基于網絡藥理學探討茯苓-澤瀉藥對治療慢性腎炎的作用機制

譚鈔芳，高常柏

天津中醫藥大學，天津 300000；天津中醫藥大學第二附屬醫院，天津 300150

慢性腎炎是一組源于腎小球的疾病，其病因復雜多樣，病理類型繁多，起病緩慢，病情遷延，是發展為慢性腎衰竭的主要原因[1-2]，臨床常表現為水腫、蛋白尿、血尿、血壓高和腎功能異常等[3]。慢性腎炎發病機制目前仍不清楚，但一般認為與免疫炎癥損傷關系密切。目前，臨床治療慢性腎炎主要以糖皮質激素、免疫抑制劑、血管緊張素轉換酶抑制劑（ACEI）等藥物為主，其中激素與免疫抑制劑不良反應較多，ACEI安全性雖較前兩者高，但單獨使用難以達到滿意療效[4]。研究表明，中藥聯合糖皮質激素治療慢性腎炎較單純西醫治療更具優勢，其臨床療效更顯著，不良反應發生率更低[5]。根據其臨床癥狀，慢性腎炎屬中醫學“水腫”“尿血”范疇?！饵S帝內經》有“風水”“石水”“涌水”之分，并提出“故其本在腎，其末在肺”“諸濕腫滿，皆屬于脾”，認為該病病機與肺、脾、腎三臟關系密切。后張仲景提出“諸有水者，腰以下腫，當利小便，腰以上腫，當發汗乃愈”，為水腫的治療提供了新思路。

茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.) Wolf的干燥菌核，有利水滲濕、健脾寧心之功，利水而不傷正，為利水消腫要藥；澤瀉為澤瀉科植物澤瀉Alismaorientalis(Sam.) Juzep的干燥塊莖，有利小便、泄濕熱之功，可用于治療水腫、淋證等。本研究運用網絡藥理學方法，對茯苓-澤瀉藥對的活性成分及作用靶點進行預測分析，探討其治療慢性腎炎的潛在作用機制。

1 資料與方法

1.1 茯苓-澤瀉藥對活性成分篩選及靶點預測

檢索TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）中茯苓、澤瀉的化學成分，以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為條件，篩選茯苓、澤瀉的活性成分。在TCMSP檢索活性成分的分子結構式，并下載mol2類型文件，將文件導入PharmMapper數據庫，設定“Human Protein Targets Only”，預測茯苓-澤瀉活性成分的作用靶點。根據標準化擬合得分進行排序，選擇得分≥0.9的靶點，刪除重復值，得到作用靶點。運用UniProt數據庫（https://www.uniprot.org）對靶點名稱進行規范。

1.2 茯苓-澤瀉藥對“活性成分-靶點”網絡構建

將中藥、活性成分及靶點信息導入Cytoscape3.8.2軟件，構建茯苓-澤瀉藥對“活性成分-靶點”網絡，并進行網絡拓撲分析，篩選主要活性成分。

1.3 慢性腎炎疾病靶點篩選

以“chronic glomerulonephritis”“chronic nephritis”為關鍵詞，檢索GeneCards（https://www.genecards.org）、OMIM數據庫（https://omim.org），獲得慢性腎炎相關靶點，合并數據并刪除重復值，得到慢性腎炎相關靶點，并利用UniProt數據庫對靶點名稱進行規范。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用網絡構建及關鍵靶點篩選

將藥物活性成分靶點和慢性腎炎相關靶點上傳至Venny2.1在線作圖工具平臺（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），構建韋恩圖，得到藥物與疾病的交集靶點。將交集靶點導入STRING數據庫（https://string-db.org），設置生物種類為“Homo Sapiens”，選擇中等置信度（0.40），獲得蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡。將節點和結合率評分信息導入Cytoscape3.8.2軟件，利用CytoNCA插件進行網絡拓撲分析，以中介中心性、接近中心性、度中心性均大于相應中位數的靶點為茯苓-澤瀉藥對治療慢性腎炎的關鍵靶點。

1.5 生物信息學分析

將關鍵靶點導入DAVID數據庫（https://david.ncifcrf.gov）進行GO功能與KEGG通路富集分析，設定P＜0.05，并利用微生信平臺（https://www.bioinformatics.com.cn）對富集靶點數排名前10位的生物過程（BP）、細胞組成（CC）、分子功能（MF）及前20條KEGG信號通路進行可視化分析。

2 結果

2.1 茯苓-澤瀉藥對活性成分及靶點

檢索TCMSP，獲得茯苓、澤瀉化學成分34、46個，以OB≥30%、DL≥0.18為條件，篩選得到茯苓活性成分15個，澤瀉活性成分10個，見表1。利用PharmMapper數據庫預測得到茯苓-澤瀉活性成分的作用靶點89個。

表1 茯苓-澤瀉藥對活性成分（OB≥30%、DL≥0.18）

2.2 茯苓-澤瀉藥對“活性成分-靶點”網絡

采用Cytoscape3.8.2軟件構建茯苓-澤瀉“活性成分-靶點”網絡，見圖1。網絡包括116個節點（作用靶點89個，活性成分25個，藥物2個）與895條邊。其中，節點面積越大度值越高，涉及的生物功能越多，生物學重要性越高。度值排名前5位的活性成分分別為茯苓新酸A（poricoic acid A）、澤瀉醇C（alisol C）、茯苓新酸B（poricoic acid B）、去氫茯苓酸[7,9(11)-dehydropachymic acid]、23-乙酰澤瀉醇B（alisol acetate B）。

圖1 茯苓-澤瀉藥對“活性成分-靶點”網絡

2.3 慢性腎炎相關靶點及交集靶點獲取

檢索GeneCards、OMIM數據庫，分別得到慢性腎炎靶點1 661、98個，合并后刪除重復靶點，獲得1 240個慢性腎炎相關靶點。采用Venny2.1在線作圖工具對茯苓-澤瀉藥對作用靶點和慢性腎炎疾病靶點取交集，得到藥物與疾病的交集靶點31個。

2.4 蛋白質-蛋白質相互作用網絡構建及關鍵靶點篩選結果

將交集靶點導入STRING數據庫，構建PPI網絡，網絡包括31個節點、268條相互作用線，見圖2。采用Cytoscape3.8.2的CytoNCA插件進行拓撲分析，得到15個關鍵靶點，包括ALB、EGFR、SRC、CASP3、NOS3、F2、ESR1、MAPK14、ANXA5、MAPK1、PPARG、MMP3、MAPK8、KDR、CCNA2，見圖3。

圖2 茯苓-澤瀉治療慢性腎炎靶點PPI網絡

圖3 茯苓-澤瀉治療慢性腎炎關鍵靶點PPI網絡

2.5 關鍵靶點GO功能富集分析

GO功能富集分析得到106個條目（P＜0.05），其中BP條目70個、CC條目15個、MF條目21個。BP主要涉及細胞凋亡的負調節過程（negative regulation of apoptotic process）、學習或記憶（learning or memory）、DNA模板轉錄正調控（positive regulation of transcription,DNA-templated）等；CC包括細胞質（cytoplasm）、膜筏（membrane raft）、細胞核（nucleus）、陷窩（caveola）、細胞外組分（extracellular region）等；MF相關條目有酶結合（enzyme binding）、蛋白磷酸酶結合（protein phosphatase binding）、絲裂原活化蛋白激酶活性（MAP kinase activity）等。篩選出富集靶點數排名前10位的條目，見圖4。

圖4 茯苓-澤瀉治療慢性腎炎靶點GO功能富集分析

2.6 關鍵靶點KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析結果顯示，得到81條信號通路（P＜0.05），主要涉及血管內皮生長因子（VEGF）信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、白細胞介素-17（IL-17）信號通路等。選取富集靶點數排名前20位的信號通路，見圖5。

圖5 茯苓-澤瀉治療慢性腎炎關鍵靶點KEGG通路富集分析氣泡圖

3 討論

本研究對茯苓-澤瀉藥對活性成分及其作用靶點進行分析，結果顯示，茯苓-澤瀉藥對治療慢性腎炎的主要活性成分為茯苓新酸A、澤瀉醇C、茯苓新酸B、去氫茯苓酸及23-乙酰澤瀉醇B。茯苓新酸A、茯苓新酸B及去氫茯苓酸均為三萜類化合物，具有調節免疫、抗炎及抗腫瘤等藥理作用[6]。23-乙酰澤瀉醇B具有良好的利尿、降血脂、降血糖及抗炎等作用，其利尿作用可能與腎末端血管的Na+-Cl-協同轉運蛋白有關[7]。

茯苓-澤瀉治療慢性腎炎的關鍵靶點包括ALB、EGFR、SRC、CASP3等。ALB是血液中最普遍的蛋白質，可結合和運輸不同種類的分子，包括激素、維生素、膽汁酸、陽離子、膽紅素等。研究表明，血清白蛋白超負荷可誘導腎小球中環氧化酶（COX-2）表達，而COX-2是腎臟血流動力學和炎癥的關鍵調節劑[8]。EGFR是在腎臟中表達的膜酪氨酸激酶受體，在腎損傷后被激活[9]。研究發現，EGFR抑制劑可減輕肥胖引起的腎損害，其作用機制可能與降低轉化生長因子β表達，從而抑制腎纖維化，以及緩解血管緊張素2誘導的氧化應激反應和炎癥反應等相關[10]。SRC是一種細胞內非受體酪氨酸激酶，集成了多個細胞外信號輸入，可觸發成纖維細胞的活化和增殖，并使腎小管細胞通過誘導細胞周期停滯獲得促纖維化表型，從而導致腎纖維化[11]。CASP3分子是一類在進化上非常保守的蛋白酶類分子，不僅在微血管內皮凋亡過程中起重要調節作用，還與參與炎癥反應，與腎臟炎性損傷密切相關[12]。

關鍵靶點GO功能富集結果表明，茯苓-澤瀉藥對治療慢性腎炎涉及細胞凋亡的負調節過程、學習或記憶、DNA模板轉錄正調控等生物學過程；分子功能主要富集于酶結合、蛋白磷酸酶結合、絲裂原活化蛋白激酶活性等。細胞凋亡的負調節過程即抑制細胞凋亡，有研究發現，CD36蛋白可介導脂質攝取，進而誘導足細胞凋亡，破壞腎小球濾過膜，導致蛋白尿產生[13]，所以抑制細胞凋亡在延緩腎臟疾病中起重要作用。

KEGG通路主要富集于VEGF信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路等，提示茯苓-澤瀉可能通過這些通路起到治療慢性腎炎的作用。VEGF是內皮細胞的促血管生成和存活因子，在血管生成中起核心作用。研究發現，服用VEGF抑制劑的患者可能會出現腎小球微血管病變，還可能會出現血壓升高，進一步造成腎臟損害[14]，因此，茯苓-澤瀉可能是通過VEGF信號通路改善腎臟功能。Wen等[15]通過動物實驗發現，攜帶巨噬細胞特異性缺失TNF-α小鼠在模型中表現出腎小球和腎小管損傷減少及腎纖維化減輕。此外，還發現使用TNF受體-1抑制劑R-7050可治療腎炎小鼠。表明茯苓-澤瀉可能是通過TNF信號通路減輕腎損傷、抑制腎纖維化及減輕炎癥反應等。

綜上所述，本研究預測茯苓-澤瀉藥對治療慢性腎炎的活性成分、作用靶點及信號通路，推測茯苓澤瀉藥對治療慢性腎炎可能與調節免疫、抗炎、改善腎臟血流等關系密切。但網絡藥理學仍有一定局限性，其結果有待于動物實驗或臨床試驗進一步驗證。