酶的固定化方法在微流控芯片技術中的應用*

仵靜雯,陳 琳,劉春葉,張 劍

(西安醫學院 藥學院,陜西 西安 710021)

微流控芯片是藥物研發中重要的高通量篩選平臺。實現酶在微流控芯片上的固定化,對提高藥物篩選可靠性尤為重要。隨著20世紀60年代酶固定化技術的興起,酶的固定化在酶分析中得到了廣泛地應用。酶的固定化是指通過化學或物理方法處理,使酶與載體相結合,將自由酶限制在一定區域內,此時酶依然能進行特異性催化的技術。酶經過固定化后,可最大程度地保持酶的催化活性,克服了游離化酶存在的不足,在提高酶催化效率的同時又顯示出許多獨特的優勢,如易分離回收,可連續、重復使用,穩定性高等[1]。固定化酶反應器的微型化可以更有效地縮短分析時間,減少酶和試劑消耗,降低分析成本[2]。

酶的固定化可提高生物活性及穩定性,是酶抑制劑類藥物篩選結果可靠的前提。目前,酶抑制劑類藥物被廣泛使用,對該類藥物的篩選及研究表征也日益成熟[3-6]。臨床用于治療阿爾茲海默癥(AD)的藥物主要為膽堿酯酶抑制劑[7],如加蘭他敏、他克林、多奈哌齊和卡巴拉汀等,使用二維液相色譜與質譜檢測結合毛細管固定化酶反應器反相分離技術,不需要對樣品進行預處理[8]。

微流控芯片技術是通過生物學、化學、醫學、電子、材料、機械等多學科交叉,將分子生物學、化學分析、醫學等領域所涉及的樣品前處理、分離及檢測等過程集成到幾平方厘米的芯片上,從而實現從樣品前處理到后續分析的微型化、自動化、集成化和便攜化的技術,具有樣品消耗少、檢測速度快、操作簡便、多功能集成、體積小和便于攜帶等優點,在藥物研發[9]、病毒檢測[10]、醫學診斷[11]、生物分析[12-13]、藥物篩選及檢測[14-15]、癌癥腫瘤的治療[16-18]等領域得到廣泛應用。作者對常見酶固定化方法尤其是微流控芯片體系中酶的固定化方法進行綜述,為酶抑制劑類藥物篩選提供參考。

1 酶的常見固定化方法

1.1 包埋法

包埋法是通過物理作用,將酶固定在各種多孔載體(如高分子凝膠、金屬有機骨架材料、聚合物膜等)中從而實現酶固定化的方法[2]。由于包埋過程不改變酶的結構和空間構象,也不發生化學反應,能較好地保持酶的活性,且操作工藝簡單,被廣泛采用[19-24]。目前,常用的包埋法根據包埋介質的不同可以分為凝膠包埋法[25-26]和微囊包埋法[27-28]。凝膠包埋法是指將酶包裹在凝膠形成的網格中,該方法操作簡單,反應條件溫和、機械穩定性較高。微囊包埋法是通過物理或化學方法將酶包裹在膜裝置(如中空纖維或微膠囊)中的一種固定化方法,可以同時固定多種酶。該法一般操作簡單,可以更好地維持漆酶的自身結構并保持長期穩定,是一種經濟有效的方法。Dawesa等[20]通過光引發聚乙二醇二丙烯酸酯共聚而成的水凝膠對葡萄糖氧化酶進行包埋,在體外癌細胞培育過程中誘導產生低氧環境,保證了酶的活性。

1.2 物理吸附法

物理吸附法是酶通過分子間相互作用力(如氫鍵、疏水作用、范德華力、靜電引力等)將酶吸附并固定在載體表面的一種酶固定化方法。Ji等[29]利用物理吸附法將漆酶固定到碳納米管改性的聚偏氟乙烯(Polyvinylidenefluoride,PVDF)膜上。與化學交聯法相比,物理吸附法制備的生物催化膜具有可重復裝載的優點,經過4次漆酶重復裝載后,生物催化膜的活力約維持在首次固定化酶活性的70%。物理吸附法作為一種較為成熟的酶固定化技術,已成功用于商業化[30]。

1.3 化學交聯法

化學交聯法是利用雙功能或多功能試劑使酶分子之間相互交聯呈網狀結構的固定化方法,通常是將酶先吸附或包埋在載體上/內,再利用化學交聯以增強酶與載體之間的物理纏繞或化學連接。常用的雙功能試劑有戊二醛(Glutaraldehyde,GA)、偶氮甲酰胺(Azodicarbonamide,ADA)、乙二胺(Ethylenediamine,EDA)、雙偶氮聯苯胺(Bisazobenzidine,BDB)等[31-33],其中GA是最常用的交聯劑。Hilal等[33]采用過濾的方式將脂肪酶吸附到微濾膜孔內,再利用GA將膜內的酶進行交聯固定化,所制備的生物催化膜載酶量高,且具有較高的穩定性。為防止交聯過程中造成酶失活,導致回收率較低的缺陷,經常會在固定化前向酶溶液中加入底物、底物類似物、抑制劑,或向固定化系統中添加惰性蛋白,如牛血清蛋白、明膠等,作為酶的保護劑維持目標酶活性中心的天然結構,保證酶活性不變。

1.4 共價鍵合法

共價鍵合法是將蛋白的非活性基團(如氨基、羧基、巰基、羥基、酚羥基和咪唑基等)與固定化載體表面的官能團以共價鍵形式結合而完成固定化的方法[34-36]?？愒频萚36]發明了一種基于共價鍵合法固定捕獲抗體的紙基酶聯免疫吸附法,用于檢測人血液中類過敏相關屏障組織中肥大細胞上表達的受體(MRGPRX2)含量,其定量結果準確性、重現性良好,適用于臨床檢測和血液流行病學調查。共價鍵固定化酶呈現良好的穩定性及重復使用性,是目前研究較多的一類酶固定方法。但該方法一般反應條件較高,操作復雜,往往會引起酶蛋白高級結構發生變化而影響酶的活性。

綜上所述,酶作為一種催化劑廣泛應用于各行各業,同時在生命活動中發揮十分重要的作用。由于酶容易失活,對反應環境要求高,難以廣泛的在工業及生物學研究中進行運用。同時生命體內微量蛋白的含量低且不易提取,對微量蛋白進行高效催化和檢測成為當前急需解決的問題,微流控芯片上酶的固定化為解決這一問題提供了支撐。

2 微流控芯片上酶的固定化

自1990年瑞士的Manz和Widmer首次提出微型全分析系統以來,微流控芯片因其集成小型化與自動化程度高、高通量、檢測試劑消耗少、樣本量需求少、污染少等優點,在生物醫學研究、臨床診斷、藥物分析、食品安全、環境監測、法醫和軍事等領域顯示了良好的應用前景。微流控芯片將全分析型的實驗室微型化到芯片系統,可完成樣品預處理、反應、注射、分離和檢測等分析步驟[37-38]。微流控芯片體系中酶的固定化為酶抑制劑類藥物的篩選提供了保障。微流控芯片中通常使用溶膠-凝膠包埋技術將酶固定在微流控芯片通道內表面,其缺陷是由于酶的固定不是通過共價鍵,存在容易流失、影響酶解效果等問題。

2.1 物理固定化方法

微流控芯片體系酶的物理固定化方法在保留傳統物理方法的同時,充分利用了微流控體系自身的結構特征[1,39-41]。Kim等[39]使用微陣列固定過氧化酶過程中,將流速控制在1～10 μL/min,利用微珠作為載體,將酶固定在該載體上,再將固定酶的微珠懸浮于一定比例的液體中,注入芯片微通道中,通過機械障礙過濾方法將微珠固定在芯片微通道的特定區域。如果使用磁性微珠,則可通過外加磁場將其固定到通道的目標位置[40]。

2.2 化學固定化方法

利用芯片基底材料表面官能團和酶的氨基酸殘基之間形成共價鍵可將酶固定在微通道表面。目前微流控芯片多用玻璃或聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS),其Si—OH基團可與交聯劑或酶上的氨基酸殘基通過共價鍵進行結合[41-46]。Liang等[43]在微流控紙芯片上制備了復合比色免疫裝置,首先用殼聚糖溶液對紙張表面進行處理,采用原位還原法在微流控紙芯片檢測區固定花型磁性納米金顆粒(FLAuNPs-Pd/Fe3O4@C),再借助捕獲抗體(Ab1)和二抗(Ab2)分子中的氨基將其固定在納米金表面(納米粒子主要用以提高單位面積抗原加載量),最后通過位點選擇性對抗體進行篩選,完成了癌胚抗原和α-甲胎蛋白的高靈敏度檢測。Wang等[44]用殼聚糖處理紙張表面,借助雙功能試劑將抗體以共價鍵修飾到微流控紙芯片(μPADs)檢測區,實現了μPADs上的夾心化學發光免疫分析(CL-ELISA)實驗,對血清中癌胚抗原和α-甲胎蛋白進行了檢測。由文獻可知,和抗原抗體類似,均需要對紙張表面進行殼聚糖處理,引入大量氨基,再借助雙功能試劑實現酶的固定化,才能實現酶分子在紙張表面的共價鍵合。

通過抗生物素-生物素表面化學可將固定化過程集成到微流控芯片中[46-49],降低價格昂貴抗體等生物樣本消耗量(100 ng),提高固定速度(1 min)。該固定過程可以在微流控芯片上自動執行,操作簡單易行。

通過分層組裝技術,也可實現酶在微流控芯片中的固定。Liu等[49]基于一種新開發的全液相微流控芯片,該芯片由納米表面活性劑(NPS)在兩相系統中的界面組裝而成。采用分層組裝策略在微通道表面生成多糖多層膜,以辣根過氧化物酶和葡萄糖氧化酶為模型,構建了全液相微流控酶反應器和級聯反應器,證明了多糖多層膜在提高酶負荷和催化效率方面的關鍵作用。

Zhang等[50]通過酶與聚丙烯酸(Polyacrylic acid,PAA)結合并將其加入海藻酸鹽基微纖維中,可以顯著抑制酶的泄漏,實現酶的穩定性鍵合,提高酶的回收率和熱穩定性。此外,利用這些酶的級聯反應,在優化條件下制備了葡萄糖氧化酶(GOX)和辣根過氧化物酶(HRP)負載的微纖維,用于c(葡萄糖)=0～2 mol/L的可視化檢測。由于可調性和多功能性,這種基于微流體的微纖維平臺,用于級聯催化和多種臨床標志物的診斷。

Gong等[51]首次在微通道反應器中應用流動的懸浮固定化酶進行生物催化。在微通道中流動的功能化形式的石墨烯固定化柚皮苷酶在異槲皮苷生產中取得了優異的結果,流動性懸浮石墨烯片固定化酶具有高度持久的特異性和溫和的催化特性,使酶的重復利用成為可能。

化學交聯法也被應用在微流控芯片體系酶的固定化中。Hickey等[52]使用2種酶交聯反應,將氨?；赋晒潭ㄔ谖⒘骺赝ǖ乐?用于生產穩定的生物催化微反應器,可在幾個月內重復使用。

3 結束語

微流控芯片是一種集成、快速、高效、高通量、試劑用量小的技術平臺,將極大地促進生物分析及藥物評價篩選的研究。酶的固定化可提高其生物活性及穩定性,是酶抑制劑類藥物篩選結果可靠的前提。微流控芯片上酶的固定化通過化學鍵、次級鍵、物理吸附及生物學的方法,將酶固定在特定的載體上,同時保證酶的活性。相比于常見固定化方法,其具有微型化的特點,大大減少了酶與反應物的用量,具有固定化酶的優勢,使酶可以重復利用,同時又提高酶的穩定性,操作簡單且容易控制,易自動化且低耗高效。對微流控紙芯片體系的制備及應用進行簡單總結,旨在對酶在紙張上的固定化進行思考,進一步擴大微流控紙芯片在酶抑制劑類藥物篩選中的應用。