基于網絡藥理學和分子對接技術探討丹蛭降糖膠囊治療糖尿病腎病的作用機制

陳陽 ，劉劍 ，陸翔 ，陸瑞敏

1.安徽中醫藥大學第一臨床醫學院，安徽 合肥 230038；2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院，安徽 合肥 230031

糖尿病微血管并發癥包括腎臟病變和眼底病變，其中腎臟病變即為糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN），可促使慢性腎臟?。–KD）和終末期腎病的發生發展。如不及時治療，CKD可能會進展為終末期腎功能衰竭，導致不良預后[1]。目前，臨床治療DN主要包括生活方式干預，如運動、減肥、低鈉飲食，以及控制高血糖和高血壓的藥物干預。但部分藥物存在不良反應，且并不能完全延緩向終末期腎病的進展[2]。近年來，中醫藥通過辨證論治，在降糖降壓基礎上協調使用中藥復方，能夠增加療效，有效延緩DN的發展[3-4]。

丹蛭降糖膠囊是安徽省名中醫方朝暉主任研發的臨床驗方，由太子參、菟絲子、澤瀉、水蛭、生地黃、牡丹皮6味中藥組成，具有養陰活血、化瘀通絡之效，可緩解炎癥，抗氧化應激，改善腎纖維化等[5]。為進一步研究丹蛭降糖膠囊治療DN的作用機制，本文采用網絡藥理學與分子對接技術，從“藥物-成分-作用靶點-疾病”復雜網狀結構，分析關鍵作用靶點、分子生物學過程、信號通路等，為其臨床應用提供依據。

1 資料與方法

1.1 丹蛭降糖膠囊活性成分篩選及對應靶點獲取

檢索TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）[6]中太子參、牡丹皮、菟絲子、澤瀉的化學成分，保留分子量180～500、脂水分配系數（AlogP）＜5、氫鍵供體數（Hlon）＜5、氫鍵受體數（Hacc）＜10、口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18的成分及對應靶點[7]。由于TCMSP未收錄水蛭和生地黃，故檢索其相關文獻進行補充[8-11]。對于TCMSP中無靶點的成分，在BATMAN-TCM數據庫（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）中以“Pvalue＜0.05”且“Score cutoff≥39”為標準預測其有效靶點[12]。對于不滿足要求但相關藥理活性強，且OB值及DL值符合要求的成分也納入其中。利用UniProt數據庫（http://www.uniprot.org/），限定狀態為通過試驗驗證（Swiss-prot），物種為“Homo Sapiens”，檢索得到靶點對應的基因名，對所有基因去重，得到丹蛭降糖膠囊活性成分的作用靶點。

1.2 糖尿病腎病相關靶點篩選與獲取

以“Diabetic kidney disease”和“Diabetic nephropathy”為關鍵詞，檢索OMIM數據庫（http://www.mim.org）[13]、GeneCards數據庫（http://www.genecards.org）[14]、TTD數據庫（http://db.idrblab.net/ttd/）[15]中DN相關靶點，其中GeneCards數據庫以Score值≥中位數為靶點篩選標準。將結果合并去重后，獲得DN靶點。

1.3 丹蛭降糖膠囊治療糖尿病腎病交集靶點獲取

利用Venny2.1.0在線平臺（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）得到丹蛭降糖膠囊活性成分靶點和DN靶點的交集靶點。采用Cytoscape3.9.1軟件構建丹蛭降糖膠囊“活性成分-交集靶點”網絡，采用CytoNCA插件進行網絡拓撲分析，篩選介數中心性較大的活性成分。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用網絡構建及核心靶點篩選

將交集靶點導入STRING數據庫（http://string-db.org）[16]，設置物種為“Homo Sapiens”，選擇minimum required交互得分：high confidence（0.700），隱藏孤立節點，得到蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡。將數據導入Cytoscape3.9.1構建丹蛭降糖膠囊治療DN的PPI網絡，運用CytoHubba插件，以介數中心性、緊密中心性、度中心性排名前10位的節點為核心靶點。

1.5 GO功能及KEGG通路富集分析

將交集靶點導入Metascape數據庫（http://www.metascape.org）[17]，選擇物種為“Homo Sapiens”，自定義分析默認P＜0.01，分別進行GO功能和KEGG通路富集分析，其中GO功能包括生物過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF）3個部分，選取各部分P值排序前10位的條目和KEGG前20位的通路進行可視化展示。

1.6 分子對接驗證

在PubChem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）導出核心成分的3D結構，利用PyMOL軟件轉化為PDB格式，再從RCSB PDB數據庫（http://www.rcsb.org）中獲得核心靶點的蛋白晶體結構，利用PyMOL軟件去水、清除原配體并保存為PDB格式，運用AutoDockTools軟件對核心成分進行調整電荷、選擇扭轉鍵等處理，對核心靶點采用加氫等處理，最終以PDBQT格式導入AutoDock Vina[18]中進行分子對接，獲取丹蛭降糖膠囊核心成分治療DN的證據支持。

2 結果

2.1 丹蛭降糖膠囊活性成分與對應靶點

檢索TCMSP和相關文獻后，得到太子參活性成分3個、牡丹皮6個、菟絲子7個、澤瀉5個、水蛭4個、生地黃7個，共有活性成分4個，去除無靶點的5個成分，最終得到丹蛭降糖膠囊組方藥物26個活性成分，見表1。共獲得活性成分靶點267個。

2.2 糖尿病腎病相關靶點篩選結果

檢索TTD、OMIM、GeneCards數據庫，共得到DN相關靶點17 134個，對GeneCards數據庫靶點進行4次中位數篩選，合并靶點后得到853個DN相關靶點。

2.3 丹蛭降糖膠囊治療糖尿病腎病的作用靶點

將活性成分靶點與DN相關靶點導入Venny2.1.0在線平臺，得到109個交集靶點。因水蛭成分梔子苷和生地黃成分對應的靶點與疾病靶點無交集，故最終保留24個活性成分。利用Cytoscape3.9.1軟件構建丹蛭降糖膠囊“活性成分-交集靶點”網絡，見圖1。該網絡共有138個節點和291條邊。通過CytoNCA插件篩選介數中心性排名前5位的活性成分為核心成分，分別為quercetin（槲皮素）、ursolic acid（熊果酸）、luteolin（木犀草素）、kaempferol（山柰酚）、isorhamnetin（異鼠李素），見表2。

表2 丹蛭降糖膠囊治療DN核心成分

2.4 蛋白質-蛋白質相互作用網絡構建與核心靶點

采用Cytoscape3.9.1構建丹蛭降糖膠囊治療DN的PPI網絡，網絡包含109個節點，884條邊，平均每個靶點與16個靶點有相互作用，表明靶點之間存在密切聯系，見圖2。利用CytoHubba插件，以介數中心性、緊密中心性、度中心性篩選核心靶點，得到丹蛭降糖膠囊治療DN的核心靶點8個，見表3。

2.5 GO功能與KEGG信號通路富集分析

采用Metascape數據庫對109個交集靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析，得到461個GO條目，其中BP條目262個，多富集在對無機物質的反應、細胞遷移的正調節、對激素的反應等；CC條目85個，主要為膜筏、囊泡腔、轉錄調控復合物等方面；MF條目114個，主要為信號受體激活劑活性、轉錄因子結合、磷酸酶結合等。P值排序前10位的條目見圖3。

圖3 丹蛭降糖膠囊治療DN靶點GO功能富集分析圖

KEGG通路富集分析得到169條信號通路，主要涉及癌癥信號通路（Pathways in cancer）、脂質和動脈粥樣硬化（Lipid and atherosclerosis）、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、胰島素抵抗（insulin resistance）等。前20位通路見圖4。

圖4 丹蛭降糖膠囊治療DN靶點KEGG通路富集分析氣泡圖

2.6 分子對接結果

將5個核心成分與8個核心靶點進行分子對接，結果顯示，木犀草素、山柰酚、槲皮素等成分與核心靶點STAT3、EGFR、AKT1、VEGFA、TP53、JUN、IL6的結合能均小于-5.0 kcal/mol，表明兩者結合活性較優[19]，見圖5。對EGFR與木犀草素、熊果酸分子對接進行可視化，見圖6。木犀草素與EGFR氨基酸殘基MET793、GLN791、SER720形成氫鍵相互作用，與VAL726、LEU718、ALA743、MET790形成疏水相互作用；熊果酸與EGFR氨基酸殘基ASP837、PRO877形成氫鍵相互作用，維持與EGFR穩定構象。

圖5 丹蛭降糖膠囊治療DN核心成分與核心靶點分子對接結合能值熱圖

圖6 EGFR與木犀草素、熊果酸分子對接示意圖

3 討論

丹蛭降糖膠囊中太子參甘溫以補脾肺之氣、止汗生津；生地黃滋肝腎之陰，填骨髓，逐血痹；菟絲子補腎陽益精氣；牡丹皮、水蛭活血散瘀通絡；澤瀉化脂降濁。全方攻補兼施，共奏養陰活血、益氣生津、化瘀通絡之效。研究表明，丹蛭降糖膠囊可改善早期DN微炎癥狀態，降低尿白蛋白排泄率，有效改善DN患者臨床癥狀[20]。

本研究根據介數中心性值篩選的前5位核心成分中，除熊果酸，其余均屬于黃酮類化合物，具有減少炎癥因子生成、抗氧化、促進細胞增殖等生理活性。研究表明，槲皮素可減輕體內氧化應激反應，干預轉化生長因子-β1和Smad7通路，保護腎功能[21]。此外，槲皮素還可恢復線粒體自噬，從而延緩大鼠腎小管上皮細胞衰老和抑制腎間質纖維化[22]。炎癥反應和氧化應激被認為是DN的主要病理生理機制。木犀草素可抑制炎癥因子釋放，如白細胞介素（IL）-1、IL-6和腫瘤壞死因子（TNF）-α，還可抑制活性氧產生[23]。山柰酚可通過增強胰高血糖素樣肽-1和胰島素釋放，延緩腎纖維化[24]。異鼠李素可增加腎組織中的自噬體，抑制自噬基因miRNA調控，改善腎功能[25]。熊果酸屬五環三萜類化合物，具有抗炎抗氧化等作用，可通過Toll樣受體4介導的炎癥途徑，緩解炎癥并抑制糖尿病誘發的腎病[26]。

PPI網絡顯示，丹蛭降糖膠囊可通過多靶點發揮治療DN作用，其中有8個核心靶點與其他靶點聯系最為密切。STAT3是一類攜帶SH2結構域的轉錄因子，可介導細胞對IL等其他炎癥因子的反應。研究表明，腎小球內皮細胞（GECs）中的STAT3可被炎癥介質激活，從而促進炎癥因子釋放，損害GECs功能，促進DN發展[27]。炎癥是DN的主要致病機制。TNF是一種促炎癥介質，可與TNFR1受體結合，激活MAPK3信號通路，介導細胞凋亡并調節DN的炎癥發展[28]。IL-6是一種炎癥細胞因子，可誘使系膜細胞增殖、纖連蛋白表達增加和腎小球內皮細胞通透性改變[29]。AKT1與系膜基質增殖、基底膜增厚、足細胞損傷和腎小管上皮細胞轉化密切相關[30]，槲皮素可能通過影響AKT1抑制足細胞增殖，從而延緩DN進展[31]。TP53是一種細胞周期阻滯的調節因子，MicroRNA-770-5p通過TP53調節的細胞凋亡抑制劑調節足細胞凋亡，從而參與DN發展[32]。EGFR是ErbB家族的受體酪氨酸激酶，被激活后會誘導氧化應激和內質網應激反應，可引起腎臟肥大和纖維化[33]。JUN可通過促進與腎纖維化有關基因表達，加快腎纖維化[34]。DN屬于糖尿病的微血管病變，VEGFA可誘導內皮細胞增殖和遷移，影響腎臟病理血管的生成[35]。以上研究結果顯示，丹蛭降糖膠囊活性成分可能通過調控這些重要靶點，對DN的發展進程產生一定的影響。

GO功能富集結果顯示，丹蛭降糖膠囊在酶結合、細胞外基質、細胞凋亡和增殖及遷移調控等方面有特異作用，表明丹蛭降糖膠囊可通過不同的生物學過程發揮其不同的分子作用治療DN。KEGG通路富集分析顯示，晚期糖基化終末產物（AGEs）能產生持續的氧化應激反應，導致相應的血管組織受損。其與AGEs受體（RAGE）結合并激活AGE-RAGE通路，AGE-RAGE通路在糖尿病介導的血管鈣化中起重要作用，全身抑制RAGE對降低糖尿病并發癥的影響有可能成為今后的研究方向[36]。胰島素抵抗可影響多個器官和胰島素調節途徑。在胰島素抵抗狀態下，AMPK下調導致正常生理調節機制發生紊亂，信號通路相關蛋白調控發生改變，促使IL-6、IL-1、TNF-α等多種炎癥因子釋放，損傷腎臟，破壞腎功能[37]。松弛素是一種肽類激素，已成為一種速效且安全的抗纖維化藥物。有實驗表明，松弛素可通過Wnt/β-catenin信號通路抑制上皮-間充質轉化，保護腎小管上皮細胞功能，從而緩解腎纖維化的過程[38]。

丹蛭降糖膠囊能夠調控以TNF、STAT3、VGEFA、IL6等關鍵靶基因為中心的分子網絡，調節AGE-RAGE信號通路、胰島素、松弛素信號通路等降低腎臟氧化應激反應、抑制腎臟纖維化。這與現有研究[39]相吻合，在一定程度上驗證了預測結果的可靠性。雖然丹蛭降糖膠囊為臨床常用藥物，但對于其相關的藥理機制研究相對較少，因此今后仍需更加全面深入的臨床研究以驗證其作用機制。