揚子鱷源粘質沙雷氏菌XCYZE株的分離鑒定及其致病性分析

朱 鵬,周永康,姜 紀,李佳佳,易平四,章 松,張雪松,周奎厚,王應超,石 涵,陳洪超,卜孝林,王雅婷,徐前明

粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)屬于變形菌門腸桿菌科沙雷氏菌屬,是沙雷氏菌屬中最常見的一種革蘭氏陰性菌,菌體較小、短桿狀、周生鞭毛,菌株在28 ℃下培養有玫瑰紅樣色素產生,菌落有粘性、呈中心顆粒狀、有惡臭氣味[1]。大量的臨床調查結果顯示,雖然粘質沙雷氏菌表現出相對較低的毒力,但它會引發中樞神經系統等疾病,例如腦膜炎[2]、尿路感染、肺炎、心內膜炎和其他呼吸道疾病等,尤其是在嬰兒和免疫功能低下的患者中。此外,粘質沙雷氏菌也會引起傷口和軟組織感染[3-4],發病率及死亡率高達39%～50%[5]。粘質沙雷氏菌具有侵襲性,對許多常用抗菌藥具有耐藥性,現已成為醫院感染的重要條件性致病菌,近年來臨床分離率及耐藥性都有增加的趨勢[6]。該菌除了感染人,還可以感染多種動物如白蟻[7]、山羊[8]、水貂[9]、牦牛[10]、中華鱟[11]、草金魚[12]、牙鲆[13]等。

揚子鱷是中國特有的一種鱷類動物,為國家一級保護動物,也是世界上瀕危物種之一,主要分布在長江中下游流域。由于生態環境的破壞,揚子鱷種群數量急劇下降,近年來圍繞著揚子鱷的生存環境、飼養方法、種群繁殖、人工孵化等方面報道較多,但對揚子鱷的細菌性疾病報道還很空缺。顧永熙等[14]報道,上海野生動物園在揚子鱷越冬末期,發現3條死亡鱷魚、1條病重鱷魚,通過對其解剖及分離培養,結果分離出3株沙雷氏菌,通過動物實驗,證實了該菌具有致病性,推測沙雷氏菌是此次鱷魚死亡的可能原因。唐名艷[15]通過對揚子鱷血液學及生化指標檢測及卵源細菌的分離鑒定,發現鱷魚胚胎期便有多種細菌感染。

2022年9月下旬,安徽省宣城市揚子鱷繁殖研究中心出現1條死亡幼鱷,幼鱷生前臨床表現為精神萎靡不振、食欲下降、四肢無力、活動減少、行動緩慢、頭部左右傾斜、眼神黯淡無光、腹部稍腫脹。剖檢見肝臟顯著腫大,伴有嚴重出血、膽囊腫大、腎臟明顯水腫、肺臟有多處膿性結節和壞死灶,壞死灶中央有膿汁和干酪樣物,腦組織有炎性滲出物。取腦組織病料分離培養,獲得1株分離菌,經鑒定為粘質沙雷氏菌,可為臨床防治該病提供一定借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 主要用品 ExTaq酶、dNTP、蛋白酶K、DNA DL 2000 Marker購自Takara公司;Blood DNA &Tissue kit購自QIAGEN公司;標準革蘭氏染色液購自上海源葉生物科技有限公司;普通肉湯培養基、LB液體培養基、血瓊脂平板由本實驗室提供;生理生化反應管、藥敏片購自杭州微生物試劑有限公司;SPF昆明鼠購自安徽醫科大學實驗動物中心,本實驗已通過安徽農業大學實驗動物倫理審查委員會批準,編號為AHAUB2022014。

1.2 菌株來源 1株疑似粘質沙雷氏菌分離菌由安徽省宣城市揚子鱷繁殖研究中心的1條死亡幼鱷腦組織病料中分離培養獲得。

1.3 菌株的分離培養及形態觀察 用接種環從幼鱷的腦內壞死灶中挑取炎性滲出物病料,接種于血瓊脂平板,置于37 ℃恒溫培養箱培養24 h,挑取疑似沙雷氏菌的菌落接種于普通肉湯培養基于28 ℃繼續培養18 h,觀察菌落特征。挑取單個特征性菌落,按常規革蘭氏染色法染色,鏡檢觀察細菌形態。

1.4 分離菌株的生理生化試驗 將分離并純化的典型單個菌落接種于普通瓊脂培養基,28 ℃培養18 h;在無菌條件下挑取培養的單菌落接種于各種生化鑒定管中,置于28 ℃恒溫培養箱中培養,觀察反應變化,試驗結果參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》進行比對。

1.5 分離菌株的16SrDNA基因序列的測定 取純化后的細菌培養液提取細菌DNA,細菌通用引物上下游序列分別為27-F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492-R: 5′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3′,選擇細菌通用引物及DNA模板進行16SrDNA基因序列PCR擴增,PCR產物經1%瓊脂糖核酸凝膠電泳檢測后將PCR產物送至南京擎科生物科技有限公司進行測序。測序結果用BLAST進行比對,利用MEGA-X軟件構建系統進化樹,進行同源性分析。

1.6 致病性試驗 選購5～6周齡的昆明鼠進行動物試驗。將分離菌進行小鼠致病性試驗,分為實驗組和對照組,每組5只小鼠。實驗組小鼠腹腔注射分離菌菌液0.2 mL(濃度:2×108CFU/mL),對照組小鼠腹腔注射0.2 mL普通肉湯培養基,將小鼠隔離飼養,每8 h觀察1次,記錄臨床表現。

1.7 藥物敏感性試驗 按常規法用藥敏片對分離菌做藥敏試驗。選用的藥敏片有丁胺卡那、恩諾沙星、青霉素、阿莫西林、慶大霉素、氧氟沙星和頭孢噻肟共7種常用抗菌藥物。

2 結 果

2.1 細菌的菌落形態及特征 培養結果顯示,該菌株表面隆起、光滑濕潤、邊緣整齊,為灰白色中等大小的菌落,菌落中央有紅色素(圖1)。由鏡檢結果可以看出菌株為革蘭氏陰性菌,短桿狀、大小均一,多為單個存在。見圖2。

圖1 沙雷氏菌XCYZE株的純培養菌落形態Fig.1 Morphology of pure cultured colonies of Serratia XCYZE strain

圖2 XCYZE菌株的革蘭氏染色結果 (1 000×) Fig.2 Gram stain results of Serratia XCYZE strain (1 000×)

2.2 分離菌株的生理生化試驗 分離菌株XCYZE的生理生化特征如表1所示,可產生葡萄糖、甘露醇、乳糖、檸檬酸鹽和硫化氫等,對照《伯杰氏細菌鑒定手冊》,結果與粘質沙雷氏菌相符。

表1 分離菌株XCYZE的主要生理生化指標檢測結果Tab.1 Results of major physiological and biochemical indexes of the isolated Serratia XCYZE strain

2.3 PCR擴增分離菌株16SrDNA序列結果 以分離菌株基因組DNA為模板,利用細菌16SrDNA通用引物進行PCR擴增,得到的條帶長度約為1 500 bp基因片段(圖3)。

注:M.DNA分子質量標準;1.XCYZE株的PCR擴增產物;2.空白對照。圖3 16S rDNA鑒定結果Fig.3 Identification results of 16S rDNA from the ioslated

2.4 目的菌株16SrDNA序列遺傳進化樹分析結果 測序結果見圖4,測序完成后, 將目的菌株16SrDNA序列在NCBI中進行BLAST檢索,結果顯示與Serratiamarcescensstrain GRD 1(GenBank登錄號:JN806401.1)等粘質沙雷氏菌的基因同源性達99.10%,同時用MEGA-X軟件構建系統進化樹(圖5),將本試驗從揚子鱷幼鱷中分離得到的菌株命名為XCYZE,由進化樹分析得知XCYZE株與粘質沙雷氏菌GRD1株的親緣關系較近,與已報道的粘質沙雷氏菌GRD1株(JN806401.1)在同一分支上(圖5),結合細菌形態學、生理生化結果,綜合鑒定分離菌株XCYZE為粘質沙雷氏菌,因為GRD1株分離自醫院的廢水,且與人源的粘質沙雷氏菌有一定的關系。

圖4 目的菌株測序結果Fig.4 Sequencing results of the target strain

圖5 分離菌株XCYZE的16S rDNA系統進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of 16S rDNA of the isolated Serratia strain XCYZE

2.4 致病性分析 實驗組和對照組小鼠分別腹腔注射0.2 mL的分離菌菌液和肉湯培養基后,觀察臨床表現:8 h后,實驗組小鼠開始出現精神亢奮、局促不安、亂竄現象。對照組小鼠精神狀態良好;16 h后,實驗組小鼠被毛粗亂、食欲減少,精神沉郁。對照組小鼠精神狀態和采食量均正常;36 h后,實驗組小鼠全部死亡,對照組小鼠2周后健康狀態依然良好,未見任何異常。剖檢死亡小鼠,可見腹腔大量積液、腸道黏連水腫、肝臟顯著腫大、脾臟出血(圖6)。將肝、肺切面觸片并革蘭氏染色,腹腔積液接種于肉湯培養基中進一步培養,結果表明,死亡小鼠體內分離菌確為與接種菌株相同的細菌。

注:A、B為攻毒小鼠腹腔解剖圖;C、D為攻毒小鼠肝臟圖;E、F為攻毒小鼠脾臟圖。圖6 小鼠感染沙雷氏菌XCYZE株的主要病理變化Fig.6 Main pathological changes of mice after infected with Serratia XCYZE strain

2.5 藥物敏感性分析結果 參照CLSI標準分析:粘質沙雷氏菌XCYZE株對恩諾沙星、丁胺卡那、氧氟沙星、頭孢噻肟高敏;對慶大霉素中敏;對青霉素、阿莫西林耐藥。見圖7。

圖7 XCYZE株沙雷氏菌的藥敏試驗結果Fig.7 Results of drug susceptibility testing of Serratia XCYZE strain

3 討 論

目前,關于沙雷氏菌的報道是極其有限的,人們對該菌的認知僅停留在一般生物學特性上。粘質沙雷氏菌最初被認為是無害細菌,但隨著關于其致病性報道的增多,粘質沙雷氏菌已被重新定義為重要的條件性致病菌[16]。在我國水產養殖領域,粘質沙雷氏菌也多作為無害細菌被報道,如從養殖廢水中分離后作為處理高濁度廢水的細菌[17],從鱖魚腸道分離后作為產生靈紅菌素的細菌[18]。但在揚子鱷這類瀕危珍稀爬行動物中鮮有報道,關于該病原體是否對爬行動物具有較強的致病力仍是未知的,有待于進一步探討。

本研究從1起表現腦膜腦炎的揚子鱷中成功分離培養出1株粘質沙雷氏菌,通過一系列細菌學鑒定、系統進化樹分析得知該菌株與已報道的粘質沙雷氏菌(JN806401.1)GRD1株同屬一支,且親緣關系較近,確定該菌株即為粘質沙雷氏菌,因為所分離的細菌與GRD1株接近,可能也存在感染人的風險。在致病性分析方面,利用所分離的粘質沙雷氏菌接種SPF昆明鼠,在36 h后全部死亡,死亡率達到100%,且對肝臟、肺臟和脾臟造成嚴重損傷,腹腔大量積液、腸道黏連水腫、肝臟顯著腫大伴有出血特征、肺臟嚴重出血、脾臟腫大出血;并從感染死亡小鼠肝臟再次分離到致病性沙雷氏菌,從而證實此株粘質沙雷氏菌XCYZE確為導致幼鱷死亡的高致病性病原菌。

粘質沙雷氏菌易于存活,易形成生物膜,對環境和抗生素有較強的抵抗力,對多種常用抗菌藥具有耐藥性[6],有研究表明,醫院分離株較環境分離株耐藥性更強[19]。本研究測定了揚子鱷源粘質沙雷氏菌對7種抗生素的敏感性,結果顯示該菌對青霉素、阿莫西林等臨床常用抗生素產生耐藥,對恩諾沙星、丁胺卡那、氧氟沙星、頭孢噻肟等高度敏感,不同來源粘質沙雷氏菌對不同藥物的敏感性差異,也間接表明了環境因素對菌株耐藥存在一定的影響[20],這為今后的揚子鱷養殖管理、治療提供參考。同時,粘質沙雷氏菌作為一種有較高致病性的人獸共患病原菌,理應受到相關部門更多重視。

利益沖突：無