響應面耦合遺傳算法優化超聲輔助酶法提取紅棗多酚工藝

李哲斌

（商丘職業技術學院 食品工程學院，河南商丘 476100）

0 引言

紅棗是棗屬植物棗樹（Ziziphus jujuba Mill.）的成熟果實，已有4 000 多年的種植歷史。紅棗具有多種活性成分如多糖、多酚、膳食纖維和三萜酸等。紅棗多酚（Polyphenols from Jujube，PPJ）作為紅棗中主要的活性組分［1］，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎和保護心腦血管等功效［2］。因此，關于PPJ 的研究越來越受到學者們的廣泛關注。

利用高效環保的工藝提取活性成分是當前研究的熱點。目前，紅棗中活性成分的提取分離主要依靠傳統工藝，如溶劑提取，該技術存在提取周期長、污染嚴重等諸多弊端［3］，很難滿足當前紅棗加工行業可持續發展的需求。超聲輔助技術是一種新型的綠色提取技術，基于超聲波的空化效應、機械效應和熱效應，能夠有效地促進植物細胞壁的破壞，加速活性成分的擴散，提升活性成分得率［4-5］。該項技術已經在植物多酚、黃酮和多糖等活性成分提取中得到廣泛的應用［6-8］。細胞壁中絕大多數成分是纖維素和果膠，纖維素酶和果膠酶處理植物細胞壁，可以使植物細胞壁破裂降解，顯著加速細胞中的活性成分由內向外擴散，提高活性成分的提取效率。然而，超聲輔助酶法提取工藝在PPJ 提取領域未見報道。除提取技術外，PPJ 提取率還取決于許多其他因素（溶劑性質、溫度、時間和超聲強度等）。因此，優化PPJ 的提取工藝是提高PPJ 的提取效率，加速紅棗產業發展的關鍵。響應面法（Response Surface Method，RSM）是一種重要的數學統計工具，常被應用于優化活性物質的提取工藝，但RSM 的缺陷在于對試驗點的選擇有很高的要求。將RSM 與遺傳算法（Genetic Algorithm，GA）結合，即響應面耦合遺傳算法（Response Surface Method Coupled Genetic Algorithm，RSMCGA），能在優化提取工藝方面取得較好的預測值和試驗優化效果。

因此，本文采用超聲輔助酶法提取技術對PPJ 進行提取，探究超聲功率、提取溫度、乙醇濃度、果膠酶劑量和時間對PPJ 提取率的影響，并利用RSM 耦合GA 優化PPJ 的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅棗產自新疆和田；沒食子酸購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙醇、石油醚、碳酸鈉、福林酚試劑購于重慶川東化工（集團）有限公司。

1.2 儀器與設備

Scientz-T 型超聲波提取機（寧波新芝生物）；FD-1A-50 型真空冷凍干燥機（江蘇天翎儀器）；DF-8 型真空抽濾機（上海保玲儀器）；TGL-16.5M 型臺式高速冷凍離心機（上海盧湘儀）；DK-98-II 型電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器）；UV1800 型準雙光束紫外/可見分光光度計（上海讓奇儀器）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

將新鮮的紅棗清凈后剔除棗核，切成均勻的小塊，放在60 ℃烘干機中干燥，以除去多余水分；然后將干燥的紅棗塊用粉碎機粉碎，過40 目篩，將獲得的紅棗粉末置于自封袋中密封，在4 ℃環境下保存備用。

1.3.2 超聲輔助酶法提取PPJ

準確稱取5.0 g 紅棗粉末，添加到具塞燒瓶中，按照料液比1：30 g/mL 加入不同濃度的乙醇，與樣品充分混合；然后再按照不同劑量加入果膠酶，用超聲波提取儀處理混合體系并完成提取過程，于7 000 r/min 轉速下離心作用15 min。抽濾后獲得濾液，并在旋轉蒸發儀中對濾液進行濃縮，溫度控制在40 ℃，濃縮液凍干后得到PPJ 粉末。

1.3.3 PPJ 提取率測定

參考HUANG 等［9］的測定方法，計算不同提取條件下PPJ 的提取率。取1 mL 提取所得PPJ于25 mL 具塞試管中，分別加入2 mL 10%福林酚試劑和10 mL 10%碳酸鈉溶液，加入純水定容到25 mL，混合均勻；然后置于50 ℃水浴鍋中避光反應1 h，以蒸餾水作對照，在波長為766 nm 處測定樣品吸光值，并通過下式計算PPJ 的提取率（β）：

式中 C——PPJ 濃度，g/mL；

V——PPJ 體積，mL；

m——干燥的紅棗固體粉末重量，g。

1.3.4 單因素試驗

選擇超聲輔助酶法作為提取PPJ 的方法，在超聲功率、提取溫度、乙醇濃度、果膠酶劑量和提取時間5 個因素條件下開展單因素試驗，討論各個試驗因素對樣品多酚提取率的影響。超聲功率分別為100，200，300*，400，500 W；提取溫度分別為30，35，40*，45，50 ℃；乙醇濃度分別為40%，50%，60%*，70%，80%；果膠酶劑量分別為0.10%，0.15%，0.20%*，0.25%，0.30%；提取時間分別為10，20，30*，40，50 min。其中“*”代表在研究其他試驗因素對PPJ 提取率影響時，保持不變的試驗因素。

1.3.5 響應面法試驗

基于單因素試驗結果，以超聲功率（α1）、提取溫度（α2）、乙醇濃度（α3）和果膠酶劑量（α4）為自變量，以β為響應值。根據響應面試驗原理設計并開展組合試驗。

利用響應面分析法得到二次回歸模型，如下式所示：

式中 b0，bi——分別為截距、線性回歸系數；

bii，bij——分別為二次項、交互項的回歸系數；

αi，αj——自變量。

1.3.6 遺傳算法設計遺傳算法依據達爾文進化論演變而來，具有全局尋優的功能，可以經過無數次迭代逼近最優結果，適用于優化不同參數下獲得目標成分的最大提取率［10］；可以避免試驗因素水平選擇不當，得不到理想的優化結果。具體優化參數程序：根據單因素試驗所得的結果，設置α1，α2，α3，α4試驗因素作為決策變量，即：

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選擇各試驗因素水平的取值范圍，PPJ 提取率最佳的約束條件：200 W ≤α1≤400 W；30 ℃≤α2≤40 ℃；50%≤α3≤70%；0.15%≤α4≤0.25%。

1.4 數據處理

每組試驗重復3 次，以平均值±標準差（mean±SD）來表示試驗結果；采用SPSS8.0 軟件對每組試驗數據進行方差分析和試驗結果的顯著性差異分析；利用Origin9.0 軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素對PPJ 提取率的影響

各因素對PPJ 提取率的影響見圖1。當α1在100～300 W 時，隨著α1的增加，PPJ 提取率顯著提升（P＜0.05）。當α1為300 W 時，PPJ 提取率達到最大值（0.66%±0.005%）。主要原因在于α1的增加會增強超聲空化效應，PPJ 易由內向外擴散，能夠有效促進PPJ 的提?。?1］。當α1＞300 W 時，α1的增加會顯著降低PPJ 提取率（P＜0.05）。歸因在較大的α1條件下，PPJ 的化學結構可能會被破壞，并且雜質溶解較多，導致PPJ提取率下降［12］。這與曹艷華等［13］研究超聲提取洋蔥多酚結果類似。因此，后續試驗在α1為200，300，400 W 下進行。

圖1 不同試驗因素對PPJ 提取率的影響Fig.1 Effect of different experimental factors on jujube polyphenol extraction rate

隨著α2的升高，PPJ 提取率先顯著增加后顯著降低（P＜0.05），當α2為40 ℃時，PPJ 提取率達到最高值（0.69%±0.004%）。其原因是隨著α2的升高，一方面增加PPJ 在溶劑中的溶解度，降低傳質阻力，促進PPJ 的擴散；另一方面有利于提高果膠酶催化活力，加速植物細胞壁的破壞，促進多酚從細胞內溶出，提高多酚提取率［14］。但當α2過高時，可能降低果膠酶活性甚至使其完全失活，還可能破壞多酚結構，從而降低PPJ 的提取率［15］。因此，后續試驗在α2為30，35，40 ℃下進行。

隨著α3的增加，PPJ 的提取率先顯著增加后顯著降低（P＜0.05），當α3為60%時，PPJ 提取率取得最大值（0.68%±0.008%）。其原因是當α3為60%時，PPJ 極性與乙醇極性相似，此時PPJ 溶解性最強，能夠達到最大的提取率［16］。當α3超過60%，高濃度的乙醇會促使其他醇溶性雜質或色素等被溶進反應體系。此外，α3越高，越容易破壞細胞膜的完整性，阻礙PPJ 的溶出，導致PPJ提取率下降［17］。因此，后續試驗在α3為50%，60%，70%下進行。

當α4在0.10%～0.15%時，PPJ 提取率隨α4增加顯著增加（P＜0.05）。其原因是隨著α4增加，果膠酶催化能力增強，使植物細胞壁發生降解，有利于PPJ 的擴散，使PPJ 的提取率提升［18］。但當α4超過0.15%時，隨著α4的增加，PPJ 提取率顯著降低（P＜0.05）。該結果與TAN 等［19］采用超聲輔助酶法提取葡萄皮花色苷結果一致。因此，后續試驗在α4為0.15%，0.20%，0.25%下進行。

當α5在10～30 min 時，PPJ 提取率隨α5延長顯著增加（P＜0.05）。這是由于在提取的初期，空化效應會誘導細胞內多酚逐漸向外擴散，使得PPJ 提取率不斷提高［20］。但當α5超過30 min 時，由于細胞內大多數PPJ 已經溶出，再延長時間對PPJ 提取率的變化無顯著影響（P＜0.05）。因此，后續試驗將α5設置為30 min。

2.2 響應曲面法試驗結果

2.2.1 模型建立與顯著性檢驗

表1 響應曲面法試驗設計及結果Tab.1 Experimental design and results of response surface method

對回歸方程系數進行顯著性檢驗，其結果見表2。由表2 可知，回歸系數R2=0.890 7，F=8.15，P=0.000 2。由于失擬項P=0.374 6＞0.05，說明模型的失擬項不顯著，表明通過RSM 方法建立的數學模型能夠較好地擬合試驗數據。

表2 PPJ 工藝優化回歸模型系數的顯著性檢驗報告Tab.2 Significance test report of regression model coefficient of jujube polyphenol process optimization

F 值是判斷試驗因素對響應值影響是否顯著的有利工具。F（α1）=11.39，F（α2）=0.030，F（α3）=20.95，F（α4）=7.475×10-3，即各試驗因素對PPJ提取率的影響順序為α3＞α1＞α2＞α4。

對RSM 模型進行充分性檢驗。由圖2（a）可知，試驗得到的PPJ 提取率的真實值與預測值基本一致。說明RSM 模型可以用來測算各提取工藝條件下的PPJ 提取率。圖2（b）顯示，PPJ 提取率均滿足正態分布，且未出現偏離方差。由圖2（c）可看出，各個試驗點的學生化外殘差范圍均控制在±3 范圍內。圖2（d）顯示，簡化多項式模型的Cook’s 距離均分布在1.0 以內。充分性檢驗可以進一步驗證采用GA 法優化超聲輔助酶法提取PPJ 的可行性。

圖2 RSM 模型充分性檢驗圖Fig.2 RSM model adequacy test diagram

2.2.2 交互項分析

各因素交互作用的響應面和等高線圖如圖3所示。結合圖3 和表2 的結果可知，α1α2，α1α3，α1α4，α2α4，α3α4的兩兩交互作用均對β無明顯影響（P＞0.05），故不進行深入分析。由圖3（a）可知，β存在極值點；圖3（b）的等高線圖呈橢圓形，表明α2α3的交互作用會顯著影響β（P＞0.05）。由此可知，各因素對β的影響順序為α3＞α1＞α2＞α4，與方差分析的結果相符。

圖3 各試驗因素交互作用的響應面和等高線Fig.3 Response surface and contour plots of interaction of experimental factors

2.2.3 PPJ 提取工藝參數優化

利用Matlab R2018b 軟件中的GA 優化工具箱分析優化試驗數據，迭代143 次，PPJ 提取率達到最高值，此時α1，α2，α3，α4水平編碼分別為1，-1，1，-1，對應的試驗水平分別為400 W，30 ℃，70%，0.15%，在此條件下，所得β的理論值為0.94%。

2.2.4 試驗驗證

為驗證GA 法的可靠性，在以上試驗所得到的各試驗因素水平上進行3 次重復試驗，所得PPJ 提取率為0.90%±0.01%，試驗數值和理論數值之間的相對誤差為4.26%。說明GA 可較好地測算PPJ 提取率，同時也證明采用RSMCGA 優化PPJ 提取的技術工藝可行。

3 結語

本文通過RSMCGA 優化超聲輔助酶法提取PPJ 工藝，在超聲功率為400 W，提取溫度為30 ℃，乙醇濃度為70%，果膠酶劑量為0.15%，提取時間為30 min 的工藝參數條件下，具有最佳的提取效果，PPJ 的提取率達到0.90%±0.01%。表明RSMCGA 可較好地測算PPJ 提取率，通過RSMCGA 優化PPJ 的提取工藝參數可行。研究結果將會為PPJ 的提取和相關產品的開發提供一種綠色高效的解決方案。