LBD12轉錄因子調控毛果楊木材形成研究

高 源,孫佳彤,周晨光,姜立泉,李 偉,李 爽*

(1.林木遺傳育種全國重點實驗室(東北林業大學),黑龍江 哈爾濱 150040;2.遼寧省森林經營研究所,遼寧 丹東 118000)

木材是重要的工業生產原料,是制漿造紙、房屋建造以及家具制造的關鍵原材料。因此,對木材的研究以及獲取具有優良木材的良種刻不容緩。木材的形成是一個連續且復雜的過程,包括維管形成層分裂分化、次生細胞壁加厚、細胞壁木質化、細胞程序化死亡,最后形成木材[1-2]。

轉錄因子(transcription factor, TF),是調節植物生長發育的特殊結構蛋白,在植物生長過程中的各個生物進程均發揮重要的調控作用[3-5]。木材的形成離不開轉錄因子的精確調控,不同轉錄因子之間相互作用構成木材形成過程中復雜的轉錄調控網絡[6-15]。已有研究報道,一些轉錄因子家族在次生細胞壁形成的過程中起關鍵的調控作用,如NAC、MYB、WRKY、bHLH、LBD轉錄因子家族等[16-21]。毛果楊(Populustrichocarpa)NAC家族PtrSND1轉錄因子可直接調控MYB家族轉錄因子PtrMYB074,進而影響木材的形成[6, 8]。最新的研究結果表明,PtrMYB074轉錄因子可以與PtrWRKY19轉錄因子互作,并被其招募到下游PtrbHLH186啟動子上,促進PtrbHLH186的表達[21]。在毛果楊中PtrbHLH186基因過表達后,植株出現木材形成異常,具體表現為植株生長遲緩、木質部導管細胞小而多、木質化程度提高、木質素含量增加等[21]。以上結果表明,毛果楊PtrbHLH186轉錄因子作為木材形成NAC、MYB家族轉錄因子的下游因子,在木材形成過程中同樣發揮著重要的調控作用,是木材形成的關鍵調控因子之一,但是其調控的下游基因及其生物功能研究尚不明確。

LBD(lateral organ boundaries domain)是植物特有的轉錄因子家族,具有高度保守的LOB(lateral organ domain)結構域[22]。有研究表明,在調控木質部分化關鍵調節因子NAC-Domain7(VND7)介導的木材形成途徑中,也有該家族轉錄因子AtLBD30的參與[23]。毛白楊(P.tomentosa)中,PtaLBD1過量表達使轉基因植株次生韌皮部增厚;此外,PtaLBD4在次生韌皮部特異表達,PtaLBD15、PtaLBD18在次生木質部特異表達[24]。說明毛白楊LBD家族轉錄因子參與木材形成的調控過程。毛果楊中,PtrLBD39在應拉木中轉錄水平最高,PtrLBD39及其同源基因PtrLBD22功能缺失突變體的應拉木形成區域明顯減少,木質素的含量增多且纖維素含量減少,表明PtrLBD39和PtrLBD22是應拉木形成的關鍵調節因子[25]。目前,在多種植物尤其是擬南芥(Arabidopsisthaliana)中都有關于LBD轉錄因子的研究,但仍有大量LBD的功能是未知的[26]。

東北林業大學林木遺傳育種全國重點實驗室研究團隊前期獲得了木材形成關鍵調控基因PtrbHLH186的過表達植株,收集其木質部材料進行了RNA-seq和ChIP-seq分析,篩選出了PtrbHLH186調控的下游轉錄因子PtrLBD12。但PtrLBD12是否參與木材形成的調控過程以及在木材形成過程中的生物學功能尚不清楚。因此,本研究創制了毛果楊PtrLBD12過表達植株,對其生長及木材形成特征進行了觀察分析,初步揭示該基因在木材形成過程中的功能。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗材料為東北林業大學林木遺傳育種全國重點實驗室保存的毛果楊植株,基因型為Nisqually-1。用次氯酸鈉對野生型毛果楊側枝進行消毒,經植物組織培養進行芽誘導,獲得無菌毛果楊組培苗[27]。組織培養條件:溫度25 ℃,光強約40 μmol/(m2·s),光周期為16 h光照/8 h黑暗。溫室培養條件:溫度范圍22～25 ℃,光量子強度約300 μmol/(m2·s),光周期為16 h光照/8 h黑暗。

1.2 毛果楊PtrLBD12基因的克隆與分析

毛果楊PtrLBD12基因的克隆。利用PtrLBD12基因序列號在毛果楊基因組網站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中獲取該基因完整的序列信息。設計該基因特異性引物(表1),利用PCR擴增目的片段并連接到pENTR/TOPO載體上,測序驗證PtrLBD12序列。

表1 所用引物及序列

毛果楊PtrLBD12基因特異性表達分析。用于基因組織特異性表達分析的數據來源于Yeh等[15]發表的數據信息。

1.3 毛果楊PtrLBD12瞬時表達載體構建及亞細胞定位

毛果楊PtrLBD12基因瞬時表達載體的構建。以pENTR/TOPO-PtrLBD12質粒為模板,進行目的片段的擴增和回收。利用XbaI和XhoI酶切目的基因和pUC19-35S-GFP瞬時表達載體,37 ℃水浴2 h。通過凝膠電泳驗證酶切產物正確后,回收進行T4連接,轉化大腸桿菌并測序。獲得的載體利用氯化銫-溴化乙錠超高速梯度密度離心法提取質粒。

亞細胞定位。本研究毛果楊木質部原生質體的酶解和轉化方法參照Lin等[28]建立的原生質體瞬時轉化體系。取4段8～9 cm毛果楊野生型莖段,扒皮后放入酶解液中室溫靜置酶解3 h。通過MMG溶液(0.5 mol/L甘露醇,4 mmol/L MES, 15 mmol/L氯化鎂)釋放并收集原生質體,稀釋至2×105個細胞/mL。以1∶10∶11(體積比)比例依次加入pUC19-35S-PtrLBD12-GFP質粒及細胞核定位質粒pUC19-35S-H2A-mCherry、原生質體、聚乙二醇(PEG)溶液,混勻后靜置10 min。終止反應后重懸,移入細胞培養板避光過夜培養,利用激光共聚焦顯微鏡觀察結果。

1.4 毛果楊PtrLBD12基因過表達植株創制

毛果楊PtrLBD12基因過表達載體構建。帶有BamHI和SacI酶切位點的PtrLBD12CDS序列構建到35S啟動子介導的植物表達載體pBI121上,特異性引物序列見表1,方法同上述載體構建方法。利用35S-F引物和pBI121-LBD12-R引物進行檢測并測序(表1),即得pBI121-35S-PtrLBD12載體。

通過農桿菌介導的毛果楊遺傳轉化創制PtrLBD12過量表達轉基因植株。將測序正確的pBI121-35S-PtrLBD12質粒轉入農桿菌感受態GV3101中。選用35S-F和基因R端引物進行單克隆的檢測,挑取檢測正確克隆搖菌保存。毛果楊的遺傳轉化過程參照已經建立的方法[8, 21, 27]。

DNA水平鑒定毛果楊PtrLBD12過表達植株。以抗性植株葉片DNA為模板,分別以載體pBI121引物35S-F及PtrLBD12基因R端引物進行PCR擴增,選擇毛果楊野生型植株DNA、水和pBI121-35S-PtrLBD12質粒作為對照進行凝膠電泳分析。

RNA水平鑒定毛果楊PtrLBD12過表達植株。收集轉基因和野生型植株木質部,提取RNA并反轉錄,以毛果楊PtrActin7基因作為內參,定量PCR分析PtrLBD12在轉基因植株中的表達水平。

1.5 毛果楊PtrLBD12轉錄因子的功能分析

PtrLBD12過表達毛果楊植株生長指標的測定。將組培瓶中生長至5～8 cm高的OE-PtrLBD12-L1轉基因植株和同齡的野生型毛果楊植株移栽到溫室中,觀察PtrLBD12轉基因植株的表型。對生長30、60、90 d的野生型以及PtrLBD12轉基因植株進行拍照,測定12株野生型及PtrLBD12轉基因植株的生長指標,包括樹高、地徑、莖節數以及第8莖節長度,共3次生物學重復,通過SPSS統計分析PtrLBD12轉基因植株的生長指標。

通過石蠟切片觀察PtrLBD12過表達植株莖干細胞。選取同齡轉基因及野生型溫室植株第2、4、6、8莖節的中間區域,將每個莖段切成厚度為0.8～1.0 cm小段,放入預冷的固定液西林瓶中。置于冰上真空固定,并進行脫水、透明、浸蠟,浸蠟后包埋莖段并切片,利用番紅、固綠和甲苯胺藍水溶液染色,染色后用樹脂封片,使用軟件萊卡LAS V4.8和LAS X V2.0對組織染色后的石蠟切片橫切面進行圖像采集并統計分析,隨機取3個野生型和轉基因植株的第8莖節的橫切面,每個橫切面隨機選3個等比例的區域,統計單位面積(mm2)導管、纖維細胞的數量及導管細胞平均孔徑大小(μm2)。

木質素單體合成酶基因表達水平分析。提取培養4個月的毛果楊野生型及PtrLBD12過表達植株的木質部總RNA,反轉錄成cDNA,設計木質素單體合成酶基因的特異性定量引物(表2),通過定量PCR及2△△Ct計算法分析PtrLBD12基因的過表達植株中木質素單體合成酶基因的表達情況。

表2 木質素單體合成酶基因定量引物序列

2 結果與分析

2.1 PtrLBD12基因的獲得

前期研究中獲得了毛果楊木材形成關鍵調控基因PtrbHLH186過表達植株的木質部組織RNA-seq以及ChIP-seq數據,通過對RNA-seq以及ChIP-seq數據的整合分析,篩選出了PtrbHLH186結合并調控的下游轉錄因子PtrLBD12。

利用毛果楊木質部、韌皮部、頂芽和葉片不同組織對PtrLBD12基因的表達模式進行分析,結果顯示PtrLBD12基因在木質部和韌皮部中表達明顯高于其他組織(圖1)。推測PtrLBD12轉錄因子在木質部和韌皮部中發揮一定的調控作用,參與木材形成過程的調控。為了進一步分析其功能,本研究通過基因克隆和測序驗證,獲得了PtrLBD12基因894 bp的CDS序列。

誤差線代表3個生物學重復的SE值。Error bars represent SE values of three independent experiments. *.P<0.05. 圖1 PtrLBD12基因在毛果楊4種組織中的表達水平Fig. 1 The transcript abundance of PtrLBD12 in four tissues of Populus trichocarpa

2.2 毛果楊PtrLBD12的亞細胞定位

為了進一步揭示PtrLBD12蛋白的表達特征,將PtrLBD12融合綠色熒光蛋白(GFP)構建到由組成型啟動子35S驅動的瞬時表達載體pUC19上,獲得pUC19-35S-PtrLBD12-GFP載體。選用融合櫻桃紅熒光蛋白(mCherry)的組蛋白H2A作為細胞核定位標記蛋白。提取質粒后,通過PEG介導的毛果楊木質部原生質體瞬時轉化法[28],將pUC19-35S-PtrLBD12-GFP和pUC19-35S-H2A-mCherry共同轉入原生質體中。結果顯示,代表PtrLBD12蛋白的綠色熒光信號與組蛋白H2A-mCherry紅色熒光信號完全重合。說明毛果楊PtrLBD12轉錄因子在細胞核中表達,具有轉錄因子的一般特征(圖2)。

圖2 毛果楊PtrLBD12亞細胞定位Fig. 2 Subcellular localization of PtrLBD12 in P. trichocarpa

2.3 毛果楊PtrLBD12過表達植株的創制

毛果楊PtrLBD12過表達植株見圖3。其過程為將PtrLBD12基因的CDS序列連接到35S啟動子介導的pBI121植物表達載體中,成功獲得植物表達載體pBI121-35S-PtrLBD12。將pBI121-35S-PtrLBD12載體轉入農桿菌感受態GV3101中,通過農桿菌介導的毛果楊遺傳轉化方法創制轉基因植株。將侵染并共培養后的外植體使用頭孢霉素溶液和清水清洗脫去農桿菌(圖3a),置于含抗生素的選擇培養基上培養1個月左右誘導抗性芽的發生(圖3b),將莖段兩端生長出的抗性芽放入抗性生根培養基進行初步篩選。將可在抗性培養基中生根的抗性芽再次移入新的抗性生根培養基中,2次生根后進行后續的DNA和RNA水平鑒定(圖3c)。提取抗性植株葉片的DNA,以載體引物35S-F和PtrLBD12的R端引物PCR擴增,凝膠電泳檢測。結果表明以抗性植株葉片DNA為模板的樣品擴增出與pBI121-35S-PtrLBD12質粒為模板大小一致的目的條帶,而以水及野生型葉片為模板的陰性對照泳道無條帶,表明PtrLBD12基因已成功整合到抗性植株的基因組中(圖3d)。分別收集轉基因和野生型毛果楊溫室植株的木質部,提取總RNA并反轉錄獲得cDNA,通過相對定量在轉錄水平上分析PtrLBD12基因在轉基因植株中的表達水平。與野生型相比,OE-PtrLBD12-L1的相對表達量為40.91,L2為79.51,L3為102.19,表明這些轉基因植株中PtrLBD12基因的表達水平均明顯上調(圖3e)。

a.愈傷組織分化誘導callus induction;b. 抗性芽誘導shoot induction;c. 抗性植株篩選the screening of the kanamycin-resistant plants;d. 轉基因植株的PCR鑒定identification of transgenic plants by PCR(M. DNA marker DL2000;1. ddH2O為模板的陰性對照 negative control with ddH2O as PCR template;2. PBI121-35S-PtrLBD12質粒為模板的陽性對照positive control with plasmid PBI121-35S-PtrLBD12 as PCR template;3. 野生型毛果楊葉片DNA為模板的陰性對照negative control with leaf DNA of wild-type plant as PCR template;4—6. 抗性植株葉片DNA為模板的樣品sample with leaf DNA of kanamycin-resistant plant as PCR template);e. 過量表達植株中PtrLBD12基因的相對表達水平relative expression levels of PtrLBD12 gene in overexpression plants。*.P<0.05,**.P<0.01。下同。The same below.圖3 毛果楊轉基因植株的獲得Fig. 3 Generation of P. trichocarpa transgenic plant

2.4 毛果楊PtrLBD12轉錄因子的功能分析

為了初步了解PtrLBD12轉錄因子的生物學功能,對已獲得的過表達PtrLBD12-L1植株和野生型對照同時移栽到溫室中,觀察其生長情況。對生長至30、60、90 d的植株生長指標進行測定。與野生型毛果楊相比,PtrLBD12過表達植株高度較矮(圖4a、4b),植株地徑、莖節數、第8莖節長度均明顯降低(圖4b)。說明PtrLBD12基因過表達影響了毛果楊的正常生長發育。

a. 生長30、60、90 d的毛果楊野生型與PtrLBD12過表達植株的表型觀察 phenotypic observations of P. trichocarpa wild-type and PtrLBD12 overexpression plants at 30, 60 and 90 days;b. 不同生長時期的毛果楊野生型與過表達PtrLBD12植株的生長指標測定 growth indicators determination of wild-type and PtrLBD12 overexpression plants at different growth periods。圖4 毛果楊野生型和過量表達植株生長表型分析Fig. 4 Growth phenotype analysis of P. trichocarpa wild-type and OE-PtrLBD12 plants

為了進一步分析PtrLBD12轉錄因子是否影響木材形成過程,對溫室培養4個月的過表達和野生型植株的第2、4、6、8莖節進行石蠟切片,利用番紅固綠對染法對莖干橫切面進行染色觀察(圖5a)。木質部細胞壁中的木質素在番紅染料的染色下呈現紫紅色,纖維素在固綠染料的染色下呈現藍綠色,且染色深淺與木質素、纖維素含量成正相關。切片分析發現,毛果楊中PtrLBD12過表達后,第2莖節開始出現少量的導管細胞,未分化出纖維細胞,而野生型植株的第2莖節并未出現導管和纖維細胞;轉基因植株第4莖節分化出4～5層均勻排列的導管細胞,而野生型則剛開始分化出1～2層導管細胞;轉基因植株第6莖節出現明顯的纖維細胞,而野生型僅有少量纖維細胞出現,且轉基因植株紫紅色的木質化區域明顯寬于野生型,PtrLBD12過表達植株莖干木質化程度增強;轉基因植株第8莖節導管細胞和纖維細胞均發育完全,與野生型無明顯差異。通過對染料著色程度的對比觀察發現,轉基因植株第6和8莖節中紅色著色明顯比野生型植株深,說明PtrLBD12過表達后木質素沉積被增強。

a. 培養4個月的毛果楊野生型(WT)與(OE-PtrLBD12-L1)過表達植株番紅固綠染色(紅色線條代表木質部寬度,比例尺為100 μm) stem cross sections and magnified images of 4-month old OE-PtrLBD12-L1 and wild-type plants (The cross sections were stained with safranin O and fast green, the red lines represent the width of the xylem, bar is 100 μm);b. 野生型(WT)和過表達(OE-PtrLBD12-L1)毛果楊各莖節形成層細胞形態觀察(比例尺為50 μm) morphological observation of cambium cells in WT and OE-PtrLBD12-L1(Bar is 50 μm);c. 野生型和過表達植株導管和纖維細胞數量統計(黑色點所示部分為導管細胞,比例尺為50 μm) statistics on the number of vessel and fiber cells in wild and overexpressed plants (The part shown in the black dots are vessel cells, bar is 50 μm);d. 單位面積細胞數目統計 statistics analysis of cell number in per unit area;e. 導管孔徑大小統計 statistics analysis of vessel lumen area。圖5 毛果楊野生型與OE-PtrLBD12過表達植株組織切片表型觀察Fig. 5 Paraffin section observation of WT and OE-PtrLBD 12plants

為了方便清晰地觀察轉基因植株形成層及木質部細胞形態結構,用甲苯胺藍水溶液對OE-PtrLBD1過表達和野生型植株的第2、4、6、8莖節進行染色,觀察各莖節形成層細胞狀態(圖5b)。結果顯示,PtrLBD12過表達植株的形成層細胞的形態結構與野生型植株并沒有顯著變化。進一步對莖干橫截面單位面積內導管細胞和纖維細胞數量、單個導管細胞的孔徑大小進行了統計分析(圖5c),結果顯示,過表達植株莖干橫切面單位面積內導管和纖維細胞數量顯著增加(圖5d),導管孔徑明顯減小(圖5e)。這個結果表明,PtrLBD12基因的過表達影響了木質部中導管和纖維細胞的數量及導管細胞孔徑的大小。

由于木材形成過程中,木質素沉積的早晚及強弱直接影響木質部細胞的形態結構,且根據切片結果得知,PtrLBD12基因的過量表達造成了木質部細胞木質素沉積模式發生改變。而毛果楊木質素的生物合成依賴于22個木質素單體合成相關酶基因的表達[29]。因此,本研究利用RT-qPCR檢測了PtrLBD12過表達植株木質部中22個木質素單體合成酶基因的相對表達水平(圖6)。結果顯示,PtrLBD12過表達使植株木質部中PtrPAL1、PtrHCT6、PtrCSE2、PtrCCoAOMT1、PtrCCoAOMT2、PtrCCoAOMT3、PtrCCR2、PtrCAld5H1的表達水平顯著或極顯著升高,PtrC4H1、PtrC4H2、PtrCSE1基因的表達水平也有上調趨勢。因此,PtrLBD12可以促進木質素合成酶基因的上調表達,增加植株木質素的沉積。

圖6 PtrLBD12過表達植株中木質素單體合成酶基因的相對表達水平Fig. 6 The relative expression levels of monolignol genes in OE-PtrLBD12 plants

3 討 論

木材是十分重要的工業原料,優良材性林木新品種的選育是保證木材供應的重要策略。木材的形成受到眾多轉錄因子的調控,木材形成關鍵轉錄因子的鑒定及功能解析可為優良木材材性良種的創制提供重要的理論依據及候選基因資源。LBD轉錄因子家族在高等植物中廣泛存在,它們在植物的生長發育、脅迫響應、次生生長等方面起著重要的作用。已有研究表明,LBD家族轉錄因子在木材形成方面發揮著廣泛的調控作用。如白楊中的PtaLBD1和PtaLBD4調控次生韌皮部的發育,而PtaLBD15、PtaLBD18參與木質部的發育調控[24]。毛果楊中的PtrLBD39是應拉木形成的關鍵調節因子[25]。

毛果楊PtrLBD12基因是木材形成關鍵轉錄因子PtrbHLH186所結合并調控的下游基因。對其表達模式分析發現,該基因在毛果楊的木質部、韌皮部的表達水平顯著高于在根、葉組織的表達水平,推測轉錄因子PtrLBD12可能參與木材形成的調控過程。為了探究PtrLBD12的生物功能,本研究構建了PtrLBD12的過量表達載體,并利用農桿菌介導的遺傳轉化法創制了過量表達植株。生長表型分析發現,PtrLBD12過表達導致毛果楊生長緩慢,株高、地徑、莖節數等生長指標與野生型相比均表現出明顯降低。結合組織切片和化學染色結果進一步分析,PtrLBD12過表達植株的木質素沉積水平增加,木質化程度增強。在形態結構方面,過表達植株莖干橫截面的單位面積內,纖維細胞和導管細胞的數量顯著增多,而導管的孔徑減小,形成層細胞則沒有明顯變化。

木質素的沉積依賴于木質素單體合成酶基因的表達,毛果楊中木質素的生物合成由22個木質素單體合成酶基因控制[29]。PtrLBD12過表達植株中木質素單體合成酶基因PtrPAL1、PtrC4H1、PtrC4H2、PtrHCT6、PtrCSE1、PtrCSE2、PtrCCoAOMT1、PtrCCoAOMT2、PtrCCoAOMT3、PtrCCR2、PtrCAld5H1的轉錄水平被明顯促進。因此,毛果楊PtrLBD12轉錄因子可以通過調節木質素合成酶相關基因的表達,改變植株木質素的沉積。

根據Liu等[21]的研究,PtrLBD12基因上游的調控因子PtrbHLH186在毛果楊中作為MYB轉錄因子的下游因子參與木材形成的調控過程。PtrbHLH186基因的上調表達造成植株生長遲緩,木質部導管細胞孔徑減少、數量增多,莖干木質化程度增加,總木質素含量增加[21]。本研究中PtrLBD12轉基因植株表現出的生長特征及木材細胞結構特性與其上游調控基因PtrbHLH186轉基因植株一致。本研究雖然沒有對PtrLBD12轉基因植株的木材組分進行精確測定,但根據組織切片化學染色及木質素單體合成酶基因的表達情況進行推測,轉錄因子PtrLBD12與PtrbHLH186可能具有相似的促進木質素沉積的功能。因此,毛果楊PtrLBD12轉錄因子作為PtrbHLH186的下游靶基因在木材形成中發揮著重要的調控功能。

在干旱條件下,樹木莖干中的木質部往往有著更多、更小的導管,這樣可以承受較低的水勢,防止木質部導管的空化,從而更有效地傳輸水分[21,30]。Kasuga等[31]的研究證明,PtrbHLH186基因的上調表達使植株形成更多、更小的導管細胞,這樣的細胞特性增強了植株的耐旱能力。而PtrLBD12過表達毛果楊植株的導管細胞同樣具有這種特征,因此這種細胞特性的改變很有可能使轉基因植株具有更強的抵御干旱脅迫能力。此外,降低植株的生長量也是植物度過水分匱乏時期的重要應對策略。植株也會通過促進木質素的合成從而抵御脅迫[32]。本研究中的過表達植株也表現出生長量降低、木質素沉積受到促進的表型,這進一步說明了PtrLBD12過表達可能增強植物耐旱性。但PtrLBD12基因響應干旱脅迫的功能和機制等問題還需要進一步探究。

選育產量高、品質優、抗性強、適應性廣的林木品種并應用于生產是未來林木遺傳育種的發展趨勢和重點方向[33]。本研究初步探討了轉錄因子PtrLBD12對毛果楊木材形成和生長發育的影響,明確了該基因對楊樹木質部細胞形態和結構的影響,為轉錄因子介導的木材形成調控機制的解析和林木的遺傳改良提供重要的理論線索,也為利用基因編輯等基因工程手段創制優質、高抗、高產的林木新品種提供重要的、優良的候選基因資源。