靈芝酸A 對人非小細胞肺癌PC-9 細胞增殖和凋亡的影響及其機制

任愛華, 鞠欣達, 柳驁飛, 劉永超, 劉巖峰

（1. 北華大學基礎醫學院解剖教研室，吉林 吉林 132013； 2. 北華大學基礎醫學院免疫教研室，吉林 吉林 132013）

肺癌是全球癌癥發病率和死亡率較高的惡性腫瘤，非小細胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）是我國肺癌患者死亡的主要類型［1］。腫瘤組織中豐富的血液供應為腫瘤的生長和轉移提供必需的營養物質和氧氣，因此在NSCLC 治療中以抗血管生成治療作為研究熱點［2］。血管內皮生長因子（vascular endothelium growth factor， VEGF）是一種促血管生成因子，JABARI 等［3］認為：VEGF 在肺癌、乳腺癌、胃癌和結直腸癌等實體瘤組織中表達增加，參與腫瘤血管密度和浸潤轉移等特性的形成。諸蘭艷等［4］發現：抗VEGF 藥物與化療結合可以改善NSCLC 患者的預后。VEGF 是血管生成的主要介質，可直接靶向腫瘤細胞促進腫瘤生長和轉移［5］。20世紀90年代初，SEMENZA等［6］在缺氧誘導的細胞核提取物中發現缺氧誘導因子（hypoxiainducible factor，HIF）-1α 和HIF-1β，其中HIF-1α 具有主要活性。HIF-1α 作為一種常見的轉錄因子，廣泛存在于缺氧狀態下的哺乳動物體內［7-8］。HIF-1α 在缺氧環境下通過調控下游血管生長因子表達參與癌組織中血管生成過程［9］。研究［10-13］顯示：HIF-1α 具有促進癌細胞增殖和侵襲等生物活性的作用，提示腫瘤細胞增殖和腫瘤血管生成與HIF-1α 及VEGF 有密切關聯。HIF-1α 具有提高機體免疫力和降血壓及血脂的保健作用，還可能具有抗腫瘤作用［14］。

靈芝又稱仙草，靈芝中抗腫瘤活性成分包括多糖和三萜類化合物等，而三萜類化合物具有殺傷骨肉瘤、結腸癌和肝癌等腫瘤細胞的作用［15］。靈芝酸A（ganoderic acid A，GAA）是靈芝三萜類化合物中的一種。研究［16］顯示：GAA 具有抗腫瘤作用。目前GAA 對NSCLC 的影響尚未完全闡明。本研究以NSCLC PC-9 細胞為研究對象，探討GAA 對NSCLC 細胞增殖、遷移和凋亡的影響，并闡明其對VEGF 信號通路的調控作用，為NSCLC的治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥物、主要試劑和儀器NSCLC PC-9 細胞購自美國ATCC 公司。GAA，純度為98%，用DMSO 溶解，規格為每支20 mg，購自中國食品藥品檢定研究院。噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、兔抗人VEGF 單克隆抗體、兔抗人β-actin，胎牛血清、青霉素、慶大霉素、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、胰蛋白酶、二甲基亞砜和DMEM 培養基（上海玉博生物科技有限公司），Transwell 小室實驗試劑盒（北京優尼康生物科技有限公司），RNA 提取試劑盒（上海生物工程公司），實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）試劑盒（長沙贏潤生物技術有限公司）。流式細胞儀（型號NovoCyte 2040R，美國ACEA 公司），PCR 儀（型號ABI7300，美國Thermo 公司），凝膠成像系統（型號Tanon5200，上海天能科技有限公司）。

1.2 細胞培養和分組將NSCLC PC-9 細胞置于含100 U·mL－1青霉素、100 mg·L－1慶大霉素和10% 胎牛血清的DMEM 培養基中，37 ℃、5%CO2培養箱中孵育，0.25%胰酶消化液消化傳代，每3 d 傳代1 次。取對數生長期細胞，采用不同劑量GAA 處理細胞，將細胞分為對照組（未加GAA）、低劑量GAA 組（0.1 mmol·L－1GAA）和高劑量GAA 組（0.5 mmol·L－1GAA）。

1.3 MTT 法檢測各組PC-9 細胞增殖率取對數生長期PC-9 細胞，消化后以每孔1×104個細胞的密度接種于96 孔細胞培養板中，于37 ℃、5%CO2條件下孵育24 h，細胞貼壁后，棄培養液，將各組PC-9 細胞分別培養24、48 和72 h 后，棄培養液，各孔加入5 mg·L－1MTT 溶液20 μ L，繼續孵育4 h，棄上清液，加入150 μL 二甲亞砜，避光振蕩10 min，采用酶標儀于波長490 nm 處檢測吸光度（A）值，實驗共重復3 次，取3 次平均值，計算各組細胞增殖率。細胞增殖率=（實驗組A 值－空白組A 值）/（對照組A 值－空白組A 值）×100%。

1.4 流式細胞術檢測各組PC-9 細胞凋亡率將處于對數生長期PC-9 細胞以每孔1×106個細胞的密度接種于6 孔細胞培養板中，每孔加入細胞培養液2 mL，各組PC-9 細胞培養48 h，加入0.25%胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，加入1 mL 70%乙醇固定過夜，1 500 r·min－1離心5 min，棄上清，加入PBS 緩沖液洗滌細胞。加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC 和 5 μL PI 染液混勻，37 ℃條件下避光染色30 min，采用流式細胞儀檢測并計數細胞，計算各組細胞凋亡率。細胞凋亡率＝凋亡細胞數/（凋亡細胞數＋正常細胞數）×100%。

1.5 細胞劃痕實驗檢測各組PC-9 細胞劃痕愈合率將處于對數生長期PC-9 細胞以每孔1×106個細胞的密度接種于6 孔細胞培養板中，待細胞生長至約80%融合，采用20 μL 移液槍頭沿無菌格尺于每孔中央部橫向劃痕，棄培養液，PBS 緩沖液洗滌，0 和24h觀察各組細胞劃痕面積，拍照記錄，計算各組細胞劃痕愈合率。細胞劃痕愈合率=（劃痕后0 h 劃痕面積－劃痕后24 h 劃痕面積）／劃痕后0 h 劃痕面積×100%。

1.6 Transwell 小室實驗檢測各組PC-9 細胞遷移細胞數將處于對數生長期PC-9 細胞以培養液洗滌，調整細胞密度為1×106mL－1細胞懸液，于Transwell 小室的上室中加入200 μL 細胞混懸液，于下室中添加100 μL DMEM 培養基和10%胎牛血清。各組細胞由上室向下室聚集，培養24 h 后，下室細胞固定、結晶紫染色并于光鏡下計數膜下細胞。于下室內采用顯微鏡隨機選擇5 個視野計數細胞并取平均值，計算各組PC-9 細胞遷移細胞數。

1.7 RT-qPCR 法檢測各組PC-9 細胞中HIF-1α 和VEGF mRNA 表達水平取對數生長期PC-9 細胞，培養48 h 后經0.25%胰酶消化。所有引物均由云南博尚生物有限公司設計并合成。VEGF 上游引物：5′-GGACAAGTCACCACAGGA-3′，VEGF下游引物：5′-GGAGAAAATCAAGTCGTG-3′，片段長度142 bp；HIF-1α 上游引物：5′-AGCCAGACGATCAGCTAC-3′，HIF-1α 下游引物：5′-TGTGGTAATCCATCATCC-3′，片段長度167 bp；β-actin 上游引物：5′-GACTACCTCATGAAGGTC-3′，β-actin 下游引物：5′-GATCCACATCTGCTGGAA-3′，片段長度500 bp。反應條件：95 ℃、4 min 預變性，92 ℃、30 s，55 ℃、60 s，70 ℃、15 min，30個循環，70 ℃延伸10 min。采用2—△△Ct法計算目的基因表達水平。每組實驗重復3 次

1.8 Western blotting 法檢測各組PC-9 細胞中HIF-1α 和VEGF 蛋白表達水平取對數生長期PC-9 細胞，培養48 h 后經0.25%胰酶消化，加入細胞裂解液，冰上孵育30 min，4 ℃、1 500 r·min－1離心10 min，按試劑盒說明書操作測定蛋白總濃度，每孔上樣量30 g。將蛋白樣品沸水浴中5 min 變性后加入上樣孔，電泳，300 mA 轉膜30 min 至PVDF 膜，PBS 緩沖液HIF-1α 和VEGF 一抗稀釋（1∶1 000），二抗室溫孵育1 h，鑒定膜上的特定蛋白，凝膠成像系統拍照，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin 為內參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。每組實驗重復3 次。

1.9 統計學分析采用SPSS 17.0 統計軟件進行統計學分析。各組PC-9 細胞增殖率、細胞凋亡率、細胞劃痕愈合率、遷移細胞數、細胞中HIF-1α 和VEGF mRNA 及蛋白表達水平均符合正態分布，以±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組PC-9 細胞增殖率與對照組比較，處理24 h 后，低劑量GAA 組細胞增殖率降低，但差異無統計學意義（P>0.05）；處理48 和72 h 后，低劑量GAA 組細胞增殖率均降低（P<0.05）；處理24、48 和72 h，高劑量GAA 組細胞增殖率均降低（P<0.05）。與低劑量GAA 組比較，處理24、48 和72 h，高劑量GAA 組細胞增殖率均降低（P<0.05）。見表1。

表1 各組PC-9 細胞增殖率Tab.1 Proliferation rate of PC-9 cells in various groups(n=6，x±s，η/%）

2.2 各組PC-9 細胞凋亡率與對照組（9.34%±1.54%） 比較，低劑量GAA 組PC-9 細胞凋亡率（12.51%±1.42%）略升高，但差異無統計學意義（P>0.05）。與對照組和低劑量GAA 組比較，高劑量GAA 組細胞凋亡率（21.23%±1.96%）升高（P<0.05）。見圖1。

圖1 流式細胞術檢測各組PC-9 細胞凋亡率Fig. 1 Apoptotic rates of PC-9 cells in various groups detected by flow cytometery

2.3 各組PC-9 細胞劃痕愈合率與對照組（38.15%±3.13%）比較，低劑量GAA 組PC-9 細胞劃痕愈合率（30.98%±4.22%）降低，但差異無統計學意義（P>0.05）。與對照組和低劑量GAA 組比較，高劑量GAA 組細胞劃痕愈合率（8.67%±2.14%）降低（P<0.05）。見圖2。

圖2 各組細胞劃痕愈合情況Fig. 2 Scratch healing of cells in various groups

2.4 各組PC-9 細胞遷移細胞數與對照組（196.25 個±5.83 個）比較，低劑量GAA 組PC-9細胞的遷移細胞數（176.59 個±7.20 個） 減少，但差異無統計學意義（P>0.05）。與對照組和低劑量GAA 組比較，高劑量GAA 組PC-9 細胞遷移細胞數（108.71 個±5.28 個） 減少（P<0.05）。見圖3。

圖3 Transwell 小室實驗檢測各組PC-9 細胞遷移情況（結晶紫,×200）Fig. 3 Migration of PC-9 cells in various groups detected by Transwell chamber assay (Crystal violet,×200)

2.5 各組PC-9 細胞中HIF-1α 和VEGF mRNA 表達水平與對照組比較，低劑量GAA 組PC-9 細胞中HIF-1α 和VEGF mRNA 表達水平降低，但差異無統計學意義（P>0.05），高劑量GAA 組PC-9細胞中HIF-1α 和VEGF mRNA 表達水平降低（P<0.05）。與低劑量GAA 組比較，高劑量GAA組PC-9 細胞中HIF-1α 和VEGF mRNA 表達水平降低（P<0.05）。見表2。

表2 各組PC-9 細胞中HIF-1α 和VEGF mRNA 表達水平Tab. 2 Expression levels of HIF-1α and VEGF mRNA in PC-9 cells in various groups(n=6，x±s）

2.6 各組PC-9 細胞中HIF-1α 和VEGF 蛋白表達水平與對照組比較，低劑量GAA 組PC-9 細胞中HIF-1α 和VEGF 蛋白表達水平降低，但差異無統計學意義（P>0.05）；與對照組和低劑量GAA 組比較， 高劑量GAA 組PC-9 細胞中HIF-1α 和VEGF 蛋白表達水平降低（P<0.05）。見圖4。

圖4 各組PC-9 細胞中HIF-1α 和VEGF 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B、C）Fig. 4 Electrophoregram (A) and histograms(B, C) of expressions of HIF-1 α and VEGF proteins in PC-9 cells in various groups

3 討 論

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其中以NSCLC 最為常見［17］。HIF-1α 參與調節腫瘤細胞的多種生物學活性，包括腫瘤細胞周期、腫瘤血管形成、腫瘤細胞代謝及腫瘤細胞轉移和侵襲［18］。JIN 等［19］發現：在鱗狀細胞肺癌中HIF-1α 顯著高表達。研究［20］顯示：在腫瘤的發生發展過程中，VEGF 對血管內皮細胞增殖、遷移和血管重建發揮重要作用，其對于腫瘤血管形成更為關鍵，因此VEGF 阻止血管的生成可以作為腫瘤防治中重要的研究方向。由此可見，HIF-1α 和 VEGF 可能是肺癌血管生成的重要因素。研究［21-22］顯示：靈芝具有抗腫瘤和提高機體免疫力等作用。GAA 具有抑制乳腺癌、膠質瘤、骨肉瘤和前列腺癌等腫瘤的生物活性、 增殖及侵襲能力， 促進腫瘤細胞凋亡［23-25］。

本研究結果顯示：高劑量GAA 對NSCLC PC-9 細胞增殖抑制作用明顯，低劑量GAA 在48 h和72 h 抑制細胞增殖作用逐漸顯現，表明低劑量GAA 延長作用時間也可抑制細胞增殖。采用流式細胞術檢測細胞凋亡情況，結果顯示：高劑量GAA 促進PC-9 細胞凋亡，與MTT 法檢測結果一致；Transwell 小室實驗結果顯示：高劑量GAA 可抑制PC-9 細胞遷移能力，低劑量GAA 對于抑制PC-9 細胞增殖和細胞遷移及促進凋亡作用并不明顯，提示GAA 對腫瘤生物活性的抑制作用與劑量有關，這與林曉萌等［24］的研究結果一致。本研究結果顯示：低劑量GAA 對PC-9 細胞中HIF-1α 和VEGF mRNA 及蛋白表達無下調作用，而高劑量GAA 可明顯抑制PC-9 細胞中HIF-1α 和VEGF mRNA 及蛋白表達。HIF-1α 和VEGF 在NSCLC組織中的表達與疾病發生發展、轉移、預后和治療有關聯［26］。高劑量GAA 可抑制腫瘤細胞的生物活性，可能與其下調HIF-1α 和VEGF mRNA 及蛋白表達有關。

綜上所述，高劑量GAA 可抑制PC-9 細胞增殖，促進其凋亡，其機制可能與調控VEGF 和HIF-1α mRNA 及蛋白表達有關。