20加入去離子水,在95 ℃水浴鍋中水提2 h,過程中不斷攪拌,反應完成后稱質量,把蒸發掉的水補上,達到與反應前的質量一致,然后用循環水真空泵抽濾固液混合物,使固液分離后,用高效液相色譜測定液體中糖含量,固體再經充分水洗后在45 ℃烘箱中烘至恒質量備用。

1.4.2 玉米秸稈預處理 預處理條件分為蒸汽爆破(SE)、水浸潤蒸汽爆破(WSSE)、甘油協同蒸汽爆破(GASE)和水提-甘油協同蒸汽爆破(WE-GASE)4種,具體條件見表1。將玉米秸稈與水混合或甘油水溶液混合后室溫放置12 h,然后在2.0 MPa、保壓時間150 s條件下進行蒸汽爆破。取一部分爆破后的玉米秸稈用自來水洗至液體無色,2層紗布過濾得到水洗后的固體殘渣,45 ℃烘干后根據美國國家可再生能源實驗室(National Renewable Energy Laboratory,NREL)制定的標準程序進行玉米秸稈的組分分析[16]。

表1 玉米秸稈預處理條件Table 1 Pretreatment conditions of corn stover

1.4.3 預處理玉米秸稈的非水洗纖維素酶解 分別用1.4.2預處理后的玉米秸稈直接進行纖維素酶解(酶解前未經過水洗處理),纖維素酶添加量為20 FPU·g-1,用5 mol·L-1NaOH調pH值至4.8,于48 ℃、180 r·min-1恒溫振蕩培養箱中酶解48 h。采用循環水真空泵抽濾收集液體,取0.1 mL用去離子水稀釋10倍,利用高效液相色譜測定水解液中糖和甘油含量,并計算纖維素酶解效率。

1.5 菌種活化與種子液制備

購買的巴氏梭菌CICC10391菌株保存在凍干管中,將其接入到RCM培養基中,37 ℃厭氧培養2 d,然后按體積分數10%的接種量接入到RCM培養基中,連續傳代培養。將培養2 d的巴氏梭菌CICC10391菌株培養液以體積分數10%接種量再次轉接入RCM培養基,37 ℃厭氧培養1 d后的培養液作為發酵培養基的種子液。

1.6 含甘油玉米秸稈水解液丁醇發酵試驗

1.6.1 水解液制備與活性炭脫毒 按照1.4.2的方法對玉米秸稈進行水提-甘油協同蒸汽爆破預處理,按照1.4.3的方法對預處理后的玉米秸稈進行酶解,過濾后得到水解液,然后在水解液中加入質量分數4%的活性炭,50 ℃水浴鍋中攪拌反應1 h,反應結束后抽濾,得到脫毒水解液,用5 mol·L-1NaOH將脫毒水解液pH值調至6.5,用于發酵培養基制備。

1.6.2 發酵培養基制備 在脫毒水解液中加入酵母浸粉1 g·L-1,碳酸鈣7.5 g·L-1,以每瓶45 mL分裝入厭氧瓶中(總容積65 mL),115 ℃滅菌15 min,冷卻至室溫(25 ℃)后,加入經0.22 μm微孔濾膜過濾的緩沖液、維生素儲存液和礦質元素儲存液(stock solutions)各1 mL。緩沖液含有磷酸二氫鉀25 g·L-1、磷酸氫二鉀25 g·L-1、硫酸銨250 g·L-1;維生素儲存液含有對氨基苯甲酸0.5 mg·L-1、生物素0.05 mg·L-1、維生素B10.5 mg·L-1;礦質元素儲存液含有七水硫酸鎂10 g·L-1、七水硫酸亞鐵5 g·L-1[17]。發酵初始pH值為6.5。

1.6.3 厭氧瓶發酵試驗 種子液按體積分數10%接種量接入到玉米秸稈水解液發酵培養基中,37 ℃厭氧發酵70 h,每隔10 h取樣1 mL,10 000 r·min-1、離心10 min后取上清液于-20 ℃保存,待發酵結束后測定發酵上清液中底物和產物質量濃度,計算底物利用率和丁醇產生速率。

1.6.4 添加玉米漿對丁醇發酵的影響 玉米秸稈水解液發酵培養基中額外添加2.5 g·L-1玉米漿,按體積分數10%加入種子液,厭氧瓶中發酵96 h,每隔24 h取樣1 mL,上清液于-20 ℃保存,待發酵結束后測定發酵上清液中底物和產物質量濃度,計算底物利用率和丁醇產生速率。

1.6.5 5 L發酵罐擴大發酵試驗 每個發酵罐中裝2.5 L玉米秸稈水解液發酵培養基,按體積分數10%加入種子液,轉速50 r·min-1,用2 mol·L-1H2SO4和5 mol·L-1NaOH調節發酵液pH值為6,37 ℃發酵60 h,每隔10 h用移液管取樣5 mL。-20 ℃保存,待發酵結束測定發酵上清液中底物和產物質量濃度,計算底物利用率和丁醇產生速率。

1.7 測定方法

1.7.1 殘糖、甘油及酸的含量測定 發酵過程中殘留的葡萄糖、木糖和甘油,以及產生的乙酸、丁酸的含量均采用高效液相色譜儀進行測定,RID-10A折射率檢測器,Aminex HPX-87H柱,柱溫65 ℃,洗脫液為5 mmol H2SO4,流速0.6 mL·min-1,保留時間25 min。

1.7.2 乙醇、丁醇產量的測定 發酵產生的溶劑(乙醇、丁醇)產量使用氣相色譜儀進行測定,ZB-WAX Plus色譜柱;FID檢測器,溫度250 ℃;載氣為N2,流速為1.5 L·min-1,H2流速為30 mL·min-1,空氣流速為350 mL·min-1,分流比為20∶1;進樣量為0.2 μL,進樣口溫度為200 ℃;柱溫箱的起始溫度為45 ℃,保持1 min后以10 ℃·min-1的速率升至55 ℃并保持1 min,再以15 ℃·min-1的速率升至80 ℃并保持0.5 min,最后以20 ℃·min-1的速率升至120 ℃并保持1 min。

1.8 計算方法

γc=m2/m1×100%

(1)

γh=m4/m3×100%

(2)

γl=m6/m5×100%

(3)

kc= 0.9w/m2×100%

(4)

η=(ρ1-ρ2)/ρ1×100%

(5)

vb=ρb/t×100%

(6)

式中:m1、m3、m5分別為預處理前玉米秸稈中纖維素、半纖維素、木質素的質量;m2、m4、m6分別為預處理后玉米秸稈殘渣中纖維素、半纖維素、木質素的質量;γc、γh、γl分別為纖維素、半纖維素、木質素回收率;kc為纖維素酶解效率;w為酶解葡萄糖產量;η為底物利用率;ρ1為初始底物質量濃度;ρ2為殘留底物質量濃度;vb為丁醇產生速率;ρb為丁醇質量濃度;t為發酵時間。

1.9 數據處理

采用Microsoft Excel 2019和SPSS Statistics 29.0軟件進行數據統計分析,結果以平均值±標準差表示,p<0.05表示差異顯著,采用GraphPad Prism v8.0 進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同預處理條件對玉米秸稈固體殘渣三素組成及纖維素酶解效率的影響

2.1.1 不同預處理條件對玉米秸稈固體殘渣中纖維素、半纖維素和木質素組成的影響 比較單獨蒸汽爆破(SE)、水浸潤蒸汽爆破(WSSE)和甘油協同蒸汽爆破(GASE)預處理對玉米秸稈固體殘渣中纖維素、半纖維素和木質素組成的影響,結果如表2所示。在3種預處理條件下,預處理固體殘渣中纖維素質量分數為39.2%～39.9%,回收率為76.8%～78.5%,三者之間沒有顯著差異;GASE預處理條件下,固體殘渣中半纖維素質量分數為10.4%,回收率為36.1%,顯著低于SE和WSSE預處理。SE和GASE預處理條件下木質素的回收率均超過100%,推測是在蒸汽爆破過程中固體物料表面有偽木質素沉積[18]。

表2 不同預處理對玉米秸稈固體殘渣組成及其回收率的影響

為了降低偽木質素對纖維素酶解產生的不利影響,首先對玉米秸稈進行水提,再進行甘油協同蒸汽爆破預處理(WE-GASE)。在該預處理條件下固體殘渣中纖維素質量分數達到43.6%,顯著高于未水提的處理,但是由于水提過程的物料損失,纖維素的回收率降低為73.2%;固體殘渣中木質素質量分數由28.6%下降為24.7%,木質素的回收率由117.3%下降為86.5%;二者的顯著降低表明水提能夠將水溶性糖洗出,能有效防止可溶性糖在蒸汽爆破預處理過程中轉化和凝結在生物質表面形成偽木質素。

2.1.2 不同預處理條件對玉米秸稈纖維素酶解的影響 如表3所示,玉米秸稈經SE預處理后進行酶解,酶解效率僅為53.1%,酶解葡萄糖產量為165.4 g·kg-1秸稈。經WSSE和GASE預處理后,玉米秸稈纖維素的酶解效率分別提高到59.6%和78.1%,葡萄糖的產量分別達到179.8和237.2 g·kg-1秸稈,表明GASE可以更有效地提高纖維素的酶解效率和葡萄糖的產量。玉米秸稈經WE-GASE預處理后纖維素酶解效率進一步顯著提高,達到了89.7%,水解液葡萄糖產量254.7 g·kg-1秸稈,較SE預處理分別提高了68.9%和54.5%;水提過程中葡萄糖產量26.1 g·kg-1秸稈,WE-GASE預處理玉米秸稈酶解葡萄糖產量為254.7 g·kg-1秸稈,總葡萄糖產量280.8 g·kg-1秸稈,較SE提高了69.8%。水提-甘油協同蒸汽爆破預處理玉米秸稈效果最好,以該方法對玉米秸稈進行預處理,預處理后的玉米秸稈進行非水洗酶解制備含甘油玉米秸稈水解液開展丁醇發酵研究。

表3 不同預處理對玉米秸稈纖維素酶解效率及葡萄糖產量的影響

2.2 含甘油玉米秸稈水解液的丁醇發酵研究

2.2.1 含甘油玉米秸稈水解液的厭氧瓶丁醇發酵 將WE-GASE預處理玉米秸稈水解液經質量分數4%的活性炭脫毒后進行丁醇發酵。由圖1-A可知,巴氏梭菌CICC10391可以利用水解液中的葡萄糖和甘油,但不能利用木糖。發酵結束后葡萄糖質量濃度由初始的28.2降低到7.4 g·L-1,甘油質量濃度由27.3降低到15.5 g·L-1,利用率分別達到73.9%和43.1%。由圖1-B可知,發酵70 h后丁醇和乙醇的質量濃度分別為6.3 和0.6 g·L-1,丁醇產生速率0.09 g·L-1·h-1,乙酸和丁酸的質量濃度分別為3.6和5.6 g·L-1。丁醇發酵產生速率較低,推測與發酵過程中丁酸的質量濃度過高有關,丁酸積累過多,使菌株生長受到抑制,同時抑制丁酸轉化為丁醇。

A:底物利用質量濃度;B:產物生成質量濃度。下同。

2.2.2 玉米漿對含甘油玉米秸稈水解液丁醇發酵的影響 在上述研究基礎上,在WE-GASE預處理玉米秸稈水解液中額外添加質量濃度為2.5 g·L-1的玉米漿干粉,探究玉米漿對丁醇發酵的影響。由圖2-A可知,發酵96 h,葡萄糖質量濃度由初始的29.8降低到3.8 g·L-1,利用率達到87.2%;木糖質量濃度由7.9降低到6.0 g·L-1,利用率為24.1%;甘油質量濃度由34.3 g·L-1降低到16.7 g·L-1,利用率為51.3%。由圖2-B可知,發酵72 h時丁醇和乙醇的質量濃度分別達到了8.2 和2.1 g·L-1,丁醇產生速率0.11 g·L-1·h-1,乙酸和丁酸質量濃度分別為3.1 和5.1 g·L-1,相比未添加玉米漿的發酵碳源利用率和丁醇質量濃度均顯著提高,而乙酸丁酸維持較高水平。

圖2 玉米漿對含甘油玉米秸稈水解液丁醇發酵過程中底物利用與產物生成的影響

2.2.3 含甘油玉米秸稈水解液的發酵罐丁醇發酵 WE-GASE預處理玉米秸稈水解液發酵中產酸較多會導致發酵液pH值失衡。為有效控制發酵液pH,采用5 L發酵罐進行含甘油玉米秸稈水解液丁醇發酵。水解液經活性炭脫毒且玉米漿添加量為2.5 g·L-1,發酵pH值控制在6.0。由圖3-A可知,發酵50 h葡萄糖消耗完畢,木糖質量濃度由8.8降低到7.9 g·L-1,基本無變化,甘油質量濃度由30.8降低到6.5 g·L-1,葡萄糖和甘油的利用率進一步提高,分別達到100.0%和78.9%,且發酵周期明顯縮短。由圖3-B可知,此時產物中丁醇和乙醇的質量濃度分別達到7.3 和1.2 g·L-1,丁醇的產生速率為0.15 g·L-1·h-1,乙酸和丁酸的質量濃度分別為4.0和2.4 g·L-1。

圖3 5 L發酵罐中含甘油玉米秸稈水解液丁醇發酵的底物利用和產物生成情況

3 結論與討論

為避免出現“與人爭糧”等問題,以木質纖維素材料作為發酵底物生產丁醇成為近年來研究的熱點。復雜的木質素和半纖維素交聯結構阻止了微生物直接利用纖維素,因此利用秸稈等作為發酵原料時需要對其進行預處理[19-20]。XU等[21]運用離子液體經兩步法先后將氫氧化膽堿C5H15NO2和1-乙基-3-甲基咪唑二甲基苯酚([Emin][DMP])用于預處理玉米秸稈,最終木質素脫除率77.28%,纖維素溶解度達到52.14%。HU等[22]將乙?；x子液體用于竹子的半纖維素溶解,發現溶解度受溫度影響很大,隨溫度升高溶解度增大。雖然使用離子液體進行預處理的研究較多,但仍需要進一步探索條件及優化效果,且成本較高[23],限制了其在工業生產中的應用。

本研究首先對比了不同預處理條件下進行蒸汽爆破對玉米秸稈酶解的影響,與單獨蒸汽爆破預處理后纖維素酶解效率53.1%、葡萄糖產量165.4 g·kg-1秸稈相比,玉米秸稈經過水提并按照m(秸稈/g)∶m(甘油/g)∶v(水/L)=1∶0.4∶0.1進行甘油協同蒸汽爆破后,纖維素的酶解效率達到89.7%,葡萄糖產量254.7 g·kg-1,較單獨蒸汽爆破預處理分別提高68.9%和54.5%,這表明水提-甘油協同蒸汽爆破可以有效提高纖維素的酶解效率和葡萄糖的產量。WANG等[15]按照m(秸稈)∶m(甘油)=1∶0.5進行甘油協同蒸汽爆破時,酶解效率為68.1%,相比之下,本研究進一步減少了甘油的用量,且纖維素酶解效率有一定提高。甘油協同蒸汽爆破預處理過程中甘油的回收率為70%。甘油回收率低的原因主要有兩個:一是因為甘油協同蒸汽爆破預處理后物料中甘油和水含量較高,回收過程中甘油隨液體流失;二是蒸汽爆破過程中甘油與小分子糖類尤其是木糖發生糖苷化反應,生成甘油葡萄糖苷或甘油木糖苷[24],但殘留的甘油與糖共同被微生物利用生產生物燃料和生物基化學品,如1,3-丙二醇[25-26]、乙醇、2,3-丁二醇和微生物油脂等[27],有效避免了有機溶劑回收難、環境污染重等問題。

玉米秸稈經水提和甘油協同蒸汽爆破預處理的水解液中含有大量木質纖維素降解副產物,如糠醛、5-HMF、有機酸和酚類等有毒物質,不利于菌株的生長代謝[28],需要通過物理化學方法(如活性炭吸附、overliming、水洗等[29])對預處理水解液進行脫毒以降低水解液中有毒物質的含量。有研究報道玉米漿能夠提高微生物菌株對有毒物質的耐受能力[30]。本研究在利用活性炭對水解液脫毒后添加玉米漿進行丁醇發酵,發酵72 h產物丁醇和乙醇的質量濃度分別為8.2和2.0 g·L-1,但發酵液中乙酸和丁酸濃度較高,容易引發“酸崩潰”[31]。在5 L發酵罐中進行含甘油玉米秸稈水解液丁醇發酵,控制發酵液pH值為6.0,實現了水提-甘油協同蒸汽爆破預處理玉米秸稈水解液高效生產丁醇,經50 h發酵后葡萄糖和甘油利用率分別達到100.0%和78.9%,丁醇質量濃度達到7.3 g·L-1。

本研究通過水提顯著提高了玉米秸稈甘油協同蒸汽爆破預處理效果,實現了預處理玉米秸稈的高效酶解,水解液中甘油和葡萄糖同時被微生物菌株利用生產丁醇,解決了預處理過程中甘油回收難、成本高等難題,為玉米秸稈和生物柴油副產物甘油的高值轉化提供了新的思路。