PPC/PBS 引導骨再生生物膜的制備及其理化性能和生物學特征評價

石曉璐, 田 野, 翟少博, 劉 洋, 儲順禮

（吉林大學口腔醫院種植科，吉林 長春 130021）

外傷、先天畸形、腫瘤術后和廢用性萎縮等原因導致的牙槽骨水平及垂直方向吸收在臨床上較常見［1］。在口腔種植術中，充足的骨量可以提供良好的骨結合，從而使種植體獲得足夠的穩定性。引導骨再生（guided bone regeneration，GBR） 是重建牙槽骨和治療種植體周圍骨缺損最常用的方法之一［2-3］，其原理是利用生物膜的物理屏障功能將病損區與周圍組織隔離，創造相對封閉的組織環境，從而使特定組織的再生功能得到最大程度的發揮。因此，生物膜的應用在GBR 中起重要作用。目前市場上生物膜品牌眾多，種類多樣，但均存在部分缺陷，難以滿足臨床上包含水平和垂直等各種骨缺損條件下的骨增量需求。不可吸收性生物膜邊緣易刺破黏膜造成生物膜暴露，引起軟組織瓣裂開和感染，且通透性差，對血運有明顯阻礙作用，不利于組織再生的營養供應［4-5］；可吸收性生物膜硬度不足，無法支撐局部骨再生空間，影響骨再生效果，也存在吸收速率和屏障作用的匹配性問題。此外，可吸收性生物膜價格昂貴，品種單一，無法完全用于臨床不同類型骨缺損的再生修復術等［4］。因此，研發同時具備良好的通透性、貼附可塑性、可吸收特性、支架作用和空間維持能力的復合型生物膜成為研究熱點。

CO2共聚物具有良好的生物相容性和空間支撐能力，上述優點是其作為口腔生物屏障膜原材料的基礎。聚碳酸1，2-丙二酯又稱聚碳酸亞丙酯（poly propylene carbonate，PPC），由CO2和環氧丙烷共聚而成，屬于CO2共聚物，其生物相容性好，可被微生物分解［6-7］。PPC 具有無污染、可降解、良好的生物相容性、溫度記憶性和高阻隔性等優點。研究［8］將PPC 制作成支架材料，與骨髓間充質干細胞進行共培養，細胞生長入支架的三維結構中，證實PPC 材料可與骨髓間充質干細胞緊密結合，同時也具備良好的空間支架作用。聚丁二酸丁二醇酯（poly butylene succinate，PBS） 具有高度疏水的鏈結構，降解速率較慢，可完全生物降解且產物無毒，常作為藥物緩釋載體應用于生物醫學領域［9-11］。PPC 和PBS 價格優廉、成品可吸收、空間支撐能力強和厚度較低，可彌補市售生物膜的部分缺陷。近年來PPC 材料逐漸應用于口腔醫學領域［12］，但將PPC 和PBS 應用于口腔種植領域的研究尚未見報道。

本研究將PPC 與PBS 共混，采用鹽析法制備與人體骨外膜結構相仿且由致密的光滑面層和多孔狀的粗糙面層組成的PPC/PBS 生物膜，評估其理化性能和生物學特征，為新型GBR 生物膜的臨床研究和應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器3 d 齡SD 乳鼠，實驗動物生產許可證號：SCXK（吉）2008-0005；健康成年日本大耳白兔6 只，體質量2.5 kg，雌雄不限，實驗動物生產合格證號：SCXK（吉）2008-0005，均購于吉林大學實驗動物中心。PPC 的數均相對分子質量為43 000，由內蒙古蒙西高新技術集團公司生產，PBS 的數均相對分子質量為103 000（日本Showa 公司），氯仿為分析純（天津新通精細化工有限公司），氘代氯仿（deuterated chloroform，DCCL3）（上海默克化工技術有限公司），DMEM細胞培養液（美國Gibco 公司），標準胎牛血清（奧地利PAA 公司），胰蛋白酶（上?；瘜W試劑廠），BME-10X 膠原膜（福建省博特生物科技有限公司），多聚甲醛（北京化學工業集團有限責任公司），堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）試劑盒（南京建成生物工程研究所），速眠新Ⅱ注射液（吉林省軍事醫學科學院獸醫研究所），利多卡因（上海朝暉藥業有限公司），滅菌注射用水（天津藥業集團新鄭股份有限公司）。磁力攪拌器（鄭州南北儀器設備有限公司），場發射環境掃描電子顯微鏡（型號XL30，美國FEI 公司），GPC 凝膠滲透色譜儀（型號Waters/1515，美國Waters 公司），電液伺服實驗系統（型號MTS 810，美國MTS 系統公司），多功能電子拉伸實驗機（型號Z010，德國Zwick 公司），視頻光學接觸角測量儀（型號OCA20，德國Dataphysics 公司），激光共聚焦顯微鏡（型號OLS3000） 和倒置顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）， CO2細胞培養箱 （日本SANYO 公司），恒溫水浴振蕩器（型號SHA-CA，江蘇省常州榮華儀器制造有限公司）。

1.2 PPC/PBS 生物膜制備氯仿溶液中加入PPC和PBS，采用磁力攪拌器攪拌至PPC 與PBS 完全溶解，形成混濁液，傾倒入特制的容器中。隨后加入食鹽，攪拌使其均勻分布于混濁液中，在空氣中靜置24 h，揮發去除有機溶劑形成含食鹽顆粒的生物膜，置于去離子水中漂洗1 周，每12 h 更換1 次去離子水，去除食鹽，常溫下干燥2 周，備用。采用能譜分析法測定PPC/PBS 生物膜表面和斷面的鈉和氯含量以明確食鹽殘余量。將PPC/PBS 膜置入DCCL3配制為0.1 g·L－1溶液，置入400 MHz 核磁共振儀中進行核磁共振氫譜（1H nuclear magnetic resonance spectra，1HNMR） 檢測，觀察并比較PPC/PBS、PPC 和PBS1HNMR 吸收峰，分析其共混前后化學結構變化。

1.3 掃 描 電 子 顯 微 鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察PPC/PBS 生物膜超微形態表現對生物膜樣本進行噴金處理，采用SEM 觀察生物膜光滑面、粗糙面和橫斷面超微形態表現并記錄。

1.4 PPC/PBS 生物膜理化性能采用GPC 凝膠滲透色譜儀測定生物膜樣本的數均相對分子質量、重均相對分子質量和聚合物分散性指數（ploymer dispersity index，PDI），根據生物膜多孔壓縮前后體積變化計算孔隙率，測定3 個樣本并計算平均值?？紫堵? ［初始體積（cm3） －壓縮后體積（cm3）］/初始體積（cm3）×100%。將“1.2”中制備的PPC/PBS 生物膜裁剪為與孔板底部大小相同的尺寸，制成生物膜樣本。采用多功能電子拉伸實驗機測定室溫下生物膜樣本的楊氏模量、斷裂強度和斷裂伸長率，拉伸速率為10 mm·min－1，測定5 個樣本并計算平均值。楊氏模量（E） =應力（σ）/應變（ε）；斷裂強度（N） 為樣本斷裂時所承受的最大拉伸應力；斷裂伸長率=斷裂時標線間距離的增加量（mm）/初始標距（mm）×100%。采用OCA20 視頻光學接觸角測量儀測量PPC/PBS生物膜靜態接觸角的度數。滴加4 μL 蒸餾水，每個樣本檢測4 個點，點與點間距較遠，以避免相互影響，測定3 個樣本并計算平均值。

1.5 原代SD 乳鼠成骨細胞分離、培養和純化采用酶消化法由乳鼠顱骨上提取原代成骨細胞，用含89% DMEM、10%胎牛血清和1%雙抗的完全培養基混懸沉淀細胞，接種于培養瓶中，37 ℃、5% CO2培養箱中培養，7 d 后換液，以后每3 d 換液1 次，觀察細胞的生長狀況。待細胞鋪滿培養瓶80%后進行成骨細胞的純化和傳代。

1.6 生物膜成骨細胞接種實驗接種實驗分為對照組（未加生物膜）、BME-10X 膠原膜組和PPC/PBS 生物膜組，每組4 個平行試樣。各組均設 1、3、7 和14 d 共 4 個觀察時間點。將經環氧乙烷熏蒸消毒后的生物膜放入48 孔細胞培養板中，每孔加入1 片生物膜，使用高溫高壓消毒后的不銹鋼結扎絲固定，加入DMEM 培養液200 μL，置于37 ℃、5% CO2培養箱內預浸泡2 h，吸棄浸泡材料的培養基。調整骨細胞懸液濃度，按照細胞濃度為每孔2.0×104個細胞的密度接種于孔內，置于細胞培養箱內培養，每3 d 換液1 次。

1.7 SEM 觀察各組成骨細胞附著和生長情況取培養的第1、3、7 和14 天的樣本，生理鹽水沖洗2 次，3%戊二醛固定液4 ℃過夜，1%鋨酸固定液中固定2 h， 30%、 50%、 70%、 80%、 90%、95%和100%梯度酒精脫水，真空干燥，表面噴金，采用SEM 觀察成骨細胞在生物膜上的附著和生長情況。

1.8 細胞計數法檢測各組材料表面附著成骨細胞數量將培養第 1、3、7 和14 天的各組樣本由培養液中取出，采用生理鹽水沖洗2 次，置入新的細胞培養板中，加入 0.2 mL、0.25%胰蛋白酶消化液消化4~5 min，加入1 mL DMEM 培養液終止消化，取10 μL 液體計數細胞并記錄，不同培養時間各組材料表面附著成骨細胞數量變化代表細胞增殖情況。實驗重復 3 次并取平均值。

1.9 ALP 試劑盒檢測各組成骨細胞分化情況將培養第 1、3、7 和14 天的各組標本從培養液中取出，采用生理鹽水沖洗2 次，置入新細胞培養板中，加入細胞裂解液100 μL 裂解10 min，按ALP試劑盒說明書操作要求，采用紫外分光光度儀檢測PPC/PBS 生物膜組、BME-10X 膠原膜組和對照組吸光度（A） 值，以A 值代表各組細胞中ALP水平。

1.10 兔背部肌肉降解實驗檢測PPC/PBS 生物膜體內降解性能將PPC/PBS 生物膜剪切為長15 mm 和寬8 mm 的長方形試樣，75%酒精浸泡消毒干燥后稱質量，記錄試樣的初始質量。抽取速眠新及滅菌注射用水，1∶1 混合后于兔臀部肌內注射全麻，固定于實驗臺上，剪去兔脊背兩側背毛，強力碘局部消毒，2%利多卡因行背部皮下浸潤麻醉。背脊處正中切開皮膚，在兔脊柱兩側約2.5 cm 處鈍性分離直至深層肌肉，每側等距離選擇3 個植入點，每點間隔1 cm，將稱質量后各試樣送入深度1 cm 的肌肉中，縫合創口。植入后的第2、4、8、12、26 和52 周，分別處死1 只兔，取出樣品，計算各組材料的失重率、相對分子質量變化率、斷裂強度和斷裂伸長率，觀察材料表面結構變化。失重率＝［實驗前質量（g）－實驗后質量（g）］/實驗前質量（g） ×100%；相對分子質量變化率＝（實驗前相對分子質量－實驗后相對分子質量）/實驗前相對分子質量×100%。

1.11 統計學分析采用SPSS 16.0 統計軟件進行統計學分析。各組材料機械性能參數、附著成骨細胞數和ALP 水平均符合正態分布，以±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 PPC/PBS 生物膜制備由鹽析法制備的生物膜具有雙層樣結構，即為光滑面層和粗糙面層，與人體骨外膜結構相似。見圖1。光滑面層較薄，厚約為0.05 mm，表面光滑平整；粗糙面層較厚，厚約為0.45 mm，表面粗糙多孔； 全層厚約為0.50 mm。能譜檢測顯示生物膜中各元素相對質量分數百分率為碳65.66%、氧33%、鈉0.67%和氯0.68%；相對原子分數百分率為碳72.15%、氧27.22%、鈉0.38%和氯0.25%，鈉和氯的總相對原子分數百分率小于1.4%，證實生物膜中食鹽已基本洗出。 見圖2。 與PPC1HNMR 和PBS1HNMR 比較，PPC/PBS 生物膜1HNMR 顯示其未發生化學性結合，仍保持PPC 和PBS 各自的結構。見圖3。

圖1 PPC/PBS 生物膜表面結構Fig. 1 Surface structures of PPC/PBS biofilm

圖2 PPC/PBS 生物膜能譜圖Fig. 2 Energy spectrum of PPC/PBS biofilm

圖3 PPC、PBS 和 PPC/PBS 生物膜的1HNMRFig. 3 1HNMR of PPC, PBS,and PPC/PBS biofilms

2.2 PPC/PBS 生物膜超微形態表現電鏡下可見PPC/PBS 生物膜光滑面層表面較為光滑致密，平整，微米級孔較少見。粗糙面層呈多孔狀，表面均為微米級孔所覆蓋，孔大小不一，大孔孔徑約為200 μm，平均孔徑約為120 μm。斷面呈明顯的雙層樣結構，光滑面層較薄，粗糙面層較厚，孔與孔之間相通。見圖4。

圖4 SEM 觀察PPC/PBS 生物膜超微形態表現Fig. 4 Ultramorphology of PPC/PBS biofilm observed by SEM

2.3 PPC/PBS 生物膜理化性能PPC/PBS 生物膜的數均相對分子質量約為45 000，重均相對分子質量約為229 000， PDI=5.13， 孔隙率約為77.4%。拉伸試驗顯示：PPC/PBS 生物膜的楊氏模量約為38.1 MPa，斷裂強度約1.22 MPa，斷裂伸長率約為7.4%。接觸角檢測顯示其有良好的濕潤性，粗糙面接觸角平均85°，光滑面按觸角平均57°。見圖5。

圖5 PPC/PBS 生物膜接觸角Fig. 5 Contact angles of PPC/PBS biofilm

2.4 SEM 觀察各組材料成骨細胞附著和生長情況PPC/PBS 生物膜組可見培養1 d 時，生物膜表面附著的細胞較少；培養3、7 和14 d 時，大量成骨細胞附著于生物膜表面生長，細胞伸出偽足附著于生物膜上，胞體可呈懸空樣分布于孔隙中。BME-10X 膠原膜組可見培養1 和3 d 時，表面未見細胞；培養7 和14 d 時膠原膜表面有細胞生長，但其細胞數量較少。見圖6。

圖6 SEM 觀察各組成骨細胞附著和生長情況Fig. 6 Attachment and growth of osteoblasts in various groups observed by SEM

2.5 各組材料表面附著成骨細胞數量與對照組比較，培養1、3、7 和14 d 時BME-10X 膠原膜組和PPC/PBS 生物膜組材料表面附著成骨細胞數量均減少（P<0.05）。與BME-10X 膠原膜組比較，培養1、3、7 和14 d 時PPC/PBS 生物膜組材料表面附著成骨細胞數量均增加（P<0.05）。見表1。

表1 不同培養時間各組材料表面附著成骨細胞數量Tab. 1 Numbers of osteoblasts attached to surface of materials in various groups at different time points (n=3，±s,×104）

表1 不同培養時間各組材料表面附著成骨細胞數量Tab. 1 Numbers of osteoblasts attached to surface of materials in various groups at different time points (n=3，±s,×104）

*P<0.05 compared with control group； △P<0.05 compared with BME-10X collagen membrane group.

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2.6 各組材料表面附著成骨細胞中ALP 水平與對照組比較，培養1、3、7 和14 d 時BME-10X 膠原膜組和PPC/PBS 生物膜組材料表面附著成骨細胞中ALP 水平明顯降低（P<0.01）。與BME-10X膠原膜組比較，培養1 和3 d 時PPC/PBS 生物膜組材料表面附著成骨細胞中ALP 水平明顯升高（P<0.01）；培養7 和14 d 時，BME-10X 膠原膜組和PPC/PBS 生物膜組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

表2 各組材料表面附著成骨細胞中ALP 水平Tab.2 ALP levels in osteoblasts attached to surface of materials in various groups(n=3，±s）

表2 各組材料表面附著成骨細胞中ALP 水平Tab.2 ALP levels in osteoblasts attached to surface of materials in various groups(n=3，±s）

*P<0.01 compared with control group； △P<0.01 compared with BME-10X collagen membrane group.

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2.7 PPC/PBS 生物膜體內降解性能與降解0 周時比較，降解4 周時，PPC/PBS 生物膜失重率和相對分子質量變化率均逐漸升高，且呈時間依賴性（P<0.05）；降解26 周時，PPC/PBS 生物膜失重率約為16.15%；降解52 周時，PPC/PBS 生物膜失重率約為49.18%。見圖7。強度變化檢測，與降解0 周時比較，降解4 周時，PPC/PBS 生物膜斷裂強度和斷裂伸長率均逐漸減?。≒<0.05 或P<0.01）；降解52 周時，體內生物膜已降解碎裂成較薄的小塊狀，無法檢測其斷裂強度和斷裂伸長率。見表3。SEM 觀察PPC/PBS 生物膜超微形態表現，自第2 周開始，PPC/PBS 生物膜粗糙面表面開始出現微孔樣結構，隨時間推移，粗糙面表面微孔樣結構數逐漸增多，孔徑為0~10 μm；至降解26 周時，PPC/PBS 生物膜粗糙面表面均勻微孔樣結構均勻分布。降解4 周時，PPC/PBS 生物膜光滑面表面出現脫屑樣改變，但未見有微孔樣結構；降解12 周時，光滑面表面出現較少微孔樣改變，孔徑<5 μm；降解26 周時，光滑面表面微孔樣結構數增多，孔徑<10 μm。見圖8 和9。

表3 不同降解時間點PPC/PBS 生物膜體內降解斷裂強度和斷裂伸長率Tab. 3 Fracture strengthes and elongations at break of PPC/PBS biofilm degraded in vivo at different degradation time poitns(n=5，±s）

表3 不同降解時間點PPC/PBS 生物膜體內降解斷裂強度和斷裂伸長率Tab. 3 Fracture strengthes and elongations at break of PPC/PBS biofilm degraded in vivo at different degradation time poitns(n=5，±s）

“－”：No data.*P<0.05，**P<0.01 compared with 0 week.

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圖7 不同降解時間PPC/PBS 生物膜體內降解失重率曲線和相對分子質量變化率曲線Fig. 7 Curves of weight loss rate and relative molecular mass rate of change of PPC/PBS biofilm in vivo at different time points after degradation

圖8 不同降解時間點PPC/PBS 生物膜粗糙面超微形態表現（×200）Fig. 8 Ultramorphology of rough surface of PPC/PBS biofilms at different degradation time points (×200)

圖9 不同降解時間點PPC/PBS 生物膜光滑面超微形態表現Fig. 9 Ultramorphology of smooth surface of PPC/PBS biofilms at different degradation time points

3 討 論

隨著高分子聚合物材料在醫學領域應用范圍的不斷擴大，人們對生物可降解高分子聚合物材料的研究越來越深入，研發的類型也逐漸多樣化。由于高分子聚合物材料的品種繁多，性質差異較大，因此可作為替代材料應用于人體多個組織。PPC 作為可完全生物降解的新型材料，具有較聚乙烯和聚氯乙烯更好的阻隔性和生物相容性，可應用于醫用包裝材料，但PPC 玻璃化轉變溫度較低，力學性能和耐熱性能較差，且降解速度較慢［7，13-14］。PBS 具有高度疏水的鏈結構，但因缺少活性位點且降解速率較慢使其應用受到限制［15］。單一的均聚物常難以滿足現代科學對高聚物材料日益苛刻的要求，而共混改性可將不同性能的聚合物共混，實現各共混組分性能互補，提高聚合物的性能，從而研發出綜合性能優越的材料［15］。本研究將PPC/PBS 共混改性，并通過鹽析法合成與人體骨外膜結構相似的雙層樣結構PPC/PBS 生物膜。

中國醫學科學院生物醫學工程研究所研制的BME-10X 醫用膠原膜為目前在醫學領域較常用的生物膜［16］。本研究結果顯示：PPC/PBS 生物膜較薄，厚度約為0.5 mm，占據的空間較小，且具有良好的強度和彈性模量，不溶于水，在液體中不易發脹。提示PPC/PBS 生物膜具備良好的空間維持能力，可保證骨缺損區的骨再生恢復。

PPC/PBS 生物膜雙層多孔樣結構與人體的骨外膜相似，光滑面層與人體骨外膜的外層相似，表面較致密光滑，在一定程度上可阻止軟組織生長入骨組織中，避免在骨組織中形成纖維性結構，可起到較好的屏障作用。粗糙面層大孔孔徑約為200 μm，平均孔徑約為120 μm，孔與孔之間相通，成骨細胞直徑約為20 μm，附著時成骨細胞直徑約為30 μm。提示本研究制備的PPC/PBS 生物膜粗糙面層孔徑范圍可容納成骨細胞生長，可能在發揮生物膜屏障作用的同時具備骨支架材料的骨引導再生作用。

生物膜強度和孔隙率成反比，良好的強度和孔隙率是生物膜發揮屏障和骨引導雙重作用的關鍵［17］。本研究制備的PPC/PBS 生物膜具有良好的機械強度，空間維持能力強，且孔隙率較高。較高的孔隙率可增加材料內部的體液流動和擴散，有利于改善材料內部細胞生長微環境，促進局部骨改建。本研究結果顯示：PPC/PBS 生物膜接觸角均小于90°，證實其具有較好的濕潤性，在GBR 過程中可吸附局部循環體液和血液，為細胞的生長提供營養支持，為組織再生創建良好的微環境。

PPC/PBS 是一種可降解高分子共聚物，將其開發為口腔醫學使用的GBR 生物膜材料，具有良好的細胞相容性，成骨細胞在其表面的附著功能是該材料生物有效性的最重要因素。成骨細胞緊密地黏附于生物膜上，可充分發揮其骨引導作用。本研究結果顯示：培養1 d 時，PPC/PBS 生物膜組可見成骨細胞貼壁生長，培養3 d 時成骨細胞數量增加，至7 d 時成骨細胞已長滿，14 d 時成骨細胞密集形成復層生長，與成骨細胞正常生長傳代周期相似，提示PPC/PBS 生物膜對其周圍的細胞生長繁殖無不良影響。SEM 觀察結果顯示：PPC/PBS 生物膜表面可見大量成骨細胞貼附生長，伸展良好，胞體可呈懸空樣分布于孔隙中，細胞伸出偽足附著，這可能與本研究制備的PPC/PBS 生物膜的多孔化結構有關。研究［18］顯示：支架孔隙率為75%以上，常規細胞種植技術可成功。本研究制備的PPC/PBS 生物膜平均孔徑約為120 μm，孔隙率約為77.4%，可容納成骨細胞，其多孔化結構適宜細胞生長。

GBR 對膜材料降解性能要求較高。在創口愈合早期，屏障膜需保持其結構的完整性。GBR 膜降解速度過快導致大量的降解產物快速進入機體骨缺損處，可能會妨礙骨的重建和再生；同時其材料的力學性能也會迅速降低，使骨缺損處的再生空間的維持能力下降，當膜失去支架作用后纖維組織細胞生長入骨缺損區進而形成纖維連接，影響骨重建［11］。然而，若GBR 膜降解速度過慢，材料的異物反應時間較長，可能會引起機體的不良反應。因此，推斷生物膜體內存留時間于17 周后可能效果會更好，最好達9 個月甚至更長時間，以保證骨再生的質量。本研究結果顯示：PPC/PBS 生物膜是一種完全生物降解性高分子材料，在體內至少可維持12 個月，保證充足的骨再生時間；其強度下降緩慢，可較長時間地保持表面的完整性，維持骨再生空間的作用可超過6 個月。PPC/PBS 生物膜體內生物相容性良好，因此PPC/PBS 生物膜在體內較長時間存在可能較為安全。

綜上所述，PPC/PBS 生物膜與人體骨外膜結構相似，呈雙層樣結構，親水性好，光滑面層表面較為致密，粗糙面層孔隙率高，生物相容性好，且降解緩慢，是一種理想的引導再生生物膜。