伏立康唑TPGS-Cremophor EL眼用納米膠束的制備及體外抗白色念珠菌評價

曾 甜 王欣宜 彭 澳 劉 雪 文寶程 王凱月 田寶成

濱州醫學院藥學院藥劑學教研室 山東 煙臺 264003

真菌性角膜炎是一種嚴重威脅視力的疾病,不僅給患者帶來較大的經濟壓力,而且存在高致盲和失明的可能性[1]。真菌是角膜炎的重要誘因之一,白色念珠菌是真菌性眼內炎最常見的病原體。局部或全身免疫抑制是酵母菌感染的主要危險因素[2],目前念珠菌是醫院獲得性感染最重要的病原體之一,特別是在身體虛弱或免疫功能低下的患者中[3]。在眼科中,酵母菌感染在眼表疾病和免疫抑制下更為普遍,并且通常對常規治療更有抵抗力。

伏立康唑(voriconazole,VRC)是一種廣譜的三唑類抗真菌藥物,已被批準用于治療侵襲性念珠菌病、侵襲性曲霉病及由尖孢梭菌和鐮刀菌引起的真菌感染[4]。然而,VRC引起一些不良反應[5],包括發熱、視覺障礙、惡心、嘔吐、皮疹、腹痛等,同時也存在水溶解度有限、生物利用度低等問題[1],且白色念珠菌對VRC的耐藥性增加[6]。

膠束是通過表面活性劑/兩親性聚合物在超過臨界膠束濃度的水體系中自發自組裝而形成的納米結構。近年來,由兩種或多種不同嵌段共聚物或表面活性劑組成的混合膠束作為一種新型給藥系統備受關注。這些載體比它們的單組分載體更有優勢,例如更大的熱力學和動力學穩定性以及更高的包封低水溶性藥物的能力[7]。Albayaty[8]等制備包載有伊曲康唑的pH響應型納米膠束對白色念珠菌生物膜具有很高的親和力,能顯著抑制白色念珠菌生物膜的活性。

α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(alpha-tocopheryl polyethylene glycol succinate,TPGS)是美國食品藥品監督管理局批準的水溶性安全藥用輔料之一。TPGS是維生素E的水溶性形式,有助于增強藥物在納米顆粒遞送中的包封作用,改善細胞攝取,增強治療效果,延長循環時間,提高口服生物利用度[9]。TPGS不僅可以作為分子生物材料增強藥物通過細胞膜的滲透性,而且作為P-糖蛋白的抑制劑和底物可顯著減少藥物的外排[10]。

本研究旨在設計負載VRC的TPGS和聚氧乙烯蓖麻油EL混合膠束,以增加VRC的溶解度、改善滲透性和吸收,從而提高其生物利用度及抗菌效果,并在一定程度降低VRC自身的毒副作用,并對納米膠束進行了詳盡的性質表征,包括粒徑、Zeta電位及形貌特征等,還對其體外安全性、細胞攝取能力、細胞攝取途徑和體外抗菌性能進行了評價。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 白色念珠菌野生型菌株C.albicanSC 5314。

1.1.2 細胞 人永生化角膜上皮細胞(human corneal epithelial cells,HCE-T,BNCC341100)由北京北納創聯生物技術研究院提供。

1.1.3 藥物與試劑 VRC(武漢維斯爾曼生物工程有限公司,純度為99%);TPGS(TCI上?；晒I發展有限公司);聚氧乙烯蓖麻油EL(美國Sigma公司);鹽酸氯丙嗪(Chlorpromazine, 北京百靈威科技有限公司);阿米洛利(Amiloride,大連美倫生物技術有限公司);甲基-β-環糊精(北京索萊寶生物科技有限公司);疊氮化鈉(Sodium azide,天津市凱信化學工業有限公司);香豆素6(美國Sigma公司);CCK-8試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司);H-DMEM高糖培養基(普諾賽生物科技有限公司);胎牛血清EDTA-胰蛋白酶消化液(普諾賽生物科技有限公司);YPD Broth 培養基(青島海博生物技術有限公司);YPD Agar培養基(青島賓德生物有限公司);受精雞蛋(湖北荊門桃園生態養殖廠)。

1.1.4 儀器 Nano ZS90納米激光粒度分析儀購自英國Malvern公司;JEM-1400透射電子顯微鏡購自日本電子株式會社;Agilent 1260高效液相色譜分析儀購自安捷倫科技有限公司;Synergy H2酶標儀購自美國賽默飛公司;BDCanto II流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯-聚氧乙烯蓖麻油EL/伏立康唑納米膠束(TPGS-EL/VRC)的制備 通過薄膜水化法制備TPGS-EL/VRC、TPGS-EL。按照不同組成比例稱取VRC、TPGS及EL置于茄形瓶,并加入適量二氯甲烷及乙醇超聲、溶解,然后用旋轉蒸發儀于50 ℃條件下除去有機溶劑,直至形成干燥的薄膜。用雙蒸餾水在水浴中水化干燥薄膜即得。香豆素6負載膠束是通過用香豆素6代替VRC來配制的,用于細胞實驗研究。制備方法與TPGS-EL/VRC相同。

1.2.2 粒徑與Zeta電位測定 利用Zetasizer測量了新制備膠束的平均粒徑[11]。用同一儀器在室溫下測定納米膠束的Zeta電位。在不稀釋樣品的情況下進行測量,并重復3次。

1.2.3 形貌特征考察 采用透射電鏡考察了TPGS-EL/VRC膠束的形貌特性。將TPGS-EL/VRC滴于用碳涂層的銅網上,然后用1%磷鎢酸對進行負染色,然后晾干得到薄膜。進行透射電鏡觀察并拍照。

1.2.4 載藥量與包封率測定 采用高效液相色譜法測定納米膠束中VRC的含量。將2.0 mL的TPGS-EL/VRC納米膠束加入到超濾離心管中,6 000 rpm離心15 min后,濾液用甲醇稀釋后,使用高效液相測定藥物濃度。根據公式1和公式2計算VRC的載藥量(DL%)和包封率(EE%)。

(公式1)

(公式2)

1.2.5 細胞學研究

1.2.5.1 HCE-T細胞培養 在DMEM培養基中添加1%青霉素/鏈霉素和10%胎牛血清作為HCE-T細胞培養基。細胞在37 ℃、95%濕度、5% CO2條件下孵育。隔天換液,細胞用0.25%胰蛋白酶/EDTA溶液傳代培養。

1.2.5.2 細胞毒性試驗 采用CCK-8法評估載體材料和載藥制劑對HCE-T細胞的細胞毒性。將細胞以1×104個細胞/孔的密度接種于96孔板中,在37 ℃下培養過夜,然后加入不同組成比例的TPGS-EL混合材料和負載不同濃度藥物的TPGS-EL/VRC制劑,培養4 h。最后,每孔加入10 μg/mL CCK-8試劑,繼續培養1 h。使用酶標儀在450 nm處測定吸光度。

1.2.5.3 細胞攝取能力評價 使用流式細胞儀定量評估TPGS-EL納米膠束對HCE-T細胞攝取能力的影響[12]。在6孔板中培養5×105個HCE-T細胞/孔2 d,然后分別加入200 μL的制劑,在37 ℃下孵育2 h。然后用PBS緩沖溶液沖洗2次,胰酶消化后再次離心,再次用PBS緩沖液沖洗后離心,重復3次。在實驗結束時再次離心細胞,用450 μL PBS重懸,通過流式細胞儀在FITC通道中使用488 nm的綠色激光激發波長和525 nm的發射波長測定。

1.2.5.4 細胞攝取途徑 采用香豆素6(C6)替代VRC制備載C6的TPGS-EL納米膠束,將細胞接種于6孔板(5×105個細胞/孔),37 ℃、5% CO2條件下孵育48 h,然后在37 ℃條件下將細胞與H-DMEM、疊氮化鈉、阿米洛利、甲基-β環糊精、氯丙嗪預孵育1 h后,向每孔中加入200 μL的C6標記TPGS-EL納米膠束并孵育2.5 h后,按照“1.2.5.3項”中的方法處理細胞,使用流式細胞術評估短期孵育后納米載體的攝取情況。結果表示為相對熒光強度,所有檢測均為一式三份。

1.2.6 雞胚尿囊膜試驗 雞胚絨毛尿囊膜(chorioallantoic membrane,CAM)已被描述為活體動物眼睛體內試驗的另一種血管生成模型[13]。CAM具有廣泛的毛細血管床,是一種有效且容易獲得的視網膜模型。使用雞胚絨毛尿囊膜(hen′s egg test-chorioalantoic membrane,HET-CAM)來作為模擬藥物對眼粘膜血管及結締組織的刺激性的潛在方法[14]。將受精雞蛋放置在孵化箱中孵化8 d后,大頭朝上,用鑷子暴露出CAM,用生理鹽水浸潤內膜,直至內膜浸濕。滴入100 μL TPGS-EL/VRC的膠束溶液于CAM,立即觀察血管5 min,記錄有無充血、出血和凝血現象及其出現時間以評價對CAM的刺激性,并拍攝圖像。以生理鹽水和0.1 M NaOH分別為陰性對照和陽性對照。

1.2.7 體外抗菌作用評價

1.2.7.1 白色念珠菌的制備 挑取白色念珠菌野生型菌株C.albicanSC 5314于YPD瓊脂平板上,置于30℃,培養24 h長出白色念珠菌單菌落,于4℃保存備用。

1.2.7.2 抑菌環試驗 在30℃ 的YPD瓊脂培養基表面鋪上100 μL白色念珠菌懸液(5×103CFU/mL)。在瓊脂平板表面上放置無菌濾紙,滴加10 μL的TPGS-EL/VRC和SOL/VRC,30℃孵育24 h,隔天進行抑菌環半徑的測量。

1.2.7.3 體外抗真菌活性試驗 將白色念珠菌稀釋至1×105CFU/mL鋪在96孔板上,以0.04、0.03、0.02、0.015、0.01 μg/mL藥物濃度給藥,30℃孵育12 h,使用酶標儀在600 nm處測得吸光度值。

2 結果

2.1 TPGS-EL/VRC的表征

2.1.1 粒徑與Zeta電位 TPGS-EL/VRC納米膠束的的粒徑為(109.63±0.25)nm,Zeta電位為(-29.3±0.20)mV,見圖1。

圖1 TPGS-EL/VRC納米膠束的粒徑(左)及Zeta電位(右)

2.1.2 形貌特征 利用TEM觀察TPGS-EL/VRC納米膠束的形貌如圖2所示,所制備載藥膠束形態接近球形且分布較為均勻,無聚集現象。粒子直徑在100 nm左右,與激光粒度儀測定結果較為一致。

圖2 TPGS-EL/VRC納米膠束的TEM圖

2.1.3 載藥量與包封率 建立VRC的標準曲線方程為A=28.605C-1.360 2 (r2=0.999 4),見圖3。這表明,VRC在0～15 μg/mL濃度范圍內與峰面積呈良好的線性。所測得納米膠束的包封率為71.67%,載藥量為10.27%。這說明,TPGS-EL混合膠束對VRC能夠較好地進行負載。

圖3 VRC的濃度與峰面積線性關系

2.2 細胞毒性試驗 CCK-8法評價不同濃度載藥制劑和材料的細胞毒性結果見圖4。與對照組比較,當混合膠束中載體材料EL∶TPGS的質量比為3∶1時,HCE-T細胞存活率最高,即載體的細胞毒性最小。因此,本研究采用EL∶TPGS=3∶1的組成作為納米膠束的載體處方。以此比例負載藥物VRC的納米膠束的細胞毒性考察結果見圖4。結果顯示,在0～100 μg/mL藥物濃度范圍內,細胞存活率均大于80%。這說明,在此藥物濃度范圍TPGS-EL/VRC膠束制劑未產生明顯的HCE-T細胞毒性,眼部應用的安全性較好。

圖4 TPGS-EL空白膠束(左)及TPGS-EL/VRC載藥膠束(右)的細胞毒測定結果

2.3 細胞攝取能力評價 通過流式細胞術考察TPGS-EL納米膠束對細胞內藥物遞送的促進作用,結果見圖5。TPGS-EL納米膠束組處理的細胞內平均熒光強度值為10 768,是溶液組平均熒光強度的5.8倍(P<0.001)。這說明,TPGS-EL納米膠束顯著提高了熒光探針C6的HCE-T細胞內遞送。這是由于使用TPGS修飾納米顆粒表面能夠增加納米顆粒與細胞的粘附,從而提高細胞對藥物的攝取[15]。這證明TPGS-EL納米膠束的促滲透能力。

與SOL組比較,***P<0.001。

2.4 細胞攝取途徑 采用流式細胞儀進行評估TPGS-EL納米膠束的入胞機制,對照組不進行任何處理,直接與材料進行孵育。疊氮化鈉是一種ATP酶抑制劑,從而干擾能量依賴性內吞過程[16]。結果見圖6,與對照組比較,經過疊氮化鈉處理后的細胞攝取率明顯下降(P<0.05)。這表明,細胞攝取過程受到了疊氮化鈉的抑制,納米膠束的入胞過程具有一定程度的能量依賴性,即存在主動攝取。

與對照組比較,*P<0.05。

2.5 CAM試驗 為了進一步考察納米膠束的生物相容性,采用HET-CAM來進行試驗。圖7為對照組和測試制劑在CAM上的血管反應結果。CAM暴露于0.1 M NaOH溶液30 s后出現大片出血點,2 min左右血管呈現楓葉狀凝血。而生理鹽水和TPGS-EL/VRC納米膠束組5 min后,雞胚CAM并未出現溶血現象,血管形態正常。根據文獻[17]中評分標準進行判定,0.1 M的NaOH溶液顯示出嚴重的刺激性,而生理鹽水和TPGS-EL/VRC納米膠束沒有刺激性。這表明,TPGS-EL/VRC為 CAM的非刺激性物,進一步證明其生物安全性高。

圖7 雞胚絨毛尿囊膜刺激性實驗圖片

2.6 抑菌環試驗 采用紙片法研究TPGS-EL/VRC對白色念珠菌的抑菌活性,結果見表1,其典型平板見圖8。在考察的VRC 5～10 μg/mL濃度范圍,TPGS-EL/VRC組的抑菌半徑均明顯大于SOL/VRC組。TPGS-EL/VRC組在5 μg/mL藥物濃度的抑菌環半徑為(13.16 ± 0.28)mm,而SOL/VRC組在5 μg/mL藥物濃度的抑菌環半徑為(9.66 ± 0.57)mm。這表明,在低藥物濃度時,TPGS-EL/VRC組的抗菌效果比SOL/VRC組好(P<0.001),這證實了所設計TPGS-EL納米膠束對抗菌藥物VRC的高效遞送性能。這可能是TPGS可在水中自組裝成膠束,提高難溶性藥物的溶解度和生物利用度[18],此外,TPGS 作為P-糖蛋白抑制劑,能夠抑制P-糖蛋白外排轉運[19],從而增加藥物的療效。

表1 抑菌環試驗結果

圖8 抑菌環測試圖片

2.7 體外抗真菌活性試驗 為了驗證TPGS-EL/VRC的體外抑菌效果,進行抑菌率試驗,結果見圖9。在0.01～0.04 μg/mL濃度范圍內,TPGS-EL/VRC組抑菌效果均明顯高于SOL/VRC組(P<0.01或<0.001)。且隨著VRC濃度增加,兩組的抑菌率均增加。即使在0.015 μg/mL藥物濃度時,混合膠束組的抑菌率為66%,而溶液組只有12%的抑菌率,制劑組的抑菌率是溶液組的5倍高。這說明,在VRC藥物低濃度下,TPGS-EL納米膠束組依然發揮較好的抗菌效果,這與抑菌環試驗結果相一致,也預示了所設計TPGS-EL/VRC眼用制劑較好的抗菌應用潛力。

與SOL/VRC組比較,**P<0.01,***P<0.001。

3 討論

真菌是造成微生物性眼部感染的重要原因之一,它們威脅視力,甚至導致不可逆轉的視力喪失,且發病率呈現不斷上升的趨勢[20]。對于真菌性角膜炎來說,念珠菌是主要病原之一。目前臨床上抗真菌藥物主要為多烯類、唑類、嘧啶類、棘白菌素類,其中唑類抗真菌藥物為主體[21]。VRC由于水溶性差、生物利用度低、副作用大等問題,在治療白色念珠菌眼部感染存在局限性。

本研究構建一種新型的基于TPGS-EL的眼用混合膠束,用于提高VRC的遞送效率和眼部白色念珠菌的治療效果。利用薄膜水化法制備的TPGS-EL納米膠束能夠有效負載VRC,且工藝簡單,具有合適的粒徑(<150 nm)、較高的載藥量與包封率等優點。同時,納米膠束還能夠快速、高效地被HCE-T細胞攝取。在治療白色念珠菌性感染時,TPGS-EL/VRC納米膠束可以有效地遞送和增強真菌部位的VRC濃度,并通過TPGS的P-糖蛋白抑制作用減少真菌的耐藥性,從而提高抗白色念珠菌的療效。本研究將VRC包封到TPGS-EL膠束中具有很高的控制念珠菌感染的潛力,并期望在克服白色念珠菌引起的眼部感染的治療等方面得到更廣泛的應用。