溫陽化濁通絡方抑制系統性硬化病EndoMT的機制研究

李 凱, 王 倩, 段培培, 卞 華,3

(1.南陽理工學院河南省張仲景方藥與免疫調節重點實驗室 河南 南陽 473004;2.南陽理工學院張仲景國醫國藥學院 河南 南陽 473004;3.河南中醫藥大學骨傷學院 河南 鄭州 450046)

0 引言

系統性硬化病(Systemic sclerosis, SSc)是一種以血管損傷、免疫紊亂、皮膚和/或內臟進行性纖維化為特征的自身免疫性疾病[1]。在SSc各種損傷的靶器官中,皮膚和肺部受累最常見,尤其是肺血管損傷和肺纖維化是影響SSc進展和預后的主要原因。超過70%的SSc患者伴隨肺部病變,主要包括間質性肺病(interstitial lung disease, ILD)和肺動脈高壓(pulmonary hypertension, PH),這兩種肺部病變占SSc相關死亡的60%[2]。目前認為SSc相關肺部病變是以微血管損傷和肺泡炎癥等早期病理改變為始動因素,其中微血管損傷誘導的炎癥和自身免疫反應直接或間接刺激成纖維細胞的活化,導致纖維化發生[3]。研究證實肺微血管內皮細胞損傷的機制主要與EndoMT、缺氧、自噬過度及炎癥等相關[4]。

目前,SSc的整體治療原則仍以抗炎、免疫調節、改善血液循環及抑制纖維化為主,比如抗TGF-β抗體CAT-192、抗CD-20抗體利妥昔單抗、環磷酰胺、甲氨蝶呤、D-青霉胺等[5]。但是,臨床數據顯示這些藥物的副作用以及長期治療效果均難以令人滿意。目前尚無有效的治療手段從保護肺血管內皮細胞并改善肺功能角度來防治SSc,因此,致力于相關SSc新藥開發是解決目前SSc治療困局的最佳途徑。本課題組既往系列研究表明,溫陽化濁通絡方治療SSc療效顯著,其作用機制主要為抗纖維化,調節免疫失衡和保護血管。研究發現,溫陽化濁通絡方能夠降低SSc模型小鼠和SSc患者血清VEGF、CTGF、ET-1和vWF的表達水平[6-7],同時減少SSc患者血液中的內皮細胞數[8],表明溫陽化濁通絡方對SSc患者的血管具有保護作用,并改善SSc血管病變。但是,溫陽化濁通絡方改善SSc血管病變的作用機制尚不清楚。因此,本研究旨在探討溫陽化濁通絡方通過抑制HIF-1α/Foxm1/Smad信號通路介導的EndoMT來改善肺血管內皮細胞損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物準備

溫陽化濁通絡方的藥物組成為黃芪、黨參、山藥、淫羊藿、熟地、桂枝、積雪草、白芥子、槌果藤、絲瓜絡,這些中藥均從河南省張仲景大藥房購買,湯劑制作方法參考我們之前的論文[9]。HIF-1α抑制劑KC7F2(濃度為10 mmol/L,HY-18777,MCE公司)。

1.2 主要試劑與儀器

Masson三色染色試劑盒(G1340,北京索萊寶科技有限公司),免疫組化試劑盒(D601037-0050,上海生工生物工程有限公司),HIF-1α抗體(AF1009,江蘇親科生物研究中心有限公司),Foxm1抗體(AF7860,江蘇親科生物研究中心有限公司),smad3抗體(AF6362,江蘇親科生物研究中心有限公司),VE-Cadherin(AF6265,江蘇親科生物研究中心有限公司),vimentin(AF7013,江蘇親科生物研究中心有限公司)。

1.3 博來霉素誘導的SSc小鼠模型的構建和實驗分組

6～8周齡,體重20 g左右的雄性 C57/BL6N小鼠(浙江維通利華實驗動物技術有限公司)被用來構建博來霉素誘導的SSc小鼠模型。小鼠隨機分為7組,每組6只。一組小鼠不接受任何處理,標記為對照組。一組小鼠皮下注射100 μL PBS溶液,標記為PBS組。另外5組利用博來霉素構建SSc小鼠模型,被標記為模型組,動物模型構建的實驗方案參照我們之前的研究[10],針對動物模型的藥物處理方案如下。在SSc小鼠模型構建基礎上,藥物處理方案為:對照組小鼠、PBS組小鼠和模型組小鼠每天接受生理鹽水灌胃處理(1 mL/day),WYHZTL-L+模型組小鼠接受低劑量溫陽化濁通絡方灌胃處理(藥物劑量為11.75 g/kg/day),WYHZTL-M+模型組小鼠接受中劑量溫陽化濁通絡方灌胃處理(藥物劑量為23.5 g/kg/day),WYHZTL-H+模型組小鼠接受高劑量溫陽化濁通絡方灌胃處理(藥物劑量為47 g/kg/day),KC7F2+模型組小鼠接受KC7L2腹膜下注射處理(KC7L2溶解于PBS溶液,劑量為10 mg/kg)。所有的藥物治療持續4周,然后用氯胺酮(150 mg/kg)和乙酰丙嗪(15 mg/kg)的混合物腹膜內注射來麻醉并處死小鼠。肺組織立即放入福爾馬林溶液中固定。PBS組被用來作為博來霉素的陰性對照。本研究的所有動物實驗操作步驟均被南陽理工學院倫理委員會批準。

1.4 Masson染色和免疫組化染色

將小鼠肺組織固定并用石蠟包埋制作成組織蠟塊,用切片機將蠟塊切成4～5 μm厚度的病理切片。對于masson染色步驟,按照試劑盒說明書操作,切片常規脫蠟脫水后用weigert鐵蘇木素染色液染色,酸性乙醇分化液分化,masson藍化液返藍,麗春紅品紅染色液染色,磷鉬酸溶液洗滌,苯胺藍染色液染色,95%乙醇脫水,無水乙醇脫水,二甲苯透明,最后中性樹膠封片。Masson染色后肌纖維呈紅色,膠原纖維呈綠色或藍色,主要用于區分膠原纖維和肌纖維。對于免疫組化染色步驟,按照試劑盒說明書操作,切片60 ℃烤片,二甲苯脫蠟,分別用無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇浸泡水化,枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)進行抗原修復,酶滅活,BSA封閉,加不同一抗置于4 ℃濕盒中孵育過夜,洗滌后滴加HRP標記的二抗,用DAB法顯色,并用蘇木素復染,脫色返藍后用中性樹脂封片。利用imageJ軟件中的IHC插件進行免疫組化結果的定量分析。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 溫陽化濁通絡方的治療作用

利用博來霉素誘導構建SSc小鼠模型,通過masson染色檢測小鼠肺組織的纖維化程度,由圖1可知,相對于對照組和PBS組,模型組小鼠的肺組織以及肺血管的膠原纖維染色明顯增強,表明模型組小鼠的肺組織發生了明顯的纖維化,證明了博來霉素誘導構建SSc小鼠模型構建成功。另外,在模型小鼠中分別施加溫陽化濁通絡方和KC7F2(HIF-1α抑制劑)處理,觀察不同劑量的溫陽化濁通絡方和KC7F2對肺纖維化的治療效果,masson染色結果顯示,相對于模型組,低、中、高劑量的溫陽化濁通絡方(WYHZTL-L+模型組、WYHZTL-M+模型組、WYHZTL-H+模型組)和KC7F2(KC7F2+模型組)治療后,小鼠肺組織和肺血管組織的膠原纖維染色強度顯著降低,表明溫陽化濁通絡方和KC7F2能夠顯著抑制博來霉素誘導構建SSc小鼠肺纖維化。另外,相對于WYHZTL-L+模型組和WYHZTL-M+模型組,KC7F2+模型組和WYHZTL-H+模型組的小鼠肺組織和肺血管組織的膠原纖維染色強度顯著降低,表明溫陽化濁通絡方治療SSc肺纖維化具有劑量依賴性。

圖1 在博來霉素誘導的SSc小鼠模型中觀察溫陽化濁通絡方對肺纖維化的治療作用注:WYHZTL-L為低劑量的溫陽化濁通絡方,WYHZTL-M為中劑量的溫陽化濁通絡方,WYHZTL-H為高劑量的溫陽化濁通絡方,KC7F2為HIF-1α抑制劑。

2.2 溫陽化濁通絡方的調控作用

在博來霉素誘導的SSc小鼠模型中,通過免疫組化檢測了小鼠肺組織中的HIF-1α/Foxm1/smad3信號通路,以及EndoMT標志物VE-cadherin和vimentin的蛋白表達水平。由圖2可知,相對于對照組和PBS組,模型組小鼠肺血管內皮細胞中的HIF-1α、Foxm1、smad3、vimentin的蛋白表達水平顯著增高,而VE-cadherin的蛋白表達水平顯著降低。相對于模型組,經過溫陽化濁通絡方或KC7F2的治療后,小鼠肺血管內皮細胞中的HIF-1α、Foxm1、smad3、vimentin的蛋白表達水平顯著降低,而VE-cadherin的蛋白表達水平顯著提高。另外,相對于低劑量的溫陽化濁通絡方(WYHZTL-L+模型組),中、高劑量的溫陽化濁通絡方(WYHZTL-M+模型組、WYHZTL-H+模型組)對HIF-1α、Foxm1、smad3、vimentin和VE-cadherin的蛋白表達水平具有更加顯著的調控作用。而中、高劑量的溫陽化濁通絡方對于HIF-1α、Foxm1、smad3和VE-cadherin的調控作用無顯著性差異。但是,相對于中劑量的溫陽化濁通絡方(WYHZTL-L+模型組),高劑量的溫陽化濁通絡方(WYHZTL-H+模型組)對于vimentin的抑制作用更加明顯。另外,結果顯示KC7F2(KC7F2+模型組)對于HIF-1α、Foxm1、smad3、vimentin和VE-cadherin的調控作用與高劑量的溫陽化濁通絡方(WYHZTL-H+模型組)無顯著性差異,但是優于低、中劑量的溫陽化濁通絡方(WYHZTL-L+模型組、WYHZTL-M+模型組)。這些結果表明,溫陽化濁通絡方和KC7F2能夠通過抑制HIF-1α/Foxm1/Smad3信號通路介導的EndoMT,改善SSc肺微血管內皮細胞損傷,而且溫陽化濁通絡方的這種效應存在劑量依賴性。

圖2 在博來霉素誘導的SSc小鼠模型中觀察溫陽化濁通絡方對HIF-1α/Foxm1/Smad3信號通路和EndoMT標志物的調控作用注:A:各組小鼠肺組織的免疫組化結果;B-F:不同蛋白的免疫組化結果的定量分析。WYHZTL-L為低劑量的溫陽化濁通絡方,WYHZTL-M為中劑量的溫陽化濁通絡方,WYHZTL-H為高劑量的溫陽化濁通絡方,KC7F2為HIF-1α抑制劑。ns表示沒有統計學意義;*表示P<0.05;**表示P<0.01;***表示P<0.001。

3 討論

EndoMT指內皮細胞在受到刺激后獲得間充質細胞樣表型。在EndoMT過程中,由于駐留的內皮細胞從血管壁的組織細胞層分離并侵入周圍組織,將導致血管內膜結構的破壞,造成血管損傷[11-12]。SSc的早期特征是內皮細胞的損傷,以及內膜的增生和血管腔的最終閉塞。毛細血管血流量減少加上血管生成不足會導致慢性缺氧和組織缺血,從而形成正反饋回路,維持血管重塑,而細胞外基質積聚導致纖維化進一步加劇了這種情況[13]。因此,抑制EndoMT進而改善血管內皮細胞損傷,可能是治療SSc的有效途徑之一。在本研究中,首先我們在博來霉素誘導的SSc小鼠模型中發現EndoMT標志物VE-cadherin和vimentin表達水平的失調,證實了SSc肺血管內皮細胞確實存在EndoMT的現象。

研究發現,SSc患者的血氧分壓較健康對照顯著降低,提示SSc發病過程中一直伴隨長期慢性缺氧的癥狀。缺氧是促進內皮細胞EndoMT的有效刺激,HIF-1α能夠誘導動脈血管內皮細胞EndoMT,進而導致纖維化的發生[14]。同時,Lavigne等[15]發現HIF-1α通過促進肺血管內皮細胞EndoMT導致放射線誘發的肺纖維化的發生。這些結果表明,缺氧誘導的肺血管內皮細胞EndoMT可能與HIF-1α有關。在本研究中,我們的結果證實了博來霉素誘導的SSc小鼠模型中HIF-1α表達水平上調,并且HIF-1α抑制劑KC7F2能夠抑制SSc肺血管內皮細胞EndoMT,表明SSc發生發展過程中HIF-1α能夠促進EndoMT的發生。

在SSc發生發展過程中,缺氧促進血管內皮細胞EndoMT的分子機制尚不清楚。研究發現用TGF-β和內皮素-1(endothelin-1, ET-1)處理的正常成纖維細胞也能夠促進相同內皮細胞的EndoMT[16]。進一步研究發現,在血管內皮細胞中,TGF-β的激活能夠促進Foxm1介導的內皮細胞EndoMT,其分子機制為Foxm1與Smad蛋白相互作用,上調促EndoMT因子(如Snail、Slug、Twist和Zeb等)的表達[17-18]。Huang等[18]發現Foxm1基因啟動子區含有低氧反應元件(HRE),HIF-1α能夠特異性地與Foxm1基因啟動子HRE結合,促進Foxm1的表達水平。因此,HIF-1α/Foxm1/Smad3信號通路可能是促進內皮細胞EndoMT的分子機制之一。在SSc小鼠模型中,我們發現缺氧確實能夠激活HIF-1α/Foxm1/Smad3信號通路和內皮細胞EndoMT,而抑制HIF-1α能夠逆轉這些效應。我們的研究證實了低氧環境下,HIF-1α/Foxm1/Sma3d信號通路的過度激活能夠促進肺血管內皮細胞EndoMT,這是導致SSc肺血管損傷的重要機制之一。更重要的是,在SSc小鼠模型中,我們證實了溫陽化濁通絡方具有類似于HIF-1α抑制劑的效應,能夠抑制HIF-1α/Foxm1/Smad3信號通路介導的肺血管內皮細胞EndoMT。

綜上,在本研究中,我們首先證實了SSc發生發展過程中肺血管內皮細胞EndoMT的存在。進一步地,我們闡釋了低氧環境下,HIF-1α/Foxm1/Smad3信號通路的過度激活能夠促進肺血管內皮細胞EndoMT,這是導致SSc肺血管損傷的重要機制之一。最后,我們發現溫陽化濁通絡方能夠抑制HIF-1α/Foxm1/Smad3信號通路介導的肺血管內皮細胞EndoMT,這可能是溫陽化濁通絡方保護肺血管治療SSc的作用機制之一。