姜酚和百里香酚對白羽肉雞小腸形態結構和屏障功能的影響

尹莉麗,吳建民,陳露,趙文軒,汪晶,朱偉云

(南京農業大學動物科技學院/國家動物消化道營養國際聯合研究中心,江蘇 南京 210095)

腸道在消化、營養吸收和免疫防御中起著至關重要的作用,它不僅是消化吸收營養物質的場所,還是維持機體內部動態平衡的屏障。腸道屏障是抵御腸腔內有害物質(如病原體、毒素和抗原等)結構和功能的總稱,包括物理、化學、免疫和微生物屏障。研究表明,家禽生長易受營養、環境和飼養管理等因素的影響,使腸道屏障受損,表現出免疫力下降和腸道菌群失衡等,從而導致全身炎癥反應、器官衰竭甚至死亡[1]。多年來,抗生素一直被用于促進家禽生長和預防疾病,然而隨著抗生素對畜禽產品安全及人類健康危害的揭示,開發新型綠色安全的天然替代品成為研究熱點。植物性飼料添加劑(phytogenic feed additives,PFA)因其綠色無污染,并且能夠調節腸道菌群及機體免疫等[2]而被廣泛應用于畜禽養殖中,發揮促進腸道健康等作用。研究發現單一植物提取物具有添加量大、效果單一的缺點,而多個提取物復合可以通過活性成分的協同作用增強其作用效果,能夠更好發揮益生作用[3]。

姜酚(gingerol,Gin)是生姜中姜辣素的主要成分,包括6-姜酚(含量最高,生物活性最強)、8-姜酚、10-姜酚、12-姜酚等多種成分,在抗氧化[4]、抗炎[5]、抗菌[6]等方面發揮著重要作用。姜酚能夠抑制Caco-2細胞系中的核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)分泌,降低白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)、白細胞介素8(interleukin-8,IL-8)等炎性細胞因子水平從而改善炎癥反應,維持腸道上皮屏障功能[7]。Karangiya等[8]研究證實,生姜能顯著提高肉雞的生長性能,改善十二指腸形態結構,增加腸道吸收表面積。百里香酚(thymol,Thy)是一種從唇形科植物的揮發油中提取出的單體物質,具有廣譜抑菌、消炎和提高機體抗氧化等作用。百里香酚的抗氧化特性與其酚類結構有關,酚類結構可以吸附和中和自由基并表現出氧化還原特性[9]。百里香酚具有有效清除和還原超氧陰離子、羥基自由基和DPPH自由基的能力[10],并且還能激活核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)信號通路從而提高抗氧化能力[11]。體外試驗證明,用百里香酚預處理IPEC-J2細胞,可以通過減少上皮細胞中活性氧的產生和促炎細胞因子的表達來減輕脂多糖誘導的屏障功能損傷[12]。Du等[13]研究表明,日糧中百里香酚可通過改善感染產氣莢膜梭菌的肉雞腸道完整性和調節免疫反應來減輕腸道損傷。

姜酚水溶性差導致其生物利用度低,同時具有不穩定的β-羥基酮結構,可能會降低姜酚的藥理和生物活性[14]。多項研究表明,百里香酚與丁香酚、香芹酚或肉桂醛等物質具有較好的協同作用,其原因可能是百里香酚能夠破壞細菌外膜,使丁香酚、香芹酚或肉桂醛等物質更容易進入細胞質并與蛋白質結合,從而發揮協同抑菌作用,提高其生物利用度[15-18]?；谝陨涎芯拷Y果,我們推測姜酚和百里香酚組合可能在改善腸道健康等方面具有較好的效果。因此,本試驗以1～42日齡愛拔益加(AA)白羽肉雞為對象,研究日糧添加姜酚、百里香酚及其組合對肉雞小腸形態結構、免疫功能以及腸道屏障的影響,為姜酚和百里香酚在肉雞上的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1日齡愛拔益加(AA)白羽肉雞購自南京特給力種植專業合作社;姜酚(純度≥60%)和百里香酚(純度≥98%)均購自山西玉寧生物科技有限公司。

1.2 試驗設計

試驗選取200只1日齡健康狀況良好、體重相近的AA白羽肉雞,隨機分為4組,每組5個重復,每個重復10只雞,試驗期為42 d。4個試驗組分別為：對照(Con)組,基礎日糧(不含抗生素);姜酚(Gin)組,基礎日糧+60 mg·kg-1姜酚;百里香酚(Thy)組,基礎日糧+30 mg·kg-1百里香酚;姜百(Gin+Thy)組,基礎日糧+30 mg·kg-1姜酚+15 mg·kg-1百里香酚。

1.3 試驗飼糧與飼養管理

基礎飼糧參照NRC(1994)的營養需求標準配制的玉米-豆粕型飼糧?；A日糧的組成和營養水平如表1。試驗采用3層籠養,試驗地點為南京農業大學衛崗校區家禽養殖房。在雞1～3日齡時,雞舍的溫度控制在32～35 ℃,后期每周降低2～3 ℃,最終溫度保持在23 ℃。整個試驗期間雞舍保持24 h光照,自然通風。試驗期間所有肉雞均可自由采食和飲水,疫苗接種按常規程序進行。所有試驗程序均經南京農業大學動物倫理委員會批準。

表1 基礎日糧原料組成及營養水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets(air-dry basis) %

1.4 樣品采集

在試驗期第42 天每個重復選取1只接近該重復平均體重的雞,肉雞空腹12 h(可自由飲水)后進行屠宰采集樣品。待雞死亡后立即解剖肉雞,用預冷的無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗干凈空腸和回腸組織,用無菌載玻片刮取空腸和回腸黏膜裝于2 mL無菌凍存管中,放置于液氮中保存待測;另切取空腸和回腸中間處1～2 cm的腸段,用生理鹽水沖洗干凈后于4%多聚甲醛中固定24 h以上。

1.5 測定指標及方法

1.5.1 小腸形態結構將固定好的空腸和回腸組織樣品經脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、蘇木精-伊紅染色,用虛擬顯微鏡對染色的切片進行觀察、拍照。使用Image-Pro Plus 6.0軟件測量絨毛高度和隱窩深度,計算絨毛高度與隱窩深度的比值。

1.5.2 小腸黏膜抗氧化酶活性稱取0.2 g空腸和回腸黏膜樣品,與4 ℃預冷生理鹽水按 1∶9(質量/體積)的比例在冰浴條件下勻漿,然后于4 ℃、4 000 r·min-1離心10 min,取上清液保存于無菌離心管中待測。使用ELISA試劑盒檢測肉雞空腸和回腸黏膜中丙二醛(MDA)含量、總抗氧化能力(T-AOC)以及總超氧化物歧化酶(T-SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性。具體操作步驟按照說明書進行,試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.5.3 小腸黏膜免疫球蛋白和細胞因子濃度稱取0.2 g空腸和回腸黏膜樣品,與4 ℃預冷生理鹽水按 1∶9 的比例在冰浴條件下勻漿,然后于4 ℃、4 000 r·min-1離心10 min,取上清液保存于無菌離心管中待測。采用酶聯免疫試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司),利用雙抗夾心法測定空腸和回腸黏膜中分泌型免疫球蛋白A(sIgA)濃度以及空腸和回腸黏膜中白細胞介素1β(IL-1β)、白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素10(IL-10)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和干擾素γ(IFN-γ)的濃度。具體操作步驟按照說明書進行。

1.5.4 小腸黏膜緊密連接和抗氧化相關基因表達使用Trizol試劑(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)分別提取空腸和回腸黏膜中的總RNA。并用Nanodrop ND-2000分光光度計(賽默飛世爾科技有限公司)測定RNA濃度和純度。將符合標準的RNA稀釋到同一水平濃度后使用HiScript?Ⅲ All-in-one RT Super Mix for qPCR反轉錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)將RNA反轉錄成cDNA,置于-80 ℃保存。參照ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明書(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)進行qPCR反應體系的配制,用QuanStudio7 Flex熒光定量PCR儀(美國應用生物系統公司)進行熒光定量PCR反應。選用β-actin作為內參基因,使用2-ΔΔCT方法計算目的基因mRNA相對表達量[19]。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成,引物序列如表2所示。

表2 實時定量PCR引物序列Table 2 Primer sequences for RT-qPCR analysis

1.6 數據統計與分析

試驗數據用Excel 2019軟件處理,運用SPSS 26.0統計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA),用Duncan’] s進行多重比較。結果以平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 姜酚、百里香酚及其組合對肉雞小腸形態的影響

由表3和圖1可知：與Con組和Gin組相比,Gin+Thy組回腸絨隱比顯著提高(P<0.05),Gin+Thy組和Thy組回腸絨毛高度和Con組相比有增加的趨勢(P=0.063)。4個處理組空腸形態結構無顯著差異(P>0.05)。

圖1 各組肉雞空腸和回腸組織切片Fig.1 Jejunal and ileal tissue sections of broilers in each group

表3 姜酚、百里香酚及其組合對肉雞小腸形態的影響Table 3 Effects of gingerol,thymol and their combination on the small intestinal morphology of broilers

2.2 姜酚、百里香酚及其組合對肉雞小腸黏膜免疫球蛋白和細胞因子含量的影響

由表4可知：與Con組和Gin組相比,Gin+Thy組空腸和回腸黏膜中sIgA含量顯著提高(P<0.05)。與Con組相比,空腸黏膜中IL-6和IFN-γ的含量在Gin組、Thy組和Gin+Thy組中顯著降低(P<0.05),回腸黏膜中IL-6和IL-1β的含量在Thy組和Gin+Thy組中顯著降低(P<0.05),Thy組和Gin+Thy組回腸黏膜IFN-γ含量有降低的趨勢(P=0.054)

表4 姜酚、百里香酚及其組合對肉雞小腸黏膜免疫球蛋白和細胞因子含量的影響Table 4 Effects of gingerol,thymol and their combination on immunoglobulin and cytokines contents in the small intestinal mucosa of broilers

2.3 姜酚、百里香酚及其組合對肉雞小腸黏膜抗氧化酶活性的影響

由表5可知：Gin+Thy組空腸黏膜T-AOC和GSH-Px活性顯著高于Con組和Gin組(P<0.05);Gin+Thy組回腸T-AOC顯著高于Con組,Gin組、Thy組和Gin+Thy組回腸GSH-Px活性顯著高于Con組(P<0.05)。

表5 姜酚、百里香酚及其組合對肉雞小腸黏膜抗氧化酶活性的影響Table 5 Effects of gingerol,thymol and their combination on antioxidant enzyme activity in the small intestinal mucosa of broilers

2.4 姜酚、百里香酚及其組合對肉雞小腸黏膜抗氧化相關基因表達的影響

由圖2可知：Gin+Thy組空腸黏膜的Nrf2 mRNA相對表達量顯著高于Con組和Gin組,空腸黏膜的HO-1 mRNA相對表達量顯著高于Con組和Thy組,空腸黏膜的GPX4 mRNA相對表達量顯著高于Con組、Gin組和Thy組(P<0.05);Thy組和Gin+Thy組回腸黏膜的Nrf2 mRNA相對表達量顯著高于Con組和Gin組,Gin+Thy組回腸黏膜的SOD1和GPX4 mRNA相對表達量顯著高于Con組、Gin組和Thy組(P<0.05)。4個處理組空腸黏膜和回腸黏膜的的NQO1 mRNA相對表達量均無顯著差異(P>0.05)。

圖2 姜酚、百里香酚及其組合對肉雞小腸黏膜抗氧化相關基因表達的影響Fig.2 Effects of gingerol,thymol and their combination on expression of antioxidant related genes in the small intestinal mucosa of broilers

2.5 姜酚、百里香酚及其組合對肉雞小腸黏膜緊密連接相關基因表達的影響

由圖3可知：與Con組相比,Gin+Thy組空腸和回腸黏膜中的OccludinmRNA相對表達量顯著提高(P<0.05),并且Gin+Thy組回腸黏膜中的OccludinmRNA相對表達量顯著高于Gin組和Thy組(P<0.05)。4個處理組空腸黏膜和回腸黏膜的ZO-1和Claudin-1 mRNA相對表達量均無顯著差異(P>0.05)。

圖3 姜酚、百里香酚及其組合對肉雞小腸黏膜緊密連接相關基因表達的影響Fig.3 Effects of gingerol,thymol and their combination on expression of tight junction related genes in the small intestinal mucosa of broilers

3 討論

空腸和回腸是養分吸收的重要場所,完整的形態結構是其高效發揮生理功能和進一步促進動物生長所必需的條件。絨毛高度和隱窩深度分別是腸道消化和吸收功能以及細胞成熟率的主要指標,絨毛高度/隱窩深度綜合反映了小腸的功能狀態,比值上升表示腸道消化吸收能力提高[20]。研究表明,日糧添加100 mg·kg-1植物精油(百里香酚有效含量為10%)顯著提高了肉雞空腸絨毛高度[21],而40 g·kg-1干姜粉(總多酚含量為2.7%)顯著提高了84日齡珍珠雞十二指腸和回腸絨毛高度,并顯著降低了十二指腸和回腸隱窩深度[22]。在本研究中,姜酚和百里香酚組肉雞回腸絨毛高度和對照組相比有增加的趨勢,且肉雞回腸絨隱比顯著高于對照組和姜酚組。這表明姜酚和百里香酚組可以通過提高小腸絨毛高度和絨隱比來改善腸道組織形態,提高肉雞腸道的消化吸收功能。

腸道sIgA含量以及促炎和抗炎等細胞因子含量可在一定程度上反映機體免疫功能高低。sIgA是一種主要分布在腸道黏膜層的免疫球蛋白,充當保護腸腔免受抗原和病原體侵害的第一道防線,是家禽體液免疫的主效應因子[23]。動物腸道黏膜免疫功能常與細胞因子調控的炎癥反應有關。姜酚和百里香酚具有免疫調節作用：日糧添加15 g·kg-1生姜通過增強免疫細胞殺菌活性、降低NO水平和調節細胞因子表達發揮先天免疫調節作用[24];在肉仔雞日糧中添加姜粉可提高淋巴細胞轉化率,增加肉仔雞血液中粒細胞和中間細胞數,從而提高肉仔雞的免疫性能[25];Liang等[26]在體外試驗發現,百里香酚可通過干擾NF-κB和MAPK信號通路的激活,抑制TNF-α和IL-6的表達,發揮抗炎作用。本試驗結果表明,姜酚和百里香酚組能顯著提高肉雞空腸和回腸黏膜中sIgA含量,顯著降低空腸黏膜中IL-6和IFN-γ含量和回腸黏膜中IL-6和IL-1β含量,表明姜酚和百里香酚組合能夠通過提高免疫球蛋白含量和降低促炎細胞因子的產生對肉雞細胞免疫和體液免疫產生明顯的免疫調節作用,從而提高肉雞小腸免疫功能。姜酚與百里香酚組合使用的效果優于單獨添加姜酚或百里香酚,這可能是由于姜酚的生物利用度較低,而百里香酚與姜酚配合能夠提高姜酚的利用率,具體機制還需要進一步研究。

機體正常代謝產生的適量氧自由基(ROS)對機體無害甚至有益,在多種生理過程中發揮作用,然而ROS產生過量會破壞機體正常秩序及生理代謝。動物機體中的一些關鍵抗氧化酶(如SOD、GSH-Px和CAT)和非酶抗氧化物(如GSH)共同調控保護細胞免受氧化應激損傷[27]。T-AOC反映總體的抗氧化能力,SOD可清除過量超氧陰離子自由基,GSH-Px能催化過氧化氫分解,均可降低ROS的水平[28]。有研究表明,姜酚的抗氧化活性與其分子結構中的酚羥基和β-羥基酮有關[29]。Masuda等[30]研究發現姜酚不僅能夠提供電子,對自由基進行清除,還能夠加強抗氧化物質與底物的親和性,這可能是姜酚具有抗氧化活性的原因。百里香酚所含有的酚羥基可以作為氫供體與過氧自由基結合,阻斷氧化鏈式反應[31],其以濃度依賴性方式顯示出強效的超氧陰離子、羥基自由基和DPPH自由基清除和還原能力,并能保護脂質免受氧化損傷[10]。在本研究中,姜酚和百里香酚組合能顯著提高空腸和回腸黏膜中T-AOC和GSH-Px活性,此結果與前人研究結果一致[32-33]。從分子生物學角度看,抗氧化酶活性的提高與基因轉錄有關。Nrf2是機體抗氧化系統中關鍵的核轉錄因子,通過與抗氧化元件的結合誘導SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶的表達以及GSH的合成[34]。本研究中,姜酚和百里香酚組合可顯著上調肉雞空腸黏膜Nrf2、HO-1、GPX和回腸黏膜Nrf2、SOD1、GPXmRNA相對表達量,說明姜酚和百里香酚可通過調節Nrf2信號通路提高腸道內抗氧化酶活性,從而提高肉雞的抗氧化能力。

腸上皮細胞間緊密連接結構是腸黏膜物理屏障的重要結構基礎。閉合蛋白(Occludin)是腸道緊密連接蛋白的組成成分之一,其丟失將導致細胞旁大分子的滲透性增加[35]。研究表明,姜酚通過提高ZO-1、OccludinmRNA表達來恢復DSS誘導的結腸炎小鼠的腸道屏障[36];而百里香酚可通過劑量依賴的方式提高產氣莢膜梭菌攻毒肉仔雞回腸黏膜中OccludinmRNA表達[13]。與前人研究一致,本研究結果顯示,姜酚和百里香酚組合可顯著提高肉雞空腸和回腸黏膜中OccludinmRNA相對表達量,且回腸黏膜中OccludinmRNA相對表達量顯著高于單一植物提取物組,表明日糧添加姜酚和百里香酚可改善肉雞腸道屏障功能。此外據報道,促炎因子IL-1β、IL-6、IL-8可通過調節細胞骨架蛋白的重組,直接導致緊密連接蛋白的重排,從而破壞屏障功能,TNF-α則會顯著破壞緊密連接蛋白的表達和分布[37-38]。腸道氧化應激也會干擾緊密連接蛋白組裝,破壞腸上皮屏障功能[39]。本研究表明,姜酚和百里香酚組合能夠降低促炎因子的產生并增強腸道抗氧化能力。因此,姜酚和百里香酚組合改善肉雞腸道屏障功能可能與其能夠增強腸道免疫功能和腸道抗氧化能力有關。

綜上所述,日糧添加姜酚和百里香酚能改善肉雞的空腸和回腸形態結構,提高小腸抗氧化能力和免疫功能,有助于改善腸黏膜屏障功能。姜酚和百里香酚組合的效果優于單一成分的姜酚或百里香酚,二者具有較好的組合效應。