牦牛源短小芽胞桿菌TS1的分離鑒定及其生物學特性研究

劉銀坤,李昊,李子昕,李知新,張玉彥,李文財,任建軍,唐姝*

(1.南京農業大學動物醫學院,江蘇 南京 210095;2.寧夏動物疾病預防控制中心,寧夏 銀川 750199;3.寧夏安利森生物科技有限公司,寧夏 銀川 750001)

抗菌藥物是人類和畜禽防治細菌感染的重要手段。隨著抗菌藥物的不當使用或濫用,細菌對常用抗菌藥物的耐藥性日趨嚴重。因此,“飼料端禁抗、養殖端減抗、限抗”已成為全球共識。歐盟自2006年1月開始不允許抗菌藥物作為飼料添加劑使用,中國自2020年開始也禁止在畜禽養殖過程中作為飼料添加劑使用抗生素[1-2]。在“禁抗限抗”的大背景下,急需開發抗生素替代產品用于畜禽臨床生產實踐。目前益生菌是應用較廣的替代產品之一,益生菌添加劑不僅可以提高動物生長速度,還可以維持腸道菌群平衡,并且可以通過調控畜禽腸道菌群維持腸道上皮的穩態,從而促進畜禽腸道健康[3-5]。益生菌本身及其代謝產物又具有廣譜抗菌作用,因此篩選不同動物來源的益生菌是“減抗限抗”大背景下抗生素替代品開發的有效方式。

農業部2013年公布了飼料添加劑的品種目錄,共有13種類別,其中包括短小芽胞桿菌(Bacilluspumilus)[6]。短小芽胞桿菌被廣泛應用的優勢：1)易保存、抗逆性好,分離、培養和保藏的條件簡單,對工業化工生產技術要求低,能夠在腸胃中保持穩定作用并且保持較高活性;其芽胞對外在的惡劣環境(如熱、紫外線、電離輻射和低pH等)有較強抵抗作用[7];2)當攝入足夠量時能夠預防或改善腹瀉[8],緩解不耐乳糖癥狀,預防生殖系統感染[9],增強畜禽免疫力[10],促進腸道消化系統健康[11-12],降低血清膽固醇,幫助吸收營養成分與促進畜禽生長[13-14]等。綜上,短小芽胞桿菌具有易保存、活性成分高等優勢,值得大量推廣和應用。

本試驗從健康牦牛糞便中分離到1株具有益生潛力的短小芽胞桿菌,對其形態學、生理生化、耐酸、耐膽鹽、對常用抗菌藥物的敏感性及對常見病原菌的抑菌活性等進行研究,旨在評價其用于制備益生菌添加劑的可行性,為動物來源的益生芽胞桿菌的開發利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

于甘肅將軍山丹軍馬場無菌采集健康牦牛糞便,一部分用于室溫分離短小芽胞桿菌,剩余樣品-80 ℃保存。

1.2 主要試劑

試驗所需主要試劑為LB培養基(青島海博生物技術有限公司)、LB液體培養基(青島海博生物技術有限公司)、Landy培養基(上海瑞楚生物科技有限公司)、磷酸鹽緩沖液(PBS,南京諾唯贊生物科技股份有限公司)、革蘭氏染色液(南京建成生物工程研究所)、鹽酸(優級純,HCl含量36%～38%)、牛膽鹽(上海源葉生物科技有限公司,膽酸含量大于等于60%)、細菌16S rRNA通用引物及PCR 2xTaqMaster Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)、生化鑒定管(廣州環凱微生物科技有限公司)、藥敏紙片(杭州微生物試劑有限公司和北京索萊寶科技有限公司)等。

1.3 菌株的分離與純化

取1 g左右牛糞樣品至裝有5 mL無菌生理鹽水的玻璃試管中,用封口膜封住管口于沸水中煮沸10 min;取煮沸后的100 μL上清液至裝有5 mL LB液體培養基的EP管中,放入搖床,37 ℃、160～180 r·min-1振蕩培養16～18 h;取100 μL菌液加入5 mL液體培養基中再次振蕩培養16 h;蘸取菌液在LB固體培養基中劃線,于37 ℃恒溫箱中倒置培養12～18 h,挑取單菌落接種LB固體培養基于37 ℃恒溫箱培養12～18 h,再次挑取單菌落至5 mL LB液體培養基中振蕩培養16～18 h,得到純化菌液。

1.4 細菌16S rRNA PCR擴增、測序以及同源性和系統進化樹分析

將分離純化后的菌液用16S rRNA引物按照說明書進行PCR擴增,產物在10 g·L-1的瓊脂糖凝膠中進行電泳。將含有目的條帶的PCR產物原液送至北京擎科生物科技有限公司進行一代測序;將純化后的菌液送至上海凌恩生物科技有限公司進行基因組DNA提取以及全基因組測序。使用PacBio RS和Illumina測序平臺對TS1基因組進行全基因組測序。使用ABySS(http：//www.bcgsc.ca/platform/bioinfo/software/abyss)進行基因組組裝,再使用canu(https：//github.com/marbl/canu)來組裝PacBio校正后的長讀數,最后用GapCloser(https：//sourceforge.net/projects/soapdenovo2/files/GapCloser/)填補剩余的局部內部空白,并糾正單堿基多態性,得到最終的組裝結果。用Circos v0.64(http：//circos.ca/)繪制完整基因組圈圖。將測序得到的一代測序即16S rRNA序列提交到NCBI中進行BLAST比對,將同源性高于99%的菌株以及其他芽胞桿菌屬的代表菌株用Mega 5.0 軟件建立系統進化樹;將全基因組測序的47個序列片段提交到BAGEL4(http：//bagel.molgenrug.nl/)與數據庫進行比對,預測TS1含有的抗菌基因。將預測含有抗菌基因的序列片段用SnapGene 4.3.6軟件分析并繪圖。

1.5 菌株的形態以及生化鑒定試驗

將TS1菌株按照革蘭氏染色試劑盒的說明書進行染色鏡檢觀察其形態;將純化的TS1菌液按生化鑒定管說明書接種于不同細菌生化鑒定管中,于37 ℃恒溫培養箱培養24 h,觀察結果并參照細菌生化鑒定編碼冊進行鑒別。

1.6 菌株的生長曲線測定及耐酸、耐膽鹽試驗

將純化的TS1菌株按10 mL·L-1的接種量接種到新鮮的LB培養基中,取200 μL菌液加入96孔板中,設置3個重復,置于37 ℃的酶標儀中,每隔1 h測量D600值,繪制生長曲線。

取50 μL純化后的TS1菌液分別加入4 950 μL pH值為3.02、4.06、5.03、6.04的LB液體培養基中,再取50 μL純化后的菌液加入4 950 μL正常LB液體培養基中作為對照,同時放入37 ℃、160～180 r·min-1恒溫振蕩培養箱培養16～18 h,用酶標儀分別測量酸性培養液和對照培養液培養的菌液D600值,計算菌株存活率。

另取50 μL純化后的TS1菌液分別加入4 950 μL牛膽鹽濃度為0.05%、0.1%、0.2%、0.3%的LB液體培養液中,再取50 μL活化后的菌液加入4 950 μL LB液體培養基中作為對照,同時放入37 ℃、160～180 r·min-1恒溫振蕩培養箱振蕩培養16～18 h,用酶標儀分別測量含膽鹽的培養液和對照培養液培養的菌液D600值,計算菌株存活率。

1.7 不同抗菌藥物對TS1菌株的抑菌活性

用無菌生理鹽水將TS1純化菌液稀釋至0.5麥氏濃度(約1×108CFU·mL-1),將稀釋后的TS1菌液均勻鋪于LB固體培養基中,選取六大類15種抗菌藥物,用K-B藥敏紙片法[15]間隔一定距離貼藥敏紙片(具體型號見表1),于37 ℃恒溫培養18 h后測量抑菌圈平均直徑(mm),參照CLSI M100ED30的結果判讀標準[16]描述TS1耐藥結果。

表1 藥敏紙片信息Table 1 Information on susceptibility test disk

1.8 TS1菌株的體外抑菌試驗

以大腸桿菌(ATCC25922)、沙門氏菌(ATCC58785)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、豬鏈球菌(WH1609)作為指示菌,采用瓊脂擴散打孔法測定抑菌圈,每組設置3個重復。將100 μL指示菌均勻鋪于LB固體培養基中,打孔后在孔中加入50～80 μL的純化TS1菌液,37 ℃恒溫培養24 h,測量抑菌圈直徑,以抑菌圈平均直徑(mm)描述抑菌效果。

選取革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌的代表菌株金黃色葡萄球菌(ATCC25923)和大腸桿菌(ATCC25922)作為指示菌進行后續試驗。將純化后的菌液放入高速冷凍離心機中5 000 r·min-1離心 5 min 獲得菌體和上清液,用無菌PBS清洗菌體1～2次保證菌體的純度。然后采用打孔法設置試驗分組：陰性對照組、TS1全菌液組、上清液組以及菌體組,37 ℃培養24 h,進行TS1菌體和上清的抑菌試驗,以有無抑菌圈判定其抑菌效果。

2 結果與分析

2.1 短小芽胞桿菌TS1 16S rRNA PCR擴增與系統進化樹分析

從49株益生菌中分離、篩選得到1株各方面性能相對比較好的菌株,將其命名為TS1,并保藏于中國典型培養物保藏中心,保藏號為NO.2022538。TS1 16S rRNA PCR擴增結果(圖1-A)顯示：在1 000～2 000 bp處出現明顯條帶,且陰性對照組沒有出現條帶。系統發育樹結果見圖1-B,BLAST分析發現與TS1 16S rRNA同源性高于99%的菌株均屬于短小芽胞桿菌,且與BacilluspumilusEE112-P4聚在一支。

圖1 TS1 16S rRNA PCR擴增結果與系統進化樹分析Fig.1 Results of TS1 16S rRNA PCR amplification and phylogenetic tree analysis A. TS1 16S rRNA PCR擴增結果(con為陰性對照,LB和Landy代表不同的液體培養基,M為DNA標準品);B. 基于菌株TS1及相關菌株的16S rRNA序列采用鄰接法建立的系統發育樹。A. TS1 16S rRNA PCR amplification results(con is the negative control,LB and Landy represent different liquid medium,M indicates DNA marker);B. Phylogenetic tree established using neighbour-joining method based on 16S rRNA sequence of strain TS1 and related strains.

2.2 TS1菌株的形態以及生化鑒定結果

TS1革蘭氏染色為陽性,細菌形態為單個、短直、桿狀(圖2-A);TS1在LB培養基上生長狀況良好,菌落形態大多為直徑2～3 mm中間稍有凹陷的圓形或者橢圓形(圖2-B);將TS1分別接種不同的生化反應鑒定管,按說明書進行培養,根據生化鑒定結果(表2)并對照細菌生化鑒定編碼冊確定該菌株為短小芽胞桿菌。

圖2 TS1革蘭氏染色結果及菌株形態Fig.2 TS1 Gram staining results and strain morphologyA. 革蘭氏染色結果Gram staining results;B. TS1的菌落形態Colony morphology of TS1.

表2 TS1的生化鑒定結果Table 2 Biochemical identification results of TS1

2.3 TS1的生長曲線測定及耐酸耐膽鹽試驗

用酶標儀每隔2 h測定TS1 48 h的生長曲線(圖3-A),結果顯示,TS1在培養約4 h進入對數生長期,繁殖快速,菌體濃度增加,在22 h左右到達平臺期且48 h仍然保持穩定,說明穩定期的維持時間長;由圖3-B 和C可知,TS1在低pH值和高膽鹽含量下存活率仍然較高,說明TS1能在畜禽的胃以及腸道中存活。

圖3 TS1的生長曲線及耐酸、耐膽鹽結果Fig.3 Growth curve of TS1 and results of acid and bile salt resistanceA. TS1 48 h生長曲線;B. TS1在不同pH下的存活率;C. TS1在不同膽鹽含量下的存活率。A. TS1 48 h growth curve;B. Survival rate of TS1 at different pH value;C. Survival rate of TS1 at different bile salt content.

2.4 TS1的藥敏試驗結果

由表3可知,短小芽胞桿菌TS1對β-內酰胺類、磺胺類、四環素類、喹諾酮類、氨基糖苷類、頭孢1/2/3/4代中常用的代表性藥物中的復方新諾明、阿米卡星、氧氟沙星、氨芐西林、青霉素、慶大霉素、多西環素、環丙沙星、阿莫西林、美羅培南和頭孢唑林極敏,對頭孢他啶產生耐藥,對頭孢噻肟和頭孢吡肟中度敏感,對頭孢呋辛高度敏感。

表3 短小芽胞桿菌TS1的藥敏試驗結果Table 3 Results of the drug sensitivity test of Bacillus pumilus TS1

2.5 TS1的體外抑菌試驗結果

由圖4可知：短小芽胞桿菌TS1對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和豬鏈球菌4種指示菌(革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌各2種)均產生較明顯的抑菌作用,抑菌直徑分別為18、21、28和23 mm,對革蘭氏陽性菌的抑菌作用更明顯,陰性對照組無抑菌圈(圖4-A—D),說明TS1產生了抑菌產物;全菌液和菌體對大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌都產生了抑菌圈,上清液以及陰性對照組無抑菌圈(圖4-E、F),這可能與TS1的培養條件有關。

圖4 短小芽胞桿菌TS1體外抑菌試驗結果Fig.4 Results of in vitro inhibition test of Bacillus pumilus TS1 A. TS1對大腸桿菌的抑菌結果;B. TS1對沙門氏菌的抑菌結果;C. TS1對金黃色葡萄球菌的抑菌結果;D. TS1對豬鏈球菌的抑菌結果;E. TS1的全菌液、上清液、菌體沉淀以及陰性對照LB肉湯對大腸桿菌的抑菌結果;F. TS1的全菌液、上清液、菌體沉淀以及陰性對照LB肉湯對金黃色葡萄球菌的抑菌結果。A. Inhibition results of TS1 against Escherichia coli;B. Inhibition results of TS1 against Salmonella;C. Inhibition results of TS1 against Staphylococcus aureus;D. Inhibition results of TS1 against Streptococcus suis;E. Inhibition results of TS1 in whole solution,supernatant,bacterial precipitate and negative control LB broth against Escherichia coli;F. Inhibition results of TS1 in whole solution,supernatant,bacterial precipitate and negative control LB broth against Staphylococcus aureus.

2.6 TS1的全基因組測序結果

由圖5可知,TS1基因全長為3 646 887 bp,GC含量約為42.09%。BAGEL4中的結果顯示其產生的抗菌肽與Amylocyclicin較為相近,且與數據庫里的抗菌肽比對后發現相似度只有48.90%,說明TS1產生的抗菌肽可能是一種新型抗菌肽。

圖5 短小芽胞桿菌TS1全基因組測序及分析結果Fig.5 Sequencing and analysis results of the whole genome of Bacillus pumilus TS1A. TS1全基因組圈圖;B. TS1中的Amylocyclicin位置以及與基因庫對比的相似性;C. Amylocyclicin基因簇。A. Sketch of the whole genome of TS1;B. Amylocyclicin location in TS1 and similarity to gene bank comparison;C. Amylocyclicin gene cluster.

3 討論與結論

畜禽養殖中細菌耐藥性問題已日益嚴峻,對抗生素替代品的篩選和研究刻不容緩。益生菌添加劑不僅可以促進動物生長,還可抑制致病菌,同時通過調節畜禽腸道菌群維持腸道上皮穩態,從而促進畜禽腸道健康[17-19]。目前市面上所售動物用益生菌產品大多數為枯草芽胞桿菌(Bacillusubtilis),少數為地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)、蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)等[20]。本試驗從健康牦牛糞便中分離鑒定出了一株具有益生潛力的短小芽胞桿菌TS1。芽胞桿菌屬在惡劣的環境中可以形成芽胞而存活,因此具有抗逆性好、易保存的優點。有研究表面,芽胞桿菌屬因容易在畜禽腸道中定殖而發揮益生作用[21]。

畜禽養殖中可以應用的益生菌應具備生長性能強、耐受惡劣環境的特點,因此篩選出具有耐受強酸性、高膽鹽含量以及高溫條件的菌株具有重要意義。本試驗篩選的短小芽胞桿菌TS1在pH3左右時的存活率為31.4%,在牛膽鹽濃度為0.3%時的存活率為65.4%,說明其具有較強的耐酸、耐膽鹽能力。畜禽胃中大多為強酸環境,腸道中的膽鹽含量為0.05%～0.3%,TS1具有較強的耐酸耐膽鹽能力,足夠數量的TS1可以通過胃腸,從而占據腸道生態位抑制致病菌的定殖,減少致病菌侵害[22]。

TS1體外抑菌試驗結果表明,TS1菌全菌液和離心后的菌體對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均具有一定的抑菌作用。有研究表明短小芽胞桿菌發揮抑菌作用可能是各種酶在發揮作用[23-24],也有研究認為是細菌素的作用[25-26]。本研究通過全基因組測序結果推測TS1發揮抑菌作用的物質可能是抗菌肽Amylocyclicin,這是一種對革蘭氏陽性菌有高抗菌活性的新型細菌素[27]。Amylocyclicin是環狀細菌素的一個成員,這是一類核糖體合成的多肽家族,它們因其熱穩定性和高磷酸基團(PI)值而區別于其他細菌素并普遍存在于芽胞桿菌類群中[28]。在許多革蘭氏陽性細菌中都存在環狀細菌素。本試驗發現的Amylocyclicin與其他環狀細菌素的同源性較低,如大腸桿菌的Carnocyclin[29](33.7%)、糞腸球菌的Enterocin[30](38.2%)、乳酸菌的Lactocyclicin[31](35.6%)。與同是芽胞桿菌FZB42的Amyloliquefaciens[27]相比,同源性為48.9%,TS1 Amylocyclicin的核苷酸序列與芽胞桿菌屬的序列相似性為97%～99%[32]。有研究表明Amylocyclicin發揮抑菌作用的主要機制是破壞致病菌細胞壁使其形成孔洞,其內容物外泄,細菌因無法進行正常代謝而死亡[33]。因此,本試驗所分離的TS1具有潛在的替代抗生素的應用價值。Suda等[34]研究表明芽胞桿菌產生抗菌肽的最適條件需采用BHI(brain heart infusion)培養基,于30 ℃有氧條件下振蕩(150 r·min-1)培養。還有研究表明果糖和Landy培養基也會促進抗菌肽的產生和分泌[35-36]。我們發現TS1序列中有編碼抗菌肽Amylocyclicin的基因簇,但本實驗未發現TS1的培養上清液具有明顯的抗菌活性,推測該基因簇需要在一定的培養條件或者合適的培養基方可大量表達,對此尚需進一步優化培養條件進行深入探究。

本研究所篩選出的牦牛源短小芽胞桿菌TS1,具備生長速度快、穩定期時間長、抗逆性強、廣譜抗菌的特點,基本具備了畜禽飼料添加劑臨床使用的特性,具有開發成為畜禽用飼料添加劑的潛力。在此基礎上,我們發現TS1的基因組中存在一段較新的編碼抗菌肽的序列,其抑菌作用可能與此抗菌肽有關,但是具體的機制還需要進一步探究。