強直性脊柱炎患者骶髂關節MRI炎癥與外周血淋巴細胞的相關性

涂柳丹, 楊明燦, 魏秋靜, 王曉紅, 林楚榮, 古潔若

中山大學附屬第三醫院風濕免疫科、廣東省免疫疾病臨床醫學研究中心(廣東廣州 510630)

強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一種免疫介導的累及骶髂關節和脊柱的慢性炎癥性疾病,其發病機制至今尚未明確。既往研究認為與基因、環境因素等因素密切相關,而先天性免疫和獲得性免疫失衡在AS的發病中也起到不容忽視的作用[1]。已有相關研究表明AS患者外周血淋巴細胞亞群失衡是AS發病機制之一,其中Th17/Tregs細胞及Th1/Th2比例的失衡與AS的發病機制相關[2],Th17細胞分泌的IL-17導致大量促炎癥因子的分泌,從而加重AS的炎癥反應。隨著國際ASAS組織發布了新的中軸型脊柱關節炎分類標準[3],把骶髂關節MRI骨髓水腫作為主診斷之一,實現了脊柱關節炎的影像學診斷從X線到MRI的跨越,使得患者的早期診斷、早期治療成為可能,極大地改善了患者的預后。炎癥作為AS的重要特點之一,除了表現為炎癥指標的升高和MRI骨髓水腫外,可引起外周血免疫細胞的失衡。而生物制劑治療后隨著疾病癥狀、炎癥指標及MRI骨髓水腫改善的同時伴隨著外周血淋巴細胞亞群的改變。因此,骶髂關節炎癥與外周血淋巴細胞亞群的變化可能存在一定的關聯,外周血淋巴細胞亞群分析在AS的疾病活動度、炎癥及治療反應的預測可能有潛在的應用價值。目前暫無研究探討AS患者骶髂關節MRI炎癥與外周血淋巴細胞亞群之間的關系。因此,本研究通過對AS患者和健康對照外周血中免疫細胞亞群的分析,并比較骶髂關節MRI炎癥與免疫細胞亞群失衡的關系,探討MRI炎癥與免疫細胞亞群之間的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2020—2021年期間在我院就診的AS患者42例為研究組,并選取同期在我院體檢的年齡及性別匹配的健康人群57例作為對照組。

納入標準:(1)符合1984年修訂的紐約標準,診斷為AS;(2)年齡超過18歲,自愿參與研究并簽署知情同意書;(3)近3個月未接受任何生物制劑治療。

排除標準:(1)合并其他免疫相關性疾病和風濕性疾病;(2)妊娠期或哺乳期患者;(3)近3個月接種過疫苗或發生任何部位的感染。

本研究經本院醫學倫理委員會審查通過(中大附三醫倫[2020]02-031-01),所有患者及健康對照均簽署知情同意書。

1.2 淋巴細胞亞群檢測 清晨空腹狀態下用肝素鈉抗凝管采集患者及健康對照者外周血5 mL用于淋巴細胞檢測。用流式細胞術進行外周血40種免疫細胞的免疫表型檢測,包括28種T淋巴細胞和12種B淋巴細胞。根據說明書將全血加入熒光標記抗體(CD3-PerCP-Cy5.5、CD4-APC-H7、CD8-BV510、CD127-BV421、CD25 L-PE、CD45RAL-FITC、CCR7-AF647、CD28-PE-Cy7、CD3-APCH7、CD4-PE-Cy7、CD8-PerCP-Cy5.5、CD183-Alexa488、CD196-BV510、CD185-Alexa647、CD194-BV421和CD279-PE用于T細胞亞群檢測;CD24L-PE和CD21-PE-Cy7用于B細胞亞群檢測) 的面板中進行孵育,室溫黑暗條件下孵育15 min。待紅細胞溶解并離心后,用磷酸鹽緩沖鹽水懸浮液進行流式細胞儀分析。

1.3 AS患者骶髂關節MRI的炎癥評分 由2名獨立的放射科醫生進行影像學評分,放射科醫生對臨床資料設盲,取平均分進行統計分析。采用加拿大脊柱關節炎研究聯盟(Spondyloarthritis Research Consortium of Canada, SPARCC)炎癥評分進行評估。選取骶髂關節MRI中T2加權序列和STIR序列進行評估,以椎骨中心的骨髓信號作為正常信號的參考。最大總評分為72: 出現“骨髓水腫”=48,出現“強水腫”=12,出現“深水腫”=12。評分方法分為以下步驟:(1)所有評分分成兩種:有或無。(2)僅選擇6個連續斜冠狀層進行評分,第4～9層面通常能顯現骶髂關節最大的滑膜部分。第2個時間點的評分層面水平盡量與第1個時間點的相同,通常選擇4～9、3～8或5～10層。(3)僅對STIR序列中的異常進行評分。T1SE圖像作為解剖學參考。(4)對髂骨的所有病變進行評分。在骶骨側,一般對遠離骶骨骶前孔的側邊的病變評分。(5)以骶骨椎前孔間的骨髓信號作為正常信號的參考。(6)每側骶髂關節按關節面和關節面的垂直線分成4個象限:上骶骨側、下骶骨側、上髂骨側、下髂骨側。記錄每個象限的信號增加情況。每個冠狀層面的兩側骶髂關節的最大評分是8。6個層面的最大評分是48。(7)對每層每側骶髂關節進行“強度”評分。在對骨病變進行“強度”評分時以骶骨旁靜脈里緩慢流動的靜脈血的高信號為參考。如果在每側骶髂關節的任何象限中觀察到“強”信號,評1分。每個層面的最大評分為2,6個層面的最大評分為12。(8)對每層每側骶髂關節進行“深度”評分。如果距關節表面至少1 cm的深度內出現均勻的明確的信號增加,則病變分級為“深”。如果在單層一側骶髂關節的任何象限中觀察到“深”信號,評分為1。每個層面的最大評分為2,6個層面的最大評分為12。

1.4 病情活動度的評估 采用Bath強直性脊柱炎活動性指數(BASDAI)評估AS患者的疾病活動度,總分為0～10分,分數越高表示病情越活動。采用Bath強直性脊柱炎功能指數(BASFI)評估AS患者的綜合功能狀況,總分為0～10分,分數越高表示功能越差。AS疾病活動度評分(ASDAS)是ASAS推薦的復合評分系統,綜合患者的主觀評價和實驗室指標,ASDAS-CRP的計算公式為0.121×腰背痛(BASDAI第2項)+0.058×晨僵時間(BASDAI第6項)+0.11×患者總體評價+0.073×外周關節疼痛或腫脹(BASDAI第3項)+0.579×Ln(CRP+1)。

1.5 統計學方法 對符合正態分布的計量資料采用均數±標準差表示,兩組間均數比較采用t檢驗,同組治療前后比較采用配對t檢驗;不符合正態分布的計量資料采用中位數(四分位數間距)[M(P25,P75)]表示,采用秩和檢驗比較兩組差異;計數資料采用百分比表示,采用2檢驗。所有數據均采用STATA 16.0軟件分析,P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 入組患者及對照組的人口學特點及病情特點 本研究共納入42例AS患者和年齡及性別匹配的健康對照57例。AS患者年齡為(32.09±1.72)歲,其中男35例(83.33%),病程(8.86±8.09)年,BASDAI及ASDAS-CRP均值分別為3.11±1.72和2.45±0.91。對照組男性占比為70.18%,年齡為(35.61±1.39)歲,兩組的年齡及性別差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 研究組與對照組T淋巴細胞百分比差異 與對照相比,研究組的殺傷T細胞(Tc)比例升高,而雙陽性T細胞比例下降,兩組間差異有統計學意義(P<0.05)(表1)。不同亞類的CD4+T細胞比例在研究組和對照組間差異無統計學意義(P>0.05)。在CD8+T細胞中,AS患者外周血初始化CD8+T細胞(CD3+CD8+CD45RA+CCR7+)及持續表達病毒特異性CD8+T細胞比例較健康對照升高,而終末分化CD8+T細胞和非活躍期特異性終末分化CD8+T細胞比例較健康對照降低(P<0.05)。在T輔助細胞(Th)中和濾泡輔助T細胞(Tfh)中,AS患者的Th17細胞、Tfh17細胞及Th17/Th2比例顯著高于健康對照,Th1和Tfh1細胞低于健康對照(P<0.05)。

表1 強直性脊柱炎患者與健康對照不同T細胞比例的差異 M(P25,P75)

2.3 研究組與對照組B淋巴細胞百分比差異 研究組患者的B細胞比例與對照組差異無統計學意義(P>0.05)。在不同B淋巴細胞亞型中,研究組患者的經典轉換性B細胞比例高于對照組,而幼稚B細胞、漿細胞、記憶性B細胞、未成熟的調節性B細胞及轉換B細胞的比例顯著低于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 強直性脊柱炎與對照組不同B細胞比例的差異 M(P25,P75)

2.4 AS患者骶髂關節炎癥與外周血淋巴細胞亞群的關系 通過SPARCC評分評估AS患者的骶髂關節MRI炎癥水平,將SPARCC≥2作為定義炎癥的分界點,分為炎癥組和無炎癥組。炎癥組患者的年齡及病程顯著低于無炎癥組,C反應蛋白(CRP)和ASDAS水平高于無炎癥組,兩組在BASDAI、BASFI方面差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。兩組患者的B淋巴細胞亞群和CD8+T細胞亞群差異無統計學意義(P>0.05)。在CD4+T細胞亞群中,炎癥組患者的幼稚CD4+T細胞比例高于無炎癥組,而衰竭CD4+T細胞、功能性CD4+T細胞和效應性記憶CD4+T細胞低于無炎癥組(圖1)。

表3 AS患者骶髂關節MRI炎癥 M(P25,P75)

圖1 AS患者骶髂關節MRI炎癥與CD4+T細胞亞群的關系

3 討論

既往研究表明AS的發病與HLA-B27、細胞免疫、腸道微生物等密切相關,其中IL-17/IL-23軸的異?；罨cAS特異性肌腱端炎相關[4],在一定程度上可以解釋AS炎癥、異常骨化和骨質丟失[5]。IL-17/IL-23軸的異?；罨婕岸喾N免疫細胞和細胞因子的相互作用。幼稚CD4+T細胞在不同的條件下可分化為Th細胞、Treg細胞等,IL-23對Th細胞分化為Th17表型至關重要,而Th17細胞可分泌IL-17、IL-22、GM-CSF和TNF等細胞因子[6]。其中IL-17A是一種強力促炎細胞因子,可通過介導間充質干細胞產生RANKL和促進破骨細胞表面的RANK的表達介導骨侵蝕。Th17細胞比例及促進Th17細胞增殖及分化的細胞因子在AS患者中均顯著升高,靶向IL-17A的拮抗劑在AS的治療中起到良好的治療效果,從另一方面驗證了Th17細胞及其相關細胞因子在AS發病中的重要性。HLA-B27基因被認為與AS發病關聯最密切的基因,人群中AS的發病率與HLA-B27陽性率相關。HLA-B27陽性與陰性AS患者淋巴細胞亞群比例差異無統計學意義,而HLA-B2705型AS患者T%、Th%、Th/Ts顯著升高,B1%、NK%顯著低于HLA-B2704型患者[7]。因此,T淋巴細胞異?；罨?、淋巴細胞亞群比例失衡及細胞免疫功能異常在AS的發病機制中起到重要作用[8]。研究發現AS患者外周血和關節中致病性Th17、Th22細胞和分泌IL-17的γδ細胞異常升高。最近的一項Meta分析納入4 020例AS患者和3 065例健康對照,發現AS患者的T細胞、NK細胞和NKT細胞與健康對照無明顯差異,而B細胞顯著高于健康對照。在T細胞亞群中,CD4+T細胞、Th17細胞、T輔助細胞及Th1/Th2比例顯著升高,而Treg細胞比例下降[9]。Treg細胞有負性調節作用,通過抑制效應性T細胞來實現外周免疫耐受,有研究顯示AS患者外周血Th17/Treg比例升高,而經TNFi有反應的患者中,觀察到Th17細胞比例下降,Treg比例升高[10]。本研究中發現AS患者CD8+T細胞亞群和B淋巴細胞亞群與健康對照存在差異,提示AS患者免疫功能存在一定程度的紊亂,包括細胞免疫和體液免疫功能失衡,可能在AS的發生發展中起到一定的作用。此外,T輔助細胞中,AS患者Th17比例升高,Th1比例下降,與既往研究[11]相符,同時也驗證了Th17細胞在AS發病機制中的重要作用。

炎癥及異常骨化是AS病程中兩個重要的過程,且炎癥與骨化有一定的關聯,炎癥可通過多種信號通路促進骨化。炎癥指標如CRP和紅細胞沉降率可作為AS進展的預測因子,而脊柱MRI椎角炎癥較無炎癥椎體更容易產生新發骨贅。既往研究表明慢性系統性炎癥可引起血細胞水平變化,AS患者外周血淋巴細胞亞群的失衡被認為與疾病活動度顯著相關[12-13]。一項在早期脊柱關節炎患者進行的研究發現,CT引導下骶髂關節穿刺的組織病理學提示T細胞和巨噬細胞是活動性骶髂關節炎中最常見的細胞,提示T細胞浸潤在AS骶髂關節炎中起到重要作用[14]。然而MRI骨髓水腫與組織病理學炎癥并非完全一致,有研究[15]探討脊柱組織病理學間質單核細胞浸潤和骨髓水腫的關系,病理發現CD3+、CD4+、CD8+T細胞及CD20+B細胞在局部組織浸潤,但8例患者中僅3例的關節突關節組織病理學炎癥與MRI骨髓水腫相符。另一項研究采用髖關節Bath強直性脊柱炎放射學指數和強直性脊柱炎脊柱放射學評分來評估新骨形成,發現AS患者中新骨形成與MRI炎癥呈反比,新骨形成患者中Th17比例和Treg比例高于無新骨形成患者,Th17/Treg比例低于無新骨形成患者[16]。這提示MRI炎癥、新骨形成伴隨著外周血淋巴細胞亞群比例失衡。已有充分的數據證明TNFi治療能有效改善AS患者骶髂關節MRI炎癥[17]。兩項研究表明AS患者經TNFi或IL-17A抗體治療后,在改善炎癥指數的同時,外周血淋巴細胞亞群失衡得以改善[10, 18]。本研究發現MRI炎癥與外周血B淋巴細胞和CD8+T細胞亞群比例無關,而炎癥組患者的幼稚CD4+T細胞比例高于無炎癥組,衰竭CD4+T細胞、功能性CD4+T細胞和效應性記憶CD4+T細胞低于無炎癥組。這提示MRI炎癥與外周血淋巴細胞亞群存在一定的關聯,而靶向腫瘤壞死因子-α或IL-17A的治療能否同時改善MRI炎癥和淋巴細胞失衡,需要后續研究來進一步揭示MRI炎癥與淋巴細胞亞群失衡之間更進一步的關系。

綜上所述,AS患者外周血淋巴細胞亞群分布異常,存在細胞免疫和體液免疫功能紊亂,伴骶髂關節MRI炎癥的患者CD4+T細胞比例與無炎癥的患者存在差異,這提示炎癥在不同的層面上參與到AS的發病中。

利益相關聲明:所有作者聲明無可能影響研究結果的非財務沖突關系,或可能影響本文研究結果和討論的競爭利益。

作者貢獻說明:涂柳丹直接參與本論文的試驗設計、研究實施、數據采集、統計分析,論文起草、研究經費的獲得和批評性審閱;楊明燦參與試驗設計、患者隨訪、數據收集、統計分析及論文起草及修改;魏秋靜參與患者隨訪、數據收集、統計分析及論文起草及修改;王曉紅參與閱片、統計分析及論文起草及修改;林楚榮參與閱片、統計分析及論文起草及修改;古潔若提供技術支持,對論文的內容進行批評性審閱,對論文進行指導和支持。