基于網絡藥理學探討散結通脈方化裁方治療動脈粥樣硬化作用機制

邱萌萌 ，李雙娣

1.長春中醫藥大學，吉林 長春 130117；2.長春中醫藥大學附屬醫院，吉林 長春 130021

隨著社會經濟發展加快，工作、生活方式以及飲食結構改變，我國心血管疾病病死率逐年攀升，居各疾病死亡原因之首，占居民疾病病死率40%以上[1]。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是多種心血管疾病共同的病理表現，可繼發心肌缺血、心肌梗死、血栓，血栓脫落會引起急性心血管事件。西醫根據其發病機制有相應的治療方法，但仍存在較多嚴重的不良反應[2-3]，如服用阿司匹林造成出血、痛風，服用他汀類藥物引發肌病、肝腎功能損害、糖代謝異常等，中醫藥治療在減輕西藥不良反應上有一定優勢。

AS屬中醫學“胸痹”“心痛”“心悸”等范疇，《素問·藏氣法時論篇》云：“心病者，胸中痛，脅支滿，胸背肩胛間痛，兩臂內痛?！敝嗅t病因學說認為，痰濁血瘀是AS發生發展過程中重要的病理因素。正所謂“心痹之因……痰凝血滯”（《證因脈治》）“心痹痛者……素有頑痰死血”（《古今醫鑒》）。有研究表明，痰濁與血脂具有一定相似性[4]，痰濁證型與高脂血癥、動脈粥樣硬化緊密相關。痰濁日久阻滯氣機，氣行不暢引起血瘀，痰瘀膠著形成新的病理產物，進一步影響心脈暢通，進而形成惡性循環?！毒霸廊珪分赋觥敖蚰獢?，皆化為痰”，《血證論》指出“血積既久，亦能化為痰水”，痰瘀2種病理產物相互轉化、互為根本的認識由來已久。散結通脈方化裁方是長春中醫藥大學附屬醫院全國首屆名中醫黃永生教授經多年臨床觀察總結而成，方劑由丹參、三七、茵陳、茯苓、澤瀉5味藥物組成，具有利濕化痰、化瘀通絡功效，經過數十年臨床實踐和實驗研究表明，該方具有抗AS作用，在穩定及減小斑塊方面有突出效果[5-6]。

中醫藥在治療過程中，以辨證論治原則為依據，以病因病機為基礎，對病變進行整體治療。這種系統調控的思想，與網絡藥理學研究思路有相似之處。本文基于中藥作用的基本特點，利用網絡藥理學方法，對散結通脈方化裁方治療AS的機制進行預測分析，為散結通脈方化裁方深入開展實驗研究和臨床應用提供依據。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分及靶點獲取

將散結通脈方化裁方中的丹參、三七、茵陳、茯苓、澤瀉中藥名稱分別輸入TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）進行初步篩選，獲得各個藥物的主要成分，并以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為限定條件對所收集到的成分進行篩選。查找成分對應的靶點，建立“散結通脈方化裁方成分-靶點”數據庫。將獲得的相關靶點輸入UniProt（https://www.uniprot.org/）數據庫中，以校正靶點名稱。

1.2 疾病靶點及交集靶點獲取

以“Atherosclerosis”為關鍵詞檢索GeneCards數據庫（https://www.genecards.org/）、OMIM數據庫（https://www.omim.org/）與DrugBank數據庫（https://www.drugbank.ca/），選取靶點與疾病相關性（Score_gda）平均值在0.040 1以上的靶點，以保證研究的準確性。下載后對3個數據庫結果進行合并，去除重復靶點。取藥物靶點與疾病靶點交集映射，繪制韋恩圖（https://www.baidu.com/s?ie=utf-8&tn=88093251_25_hao_pg&word=veen），獲得散結通脈方化裁方治療AS的潛在靶點。

1.3 散結通脈方化裁方治療動脈粥樣硬化“藥物-成分-靶點”網絡構建

使用Excel2010軟件VLOOKUP函數將上述潛在靶點與TCMSP數據庫檢索結果中的活性成分相對應，整理為Network表格，并繪制屬性表格上傳至Cytoscape3.7.2軟件（http://cytoscape.org/）進行可視化分析，構建散結通脈方化裁方治療AS“藥物-成分-靶點”網絡。

1.4 蛋白相互作用網絡構建

將獲取的交集靶點導入STRING在線平臺（https://string-db.org/），設置物種為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為“high confidence（0.400）”，并潛藏游離靶點，其余參數保持默認值，獲取蛋白相互作用（PPI）信息數據列表，保存為TSV格式并構建PPI網絡[7]。再將獲得的相互作用蛋白質基因上傳到Cytoscape3.7.2軟件進行網絡拓撲學分析，將度值（Degree）、中介中心性和緊密中心性均不低于其平均值的靶點作為散結通脈方化裁方治療AS的關鍵靶點，同時構建網絡結構圖。

1.5 GO功能與KEGG通路富集分析

將交集靶點導入在線軟件DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）中，設置物種為“Homo sapiens”，選擇P＜0.05，通過選擇GO Biological Processes、GO Molecular Functions、GO Cellular Components、KEGG Pathway進行GO功能和KEGG通路富集分析。獲得散結通脈方化裁方治療AS的生物過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF）和相關信號通路信息，并繪制富集分析氣泡圖和可視化網絡。

1.6 “藥物-活性成分-靶點-通路”網絡構建

將相互對應的藥物、成分、靶蛋白和通路數據上傳至Cytoscape3.7.2軟件，構建“藥物-活性成分-靶點-通路”網絡。

2 結果

2.1 活性成分及靶點

共得到733個藥物活性成分，去重后得到藥物活性成分85個；對應靶點648個，去重后得到靶點227個。散結通脈方化裁方活性成分及靶點信息見本文OSID碼。

2.2 疾病靶點和交集靶點

對GeneCards、OMIM、DrugBank數據庫收集的疾病靶點進行合并，去除重復靶點，共檢索到AS對應靶點1 439個。運用Venny2.1.0繪圖網站對227個藥物活性成分對應靶點與1 439個疾病相關靶點取交集映射，共得到131個交集靶點。

2.3 散結通脈化裁方治療動脈粥樣硬化“藥物-成分-靶點”網絡

將交集靶點、活性成分、中藥導入Cytoscape3.7.2軟件進行可視化處理，獲得散結通脈化裁方治療AS“藥物-成分-靶點”網絡，見圖1。網絡共有5個中藥節點、85個活性成分節點和131個交集靶點節點。

2.4 蛋白相互作用網絡

將交集靶點結果輸入STRING數據庫，設置Multiple proteins、Homo sapiens構建PPI網絡，見圖2。該網絡包含131個節點和2 571條邊。利用Cytoscape插件CytoHubba的MCC、DMNC、MNC、Degree、EPC、BottleNeck、EcCenTricity、Closeness、Radiality、Betweenness、Stress、Clustering Coefficient12種算法計算，得到散結通脈化裁方治療AS關鍵靶點，見圖3。

圖2 散結通脈方化裁方治療AS交集靶點PPI網絡

圖3 散結通脈方化裁方治療AS關鍵靶點PPI網絡

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析結果

將散結通脈方化裁方治療AS潛在靶點上傳至DAVID數據庫進行GO功能和KEGG通路分析。共得到631條BP富集結果，主要涉及RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控（positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter）、以DNA為模板的轉錄正調控（positive regulation of transcription,DNAtemplated）、基因表達的正調控（positive regulation of gene expression）、對藥物的反應（response to drug）、細胞對缺氧的反應（cellular response to hypoxia）、凋亡過程（apoptotic process）、炎癥反應（inflammatory response）等；得到61條CC富集結果，涉及核質、細胞外間隙、細胞外區、大分子復合物、染色質等；得到104條MF富集結果，涉及蛋白質結合、相同的蛋白質結合、酶結合、轉錄因子活性、序列特異性DNA結合、蛋白質同源二聚活性等。

KEGG富集到癌癥的通路、脂質與動脈粥樣硬化、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、PI3K-Akt信號通路、流體切應力和動脈粥樣硬化等153條信號通路。分別將排名前10位的GO條目和前20位KEGG通路富集結果按P值由小到大排序繪制成柱狀圖及氣泡圖，見圖4、圖5。

圖4 散結通脈方化裁方治療AS靶點GO富集分析

圖5 散結通脈方化裁方治療AS靶點KEGG通路富集分析

2.6 “藥物-活性成分-靶點-通路”網絡

該網絡圖中包括4個藥材節點、67個關鍵成分節點、20個關鍵靶蛋白節點和20條通路節點，共111個節點，見圖6。由網絡圖分析結果可知，有效成分中連接邊數較多的為槲皮素、木犀草素、人參皂苷Rh2、丹參酮ⅡA、隱丹參酮等；潛在靶點連接較多邊數的為PTGS2、AKT1、CASP3、JUN、VEGFA等；通路中糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、癌癥的途徑、IL-17信號通路、脂質與動脈粥樣硬化、流體切應力和動脈粥樣硬化等與潛在靶點有較多連接。

圖6 散結通脈方化裁方治療AS “藥物-活性成分-靶點-通路”網絡

3 討論

黃永生教授認為，痰濁與瘀血相互膠結是AS斑塊形成的主要原因，基于古人對痰瘀相互轉化的認識，黃老提出“瘀能化水”理論，即在AS治療過程中循環使用“化”法（即活血化瘀法）與“清”法（即軟堅化痰、行氣散結法），使血脈內膠結的有形物質由瘀轉化為痰，進而化為水排出體外，以恢復血脈通暢[8]，從而擬定散結通脈化裁方。該方不僅可以穩定AS斑塊，甚至可逆轉AS斑塊，具有較大的研究價值[9]。

本研究共篩選出散結通脈方化裁方活性成分85個，對應靶點227個，治療AS的直接靶點1 439個，相關生物過程631條、細胞組分61條、分子功能104條。通過分析圖1發現，散結通脈方化裁方治療AS的主要成分是槲皮素、木犀草素、人參皂苷Rh2、丹參酮ⅡA、隱丹參酮等。其中槲皮素藥理作用廣泛，具有擴張冠狀動脈、降血脂、抗血小板凝集、抗糖尿病并發癥等多方面作用[10]。另有報道顯示，合成的槲皮素氧乙酸賴氨酸鹽水溶性強，用于治療出血性疾病、循環障礙、AS等具有較好的療效[11]。木犀草素是天然的類黃酮化合物，據報道，其具有抗氧化、抗微生物、抗炎、化學預防、治療、心臟保護、抗糖尿病、神經保護和抗過敏的特性[12]。有研究發現，人參皂苷Rh2可改善高脂大鼠氧化應激與炎癥水平，增加大鼠心肌缺血再灌注后外周血內皮祖細胞數量，從而保護受損心肌[13]。丹參酮ⅡA有保護血管作用，不僅能改善血液流變學及血小板功能[14]，減少動脈粥樣硬化斑塊和血栓生成，降低細胞毒性T細胞、T調節細胞、低密度膽固醇等水平，提高高密度脂蛋白膽固醇水平，減少AS斑塊面積[15]，還可保護心肌細胞。有實驗表明，丹參酮ⅡA可能通過激活Notch1通路改善MI大鼠心臟功能、調控心肌細胞自噬[16]。隱丹參酮可以降低內皮細胞通透性，導致血清促炎介質顯著減少，而不改變血脂譜。Liu等[17]研究發現，通過抑制凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1和基質金屬蛋白酶-9的表達，以及抑制活性氧生成和核因子κB的激活，減小ApoE-/-小鼠AS斑塊面積，降低斑塊脫落的危險性。通過藥理學研究發現，散結通脈方化裁方的主要成分在抗氧化、降脂、抗血小板、抗AS等方面發揮了一定作用。

PPI網絡拓撲學分析顯示，VEGFA、AKT1、STAT3、TNF、IL6等為散結通脈方化裁方治療AS的關鍵靶點。VEGFA在血管生成和內皮細胞生長中發揮重要作用，能誘導內皮細胞增殖、促進細胞遷移、抑制細胞凋亡并誘導血管通透性等[18]。AKT1是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶之一[19]，通過參與多個炎癥、免疫、代謝和細胞增殖相關的信號通路對相關生物學過程進行調節。STAT3是炎癥反應的調節因子，通過活化T細胞、促進B細胞增殖和分泌抗體、激活巨噬細胞等參與免疫、炎癥的調節。TNF不僅可調節免疫功能，而且可作用于血管內皮細胞，損傷內皮細胞導致血管功能紊亂，使血管損傷和血栓形成[20]。IL6是一種炎癥性細胞因子，在炎癥反應、血栓形成、調節血管壁細胞增殖和促細胞凋亡中發揮作用，對心肌收縮功能和中性粒細胞黏附有直接影響，與缺血再灌注導致的心肌細胞損傷密切相關[21-22]。同時也是脂質代謝平衡的關鍵調節器[23]。

通路富集分析顯示，散結通脈方化裁方可能通過干預糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、癌癥的途徑、IL-17信號通路、脂質與動脈粥樣硬化、流體切應力和動脈粥樣硬化等多條通路治療AS。前期實驗研究表明，散結通脈方化裁方不僅改善血清炎癥因子及血脂水平，還可逆轉和消退AS斑塊[9]。

綜上所述，散結通脈方化裁方可能通過槲皮素、木犀草素、人參皂苷Rh2、丹參酮ⅡA、隱丹參酮等作用于PTGS2、AKT1、VEGFA、STAT3、TNF等靶點，涉及糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、癌癥的途徑、IL-17信號通路、脂質與AS、流體切應力和AS等通路。本研究表明，散結通脈方化裁方治療AS有多成分、多靶點、多通路的特點。但網絡藥理學的結果僅提示散結通脈方化裁方與AS的相關性，故在進行通路富集后，仍需進行實驗來驗證通路上下游關鍵蛋白的表達水平，為后續深入研究AS的機制和中醫藥治療手段提供參考。